İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu

Özet

Total diz artroplastisinden sonra hastalardan elde edilen primer dokular, osteoartrit araştırmaları için maksimal klinik çevrililebilirlik ile deneysel bir model sağlar. Bu protokol, insan osteoartritinde mekanistik araştırmayı desteklemek için RNA'nın yedi benzersiz diz dokusundan nasıl tanımlanıp işlenerek izole edilip izole edilecek anlatmaktadır.

Özet

Osteoartrit (OA) en sık dizi etkileyen kronik ve dejeneratif bir eklem hastalığıdır. Şu anda tedavisi olmadığı için total diz artroplasti (TKA) yaygın bir cerrahi müdahaledir. TKA'dan elde edilen birincil insan OA dokularını kullanan deneyler, ex vivohastalık mekanizmalarını araştırma yeteneği sağlar. OA'nın daha önce esas olarak kıkırdağı etkilediği düşünülse de, şimdi eklemdeki birden fazla dokuyu etkilediği bilinmektedir. Bu protokol, diz ekleminde hastalık mekanizması araştırmasını desteklemek için yedi benzersiz dokunun her birinden hasta seçimi, numune işleme, doku homojenizasyonu, RNA ekstraksiyonu ve kalite kontrolünü (RNA saflığına, bütünlüğüne ve verimine göre) açıklar. Bilgilendirilmiş onam ile OA için TKA uygulanan hastalardan örnekler alındı. Dokular, RNA için flaş dondurma veya histoloji için formalin fiksasyonu ile ameliyattan sonraki 4 saat içinde parçalandı, yıkandı ve depolandı. Toplanan dokular arasında eklem kıkırdağı, subkondral kemik, menisküs, infrapateller yağ pedi, ön çapraz bağ, sinovyum ve vastus medialis eğik kas vardı. Her doku tipi için RNA ekstraksiyon protokolleri test edildi. En önemli değişiklik, düşük hücreli, yüksek matrisli, sert dokular (kıkırdak, kemik ve menisküs olarak kabul edilir) ile nispeten yüksek hücreli, düşük matrisli, yumuşak dokular (yağ pedi, bağ, sinovyum ve kas olarak kabul edilir) için kullanılan parçalanma yöntemini içeriyordu. Pulverizasyonun sert dokular için, homojenizasyonun ise yumuşak dokular için uygun olduğu bulunmuştur. Bazı deneklerin birden fazla dokuda sürekli olarak diğer deneklere göre daha yüksek RNA bütünlük sayısı (RIN) değerleri verme eğilimi gözlendi ve bu da hastalık şiddeti gibi altta kalan faktörlerin RNA kalitesini etkileyebileceğini düşündürdü. Birincil insan OA dokularından yüksek kaliteli RNA'yı izole etme yeteneği, sıralama da dahil olmak üzere sofistike gen ekspresyon deneyleri için fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar ve bu da hastalara daha kolay çevrilen klinik içgörülere yol açabilir.

Giriş

Diz, kaval kemiği ve uyluk kemiği arasındaki tibiofemoral eklemi ve patella ile uyluk kemiği arasındaki patellofemoral eklemi içeren insan vücudundaki en büyük sinovyal eklemdir^1. Dizdeki kemikler eklem kıkırdağı ile kaplıdır ve menisküs, yağ, bağlar ve kas dahil olmak üzere çeşitli bağ dokuları tarafından desteklenir ve sinovyal bir membran, sinovyal sıvı dolu bir boşluk oluşturmak için tüm eklemi kapsüller^1,2,3 ( Şekil1). Sağlıklı bir diz, ön düzlemde sürtünmesiz harekete izin veren mobil menteşe eklemi olarak işlev alır....

Protokol

Bu çalışma protokolü Henry Ford Sağlık Sistemi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB #13995) tarafından onaylanmış ve kurumsal yönergelere uyulmuştır.

1. Hasta seçimi

1. Ortopedi cerrahı ile TKA'ya girmesi planlananlar arasından hastaları tanımlayın.
2. Hastaları çalışma protokolü tarafından tanımlanan uygunluk kriterlerine göre seçin. İnklüzyon kriterlerine örnek olarak 18 yaş ve üstü olmak ve diz osteoartritinin doğrulanmış tanısının olması verilebilir. Dışlama kriterlerine örnek olarak kısmi diz protezi yaptırmak veya romatoid artrit tanısı konmuş olmak verilebilir.
3. Ameliyattan önce bilgilendirilmiş onay almak için hasta ....

Sonuçlar

OA için TKA uygulanan hastalardan tahsil için yedi benzersiz insan diz eklem dokusu mevcuttur (Şekil 1). Bu protokolde, bu dokuların her biri cerrahi olarak çıkarılmasından 4 saat sonra tespit edilmiş ve işlenmiştir (Şekil 2). Şekil 3'tebelirtilen adımların ardından, her dokunun bazı kısımları histolojik değerlendirme için formalin-sabitlenmiştir (Şekil 4), diğer bölümleri ise.......

Tartışmalar

Sunulan protokol RNA ekstraksiyonu (Tablo 1) ve histolojik işleme için yedi birincil insan OA dokusunun toplanmasında başarılı olmuştur (Şekil 4). Hasta örneklerini toplamadan önce, ideal olarak bir cerrah veya cerrahi ekiple işbirliği içinde IRB onaylı bir protokol oluşturmak gerekir. Numune toplama için standartlaştırılmış bir protokol uygulamak (örneğin, tutarlı yerinde konumlardan rezeksiyon) deneysel tekrarlanabilirliği en üst düzeye .......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.