JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Total diz artroplastisinden sonra hastalardan elde edilen primer dokular, osteoartrit araştırmaları için maksimal klinik çevrililebilirlik ile deneysel bir model sağlar. Bu protokol, insan osteoartritinde mekanistik araştırmayı desteklemek için RNA'nın yedi benzersiz diz dokusundan nasıl tanımlanıp işlenerek izole edilip izole edilecek anlatmaktadır.

Özet

Osteoartrit (OA) en sık dizi etkileyen kronik ve dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Şu anda tedavisi olmadığı için total diz artroplasti (TKA) yaygın bir cerrahi müdahaledir. TKA'dan elde edilen birincil insan OA dokularını kullanan deneyler, ex vivohastalık mekanizmalarını araştırma yeteneği sağlar. OA'nın daha önce esas olarak kıkırdağı etkilediği düşünülse de, şimdi eklemdeki birden fazla dokuyu etkilediği bilinmektedir. Bu protokol, diz ekleminde hastalık mekanizması araştırmasını desteklemek için yedi benzersiz dokunun her birinden hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolünü (RNA saflığına, bütünlüğüne ve verimine göre) açıklar. Bilgilendirilmiş onam ile OA için TKA uygulanan hastalardan örnekler alındı. Dokular, RNA için flaş dondurma veya histoloji için formalin fiksasyonu ile ameliyattan sonraki 4 saat içinde parçalandı, yıkandı ve depolandı. Toplanan dokular arasında eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas vardı. Her doku tipi için RNA ekstraksiyon protokolleri test edildi. En önemli değişiklik, düşük hücreli, yüksek matrisli, sert dokular (kıkırdak, kemik ve menisküs olarak kabul edilir) ile nispeten yüksek hücreli, düşük matrisli, yumuşak dokular (yağ pedi, bağ, sinovyum ve kas olarak kabul edilir) için kullanılan parçalanma yöntemini içeriyordu. Pulverizasyonun sert dokular için, homojenizasyonun ise yumuşak dokular için uygun olduğu bulunmuştur. Bazı deneklerin birden fazla dokuda sürekli olarak diğer deneklere göre daha yüksek RNA bütünlük sayısı (RIN) değerleri verme eğilimi gözlendi ve bu da hastalık şiddeti gibi altta kalan faktörlerin RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürdü. Birincil insan OA dokularından yüksek kaliteli RNA'yı izole etme yeteneği, sıralama da dahil olmak üzere sofistike gen ekspresyon deneyleri için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar ve bu da hastalara daha kolay çevrilen klinik içgörülere yol açabilir.

Giriş

Diz, kaval kemiği ve uyluk kemiği arasındaki tibiofemoral eklemi ve patella ile uyluk kemiği arasındaki patellofemoral eklemi içeren insan vücudundaki en büyük sinovyal eklemdir1. Dizdeki kemikler eklem kıkırdağı ile kaplıdır ve menisküs, yağ, bağlar ve kas dahil olmak üzere çeşitli bağ dokuları tarafından desteklenir ve sinovyal bir membran, sinovyal sıvı dolu bir boşluk oluşturmak için tüm eklemi kapsüller1,2,3 ( Şekil1). Sağlıklı bir diz, ön düzlemde sürtünmesiz harekete izin veren mobil menteşe eklemi olarak işlev alır1,3. Patolojik koşullar altında hareket kısıtlanabilir ve ağrılı hale gelebilir. En sık görülen dejeneratif diz eklemi hastalığı osteoartrittir (OA)4. İleri yaş, obezite, kadın cinsiyeti, eklem travması ve genetik dahil olmak üzere OA gelişimine yatkın olan çeşitli risk faktörleri bilinmektedir, diğerleriarasında 5,6. Şu anda ABD'de semptomatik diz OA'sı olan tahmini 14 milyon kişi vardır, artan nüfus yaşı ve obezite oranları nedeniyle prevalans artmaktadır7,8. Başlangıçta kıkırdak hastalığı olarak kabul edilen OA, şimdi tüm eklemin bir hastalığı olarak anlaşılmaktadır9. OA'da yaygın olarak gözlenen patolojik değişiklikler eklem kıkırdak erozyonu, osteofit oluşumu, subkondral kemik kalınlaşması ve sinovyum iltihabı9,10'dur. OA için bilinen bir tedavi olmadığından, tedaviler öncelikle semptom (örneğin, ağrı) yönetimi11,12'ye odaklanır ve OA son aşamaya ilerledikten sonra, eklem protezi ameliyatı genellikle13olarak belirtilir.

Eklem protezi ameliyatları, tüm tibiofemoral eklem ve patellofemoral eklemin değiştirilmesi de dahil olmak üzere total diz artroplasti (TKA) ile kısmi veya total diz protezleri olabilir. 2020 yılı itibariyle ABD'de her yıl yaklaşık 1 milyon TKA yapılmaktadır14. TKA sırasında, bir ortopedi cerrahı tibial platonun üst kısmını ve alt femoral kondilenleri (Şekil 2A, 2B) protez implantlarla donatılmak üzere resects. Bazen hastalar tarafından yanlış yorumlanır, bir TKA'da, her kemiğin ucundan sadece 8-10 mm resected, daha sonra kaplanır veya yeniden ortaya çıkar, metal ile. Birbirine ketilosen astar, iki metal implant arasındaki yatak yüzeyini (yani dolguyu) oluşturur. Ek olarak, eklemin birkaç yumuşak doku bileşeni, uygun eklem dengesini sağlamak için tamamen veya kısmen eksilir. Bu dokular arasında medial ve lateral menisküs (Şekil 2C), infrapateller yağ pedi (Şekil 2D), ön çapraz bağ (ACL; Şekil 2E), sinovyum (Şekil 2F) ve vastus medialis eğik kas (VMO; Şekil 2G) 15. TNA'lar genellikle OA tedavisi için başarılı olsa da, hastaların yaklaşık% 20'si ameliyat sonrası ağrının tekrarını bildirmektedir16. Prosedürün yüksek maliyeti ve göreceli istilacılığının yanı sıra, bu sınırlamalar OA'nın ilerlemesini azaltmak için alternatif tedavileri belirlemek için daha fazla araştırma ihtiyacına işaret etmektedir.

OA'da terapötik müdahale için yeni yollar sunabilecek hastalık mekanizmalarını araştırmak için hücreler, doku eksplantları ve hayvan modelleri de dahil olmak üzere deneysel sistemler kullanılabilir. Hücreler tipik olarak monolayer olarak kültürlenir ve birincil insan veya hayvan dokularından (örneğin, kıkırdaktan izole edilmiş kondrositler) veya ölümsüzleştirilmiş hücrelerden (örneğin, ATDC517 ve CHON-001 18)türetilir. Hücreler kontrollü bir kültür ortamında deneysel değişkenleri manipüle etmek için yararlı olsa da, hücre fenotiplerini etkilediği bilinen doğal eklem koşullarını yakalamaz19. OA'nın altında bulunan kimyasal, mekanik ve hücreden hücreye iletişimin karmaşık basamaklarını daha iyi özetlemek için, birincil insan veya hayvan doku örneklerinde, taze veya kültürlü eks vivo eksplant olarak kullanılsın, doku yapısını ve hücre mikroçevrimini korumak için bir alternatif bulunur20. Eklem in vivoincelemek için, küçük (örneğin, fare21)ve OA için büyük (örneğin, at22)hayvan modelleri (örneğin, cerrahi indüksiyon, genetik değişiklik veya yaşlanma yoluyla) da yararlıdır. Bununla birlikte, bu modellerden insan hastalığına çeviri anatomik, fizyolojik ve metabolik farklılıklarla sınırlanabilir, diğerleri arasında23. Deneysel sistemlerin avantajları ve dezavantajları göz önüne alındığında, türlere özgü olmanın ve birincil insan OA dokularının sunduğu hücre dışı nişi korumanın temel güçlü yanları, araştırma bulgularının çeviri potansiyelini en üst düzeye çıkarır.

Birincil insan OA dokuları TKA'yı takiben kolayca elde edilebilir ve bu da TKA'ların yüksek sıklığını araştırma için değerli bir kaynak haline getirir. Potansiyel deneysel uygulamalar arasında gen ekspresyolojisi ve histolojik analizler bulunmaktadır. Birincil insan OA dokularının bu araştırma yaklaşımları ve diğerleri için potansiyelini gerçekleştirmek için, özetlenen aşağıdaki temel hususlardır. İlk olarak, hasta örneklerinin kullanımı etik düzenlemeye tabidir ve protokollerin Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylarını karşılaması gerekir24. İkincisi, insan primer hastalıklı dokuların doğasında var olan heterojenlik ve yaş ve cinsiyet gibi değişkenlerin etkisi, diğerlerinin yanı sıra, dikkatli hasta seçimi (yani uygunluk kriterlerinin uygulanması) ve veri yorumlama ihtiyacını yaratır. Üçüncüsü, eklemdeki farklı dokuların benzersiz biyolojik özellikleri (örneğin, kıkırdak ve menisküs25'indüşük hücreselliği) deneyler sırasında zorluklara neden olabilir (örneğin, yüksek kalite ve RNA miktarını izole etmek). Bu rapor bu hususları ele alıyor ve hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrol (yani RNA saflığının ve bütünlüğünün değerlendirilmesi) için bir protokol sunuyor; Şekil 3) araştırma topluluğunda birincil insan OA dokularının kullanımını teşvik etmek.

Protokol

Bu çalışma protokolü Henry Ford Sağlık Sistemi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #13995) tarafından onaylanmış ve kurumsal yönergelere uyulmuştır.

1. Hasta seçimi

  1. Ortopedi cerrahı ile TKA'ya girmesi planlananlar arasından hastaları tanımlayın.
  2. Hastaları çalışma protokolü tarafından tanımlanan uygunluk kriterlerine göre seçin. İnklüzyon kriterlerine örnek olarak 18 yaş ve üstü olmak ve diz osteoartritinin doğrulanmış tanısının olması verilebilir. Dışlama kriterlerine örnek olarak kısmi diz protezi yaptırmak veya romatoid artrit tanısı konmuş olmak verilebilir.
  3. Ameliyattan önce bilgilendirilmiş onay almak için hasta ile iletişime geçin.

2. Örnek işleme (RNA için)

NOT: Tüm doku işlemlerini sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin ve steril teknikleri izleyin. İnsan örneklerini işlerken her zaman uygun KKD (nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri) giyin. TKA sırasında çeşitli kemik parçaları üretilir, diseksiyon için potansiyel olarak çok miktarda kemik / kıkırdak kullanılabilir. Hastalığın ilerlemesi nedeniyle, eklem kıkırdak dejenerasyonu bazı kemik kısımlarında daha şiddetli olabilir ve bu da deneysel tasarıma dahil edilebilir. Sadece elektrokoterden rezeksiyon için zorunlu olan dokularda termal kenar hasarı vardır ve hasarı en aza indirmek için çoğu dokuyu neşterle temin etmek için eş zamanlı bir cerrahi çaba sarf edilir. Resected dokular steril PBS ile her zaman nemli tutulmalıdır.

  1. Tüm çalışma yüzeylerini ve ekipmanlarını% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve yine% 70 etanol ile dezenfekte edin. Kalan sıvıyı temiz, tüy bırakmayan dokularla silin. Forsepsler, kemik kesiciler ve neşterler, kullanımdan önce en az 10 dakika boyunca otomatik olarak kapatılır veya% 70 etanol içine batırılır. Ekipmanı hemen kullanılmadığında% 70 etanolde su altında tutun.
  2. Her doku için de-tanımlı örnek adı ve aliquot numarası ile en az üç cryovial ön etiket (örneğin, TKA-1 Kıkırdak 1).
    1. Şekil 2'degösterildiği ve açıklandığı gibi boyut, şekil, renk ve doku farklılıklarına göre numuneden her doku tipini tanımlayın. Kıkırdak (Şekil 2A oku), kemik (Şekil 2B ok), menisküs (Şekil 2C), infrapateller yağ pedi (Şekil 2D), ön çapraz bağ (Şekil 2E), sinovyum (Şekil 2F) ve vastus medialis eğik kas (Şekil 2G) tanımlayın.
  3. Eklem kıkırdaklarını izole edin.
    1. Minimum kıkırdak bozulması olan bir kemik kısmı seçin.
    2. 10 numaralı neşter kullanarak, kıkırdak tabakasının tam kalınlığını kesmek için kıkırdak derinliğini mümkün olduğunca kesin.
      NOT: 10 numara neşter sadece kıkırdaklara nüfuz eder, kemiğe değil.
    3. Kıkırdağın tam kalınlığını kullanarak, üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  4. Subkondral kemiği izole et.
    1. Kıkırdak toplanan kemik bölümünü kullanın.
    2. 10 numaralı neşter kullanarak, kalan kıkırdak ve artık dokuları kemik yüzeyinden kazıyın.
    3. Kemik kısmını tokalarla kesilecek şekilde tutun ve kemik kesicileri kullanarak üç 5 mm küp kesin.
  5. Menisküsleri izole et.
    1. Medial veya lateral menisküslerin nispeten hasarsız bir kısmını tanımlayın.
    2. 10 numaralı neşter ve önseçim kullanarak üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  6. Infrapateller yağ yastığını izole edin.
    1. No.10 neşter ve asalar kullanarak, dokunun sarı kısmını üç eşit büyüklükte ve homojen porsiyonda (her biri ~ 500 mg) kesin.
  7. Ön çapraz bağı (ACL) izole edin.
    1. 10 numaralı neşter ve önseçim kullanarak üç adet 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
  8. Sinovumu izole et.
    1. 10 numara neşter ve toslar kullanarak, yağ dokusunu kazıyarak zarın pembe hücresel kısmını mümkün olduğunca izole edin.
    2. Üç eşit büyüklükte ve homojen porsiyon (her biri ~ 200 mg) diseksiyon.
  9. Vastus medialis eğik kasını (VMO) izole edin.
    1. 10 numaralı neşter ve tostips kullanarak, numuneden herhangi bir yağ dokusunu çıkarın ve sadece kırmızı kas dokusunu bırakın.
    2. Üç 5 mm küpü parçalara ayrıştırın.
      NOT: Dokunun başlangıç boyutu porsiyonların boyutunu sınırlar.
  10. Herhangi bir kalıntı veya döküntük gidermek için doku kısımlarını steril PBS ile durulayın.
  11. Histoloji yapmak için, Bölüm 3'teaçıklandığı gibi her doku kısmını sabitle.
  12. RNA ekstraksiyonu yapmak için, üç doku kısmının her birini daha küçük parçalara (~1-2 mm   küpler) kesin.
    1. Küçük parçaları 2 mL cryovial, güvenli kapaklara sıkıca aktarın, 30 s sıvı nitrojene batırarak flaş dondurma ve ardından uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucuya aktarın (mevcut protokolde test edilen 4 aya kadar). Tüm dokuların tüm aliquots için bunu tekrarlayın.
    2. Bölüm 4'teaçıklandığı gibi Doku homojenizasyonuna devam edin.

3. Örnek işleme (histoloji için)

DİkKAT: Formalin tehlikeli bir kimyasaldır, sadece kimyasal duman kaputunda kullanılır.

  1. Önceden etiketlenmiş 15 mL konik tüpleri % 10 formalin çözeltisi ile doldurun.
  2. Tokmak kullanarak doku bölümünü formalin dolu tüplere aktarın.
  3. Mümkünse sallarken / çalkalarken dokuları oda sıcaklığında 1 hafta formalin içinde sabitlayın.
  4. 1 hafta sonra, formalini uygun kimyasal atık bertarafına atın, dokuları PBS ile durulayın ve numuneler bölümleme için gömülene kadar 4 ° C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içeren taze bir 15 mL konik tüpe aktarın.
    NOT: Sadece kemik/kıkırdak için kireç çözme işlemi aşağıdaki gibi yapın.
  5. 1 hafta sonra, formalini uygun kimyasal atık bertarafına atın ve dokuları PBS ile durulayın.
  6. Dokuyu 45 mL%10 EDTA çözeltisi (pH 7.4) içeren 50 mL konik bir tüpe aktarın.
  7. Sallama/ ajitasyon mümkün değilse, tüpleri günde bir kez 10-15 kez ters çevirin.
  8. EDTA çözümünü haftada bir kez atın ve değiştirin.
    1. Haftada iki kez, basınç uygulandığında deformasyon gözlemleyerek kireçlenmeyi doğrulamak için dokuyu bir aletle (örneğin spatula) veya eldivenli parmakla test edin. Kemik dokusunu kireçten arındırmak için gereken süre 4-6 hafta arasında örnekler arasında değişecektir.
  9. Kireçten arındırdıktan sonra, dokuyu PBS ile durulayın ve numuneler bölümleme için gömülene kadar 4 °C'de uzun süreli depolama için% 70 etanol içeren taze bir 15 mL konik tüpe aktarın.

4. Doku homojenizasyonu

DİkKAT: Protokolde tehlikeli kimyasal fenol unun kullanımına dikkat edilir. Fenol ile çalışma kimyasal duman kaputunda yapılmalıdır.

NOT: % 70 etanol ile kullanılacak tüm ekipman ve yüzeyleri iyice temizleyin (en az 10 dakika ıslatın), ardından RNase dekontaminant (en az 10 dakika ıslatın), DEPC ile arıtılmış suyla durulayın, temiz, tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile silin ve ardından% 70 etanol ile respray veya ıslatın.

  1. Sert doku homojenizasyonu (eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs)
    1. Homojenizasyondan önce, sıvı nitrojen kullanarak harcı, pestleyi ve spatulayı soğutun. Numune erimesini önlemek için bunlar mümkün olduğunca soğuk tutulmalıdır.
    2. Numuneleri teker teker işleyin, diğer numuneleri kullanılana kadar -80 °C'de tutun.
    3. Doku örneğini soğutulmuş bir spatula kullanarak harçlara aktarın; dokunun üzerine ek sıvı azot dökün ve buharlaşmasını bırakın. Pestle kullanarak dokuyu ezin. Doku örneğine tekrar tekrar daha fazla sıvı azot ekleyin, buharlaşmasına izin verin ve ardından ince bir toz yapmak için pestle ile taşlamaya devam edin.
    4. Dokuyu mümkün olduğunca toz haline getirtikten sonra, önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
      1. Doku transferden önce 30 sn sıvı nitrojene batırılarak ön soğutma tüpleri.
    5. Her tüpe 1 mL asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin ve buzda tutun.
    6. Her sert doku örneği için 4.1.3-4.1.5 adımlarını yineleyin.
    7. Her dokudan sonra, harç, pestle ve spatulayı% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve% 70 etanolde ilave bir ıslatma ile temizleyin. Kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir dokuyla silin.
    8. Örnekleri 20 dakika daha buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  2. Yumuşak doku homojenizasyonu (infrapateller yağ pedi, ACL, sinovyum, VMO)
    1. Homojenizatörü% 70 etanol, RNaz dekontaminant, DEPC ile arıtılmış su ve her biri 30 s için ek% 70 etanol yıkama tüpleri çalıştırarak dezenfekte edin. Kalan sıvıları temiz, tüy bırakmayan bir dokuyla silin. Bunu her örnek arasında tekrarlayın.
    2. Her numune için 5 mL yuvarlak alt tüpler ön etiket. Her tüpe 1 mL asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin.
      1. Her seferinde bir örnek üzerinde çalışın, diğer numunelerin kullanıma kadar -80 °C'de işlenmesini sağlar.
    3. Dokuyu asit-guanidinium-fenol ile önceden etiketlenmiş 5 mL tüpe aktarın.
    4. Dokuları 30 s darbeyle homojenize edin, darbeler sırasında ve arasında buzda tutun. Doku görsel olarak çözülene kadar veya en fazla beş 30 s darbe için tekrarlayın.
      NOT: Bazı lifli dokular (yani kas) iyice homojenize olmayabilir.
    5. Çözünmüş dokuyu buzda kuluçkaya yatır ve bir sonraki örneğe geç.
      1. Homojenizatörleri adım 4.2.1'de açıklandığı gibi temizleyin. Doku parçalarının probun dişlerinde kalmadığından emin olun; gerekirse steril asalarla çıkarın.
    6. Tüm örneklerin homojenizasyonu yapıldıktan sonra, ek 20 dakika boyunca asit-guanidinium-fenolde buz üzerinde kuluçkaya yatın.
    7. Numuneleri yuvarlak alt tüplerden önceden etiketlenmiş ve önceden soğutulmuş 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.

5. Dokulardan RNA ekstraksiyonu

DİkKAT: Bu protokol fenol, kloroform ve izopropanol gibi tehlikeli kimyasallar kullanır. Tüm işi kimyasal duman kaputunda gerçekleştirin.

NOT: Ekipman ve reaktifler sadece RNA çalışmaları için ayrılmıştır ve moleküler uygulamalar için uygun kimyasal sınıfa sahip olmalıdır (yani steril, nükleaz içermemelidir). Bu protokol hem Parts 4.1 hem de 4.2 doku homojenizasyon protokollerinin başarılı olur. % 70 etanol (en az 10 dakika ıslatın) ve ardından RNase dekontaminant (en az 10 dakika ıslatın) ile kullanılacak tüm ekipman ve yüzeyleri iyice temizleyin. DEPC ile arıtılmış su ile durulayın, kalan sıvıyı temiz, tüy bırakmayan bir kağıt havlu ile silin ve ardından% 70 etanol ile respray veya ıslatın.

  1. Enkazı peletmek için 10000 x g'daki mikrosantrifüj tüplerini 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
  2. Süpernatantı taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Yağ dokuları için bazen üstte bir lipit tabakası bulunur. Borunun yan tarafındaki tabakayı pipet ucuyla delerek bunu aktarmaktan kaçının.
  3. Her numuneye asit-guanidinium-fenol çözeltisinin 1 mL'si başına 200 μL kloroform ekleyin. 30 s karıştırmak için tüpleri kuvvetlice elle çalkalayın. Ardından, 2 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
  4. 4 °C'de 12 dakika boyunca 10000 x g'da santrifüj örnekleri.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra üç katman oluşmuş olacaktır: RNA içeren sulu bir faz, beyaz bir DNA ara fazı ve altta pembe bir protein fazı.
  5. Üst, sulu fazın ~500 μL'lik kısmını taze 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Ara fazı ve protein fraksiyonlarını bozmayın. Gelecekteki DNA veya protein izolasyonu için bu aşamaları -80 °C'de saklayın.
  6. Aktarılan sulu faza eşit miktarda asit-guanidinium-fenol çözeltisi ekleyin, tüpü 8-10 kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü 20 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır.
  7. Her numuneye asit-guanidinium-fenol çözeltisinin 1 mL'si başına 200 μL kloroform ekleyin. Karıştırmak için 30 sn boyunca elle kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
  8. 4 °C'de 12 dakika boyunca 10000 x g'da santrifüj örnekleri.
  9. Sulu fazın <500 μL'yi taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, numuneyi diğer aşamalarla kirletmemeye dikkat edin.
    DİkKAT: Kalan aşamaları uygun tehlikeli madde bertaraf yöntemleriyle atın.
  10. Her numuneye % 100 izopropanol eşit hacim (sulu faz olarak) ekleyin. Tüpü 8-10 kez ters çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yaslanın.
    1. Santrifüj sonrası RNA peletinin bulunmasına yardımcı olmak için her numuneye 1 μL glikojen koprecipitant ekleyin.
  11. Numuneleri 12000 x g'da 4 °C'de 25 dakika santrifüj edin.
  12. Peleti tüpte bulun (coprecipitant kullanıyorsanız, mavi görünecektir). Süpernatant dikkatlice dökün.
  13. Her numuneye 1 mL buz gibi% 75 etanol ekleyerek peletin yıkanması, peletin tüpün dibinden yerinden sökülmek için girdap.
    NOT: Moleküler sınıf saf etanol ve nükleaz içermeyen su kullanarak % 75 etanol hazırlayın.
  14. 4 °C'de 5 dakika boyunca 7000 x g'da santrifüj. Süpernatant dikkatlice dökün.
  15. 5.13 ve 5.14 adımlarını iki kez daha yineleyin.
  16. Tüpün dibine herhangi bir artık sıvı getirmek için hızlı dönüş (5 s için <2000 x g). Tüplerin altındaki artık etanolleri çıkarmak için bir P20 pipet kullanın.
    1. RNA peletini pipet ucuyla dokunmaktan kaçının. Örnekler arasındaki ipuçlarını değiştirin.
  17. Tüp kapakları açıkken, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava kuru örnekleri.
    NOT: Pelet kurudukça yarı saydam hale gelebilir. Tüm artık etanollerin buharlaşmasını sağlamak RNA saflığını artıracaktır.
  18. Peletin çözülmesi için her tüpe 25 μL çekirdeksiz su ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
  20. RNA'yı karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet.
  21. Numunenin Aliquot 5 μL'si kalite kontrol analizi için taze bir tüpe (Bölüm 6). Gen ekspresyözü tahlilleri için kalan 20 μL'yi -80 °C'de saklayın.

6. Kalite kontrolü

  1. Üreticinin talimatlarına göre bir spektrofotometre kullanarak RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin.
  2. Üreticinin talimatlarına göre bir elektroforezi cihazı kullanarak RNA bütünlüğünü belirleyin.
    NOT: RNA'yı talaş algılama sınırları aralığında olacak şekilde seyreltin.

Sonuçlar

OA için TKA uygulanan hastalardan tahsil için yedi benzersiz insan diz eklem dokusu mevcuttur (Şekil 1). Bu protokolde, bu dokuların her biri cerrahi olarak çıkarılmasından 4 saat sonra tespit edilmiş ve işlenmiştir (Şekil 2). Şekil 3'tebelirtilen adımların ardından, her dokunun bazı kısımları histolojik değerlendirme için formalin-sabitlenmiştir (Şekil 4), diğer bölümleri ise...

Tartışmalar

Sunulan protokol RNA ekstraksiyonu (Tablo 1) ve histolojik işleme için yedi birincil insan OA dokusunun toplanmasında başarılı olmuştur (Şekil 4). Hasta örneklerini toplamadan önce, ideal olarak bir cerrah veya cerrahi ekiple işbirliği içinde IRB onaylı bir protokol oluşturmak gerekir. Numune toplama için standartlaştırılmış bir protokol uygulamak (örneğin, tutarlı yerinde konumlardan rezeksiyon) deneysel tekrarlanabilirliği en üst düzeye ...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazarlar, bu araştırmayı mümkün kılan çalışma katılımcılarına teşekkür ediyor ve bu raporu osteoartrit alanındaki yeni bilim insanlarına ithaf ediyor.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf05 402Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificICN19400290Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificBP2818500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificAC327272500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent AlcoholCardinal HealthC4305Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishesThermo Scientific12-556-003Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific14 959 53ASterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)Fisher Scientific10 500 26Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubesCorning352052Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific12 565 271Sterile, nuclease-free.
BioanalyzerAgilentG2939BAFor RNA integrity measurement.
Biosafety CabinetGeneral lab equipment
Bone CuttersFisher Scientific08 990Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume HoodGeneral lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)Thermo Scientific3120032Sterile, nuclease-free.
EDTALife Technologies15-576-02810% solution with dH2O.
ForcepsAny vendorSterilized with 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Liquid NitrogenAny vendor
Liquid Nitrogen DewarGeneral lab equipment
Mortar and PestleAny vendorReserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND-2000For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated waterFisher ScientificSterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)Gibco20 012 050Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tipsAny vendorSterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kitQiagen217204
Refrigerated Centrifuge 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size)Any vendorReserved for RNA work only.
Tissue homogenizerPro Scientific01-01200Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol ReagentFisher Scientific15 596 026Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

Referanslar

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  27. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  28. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  29. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  30. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  31. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  32. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  33. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  34. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  35. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  36. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  37. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  38. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır