Recolección de tejidos y extracción de ARN de la articulación de la rodilla osteoartrítica humana

Resumen

Los tejidos primarios obtenidos de pacientes después de la artroplastia total de rodilla proporcionan un modelo experimental para la investigación de la osteoartritis con la máxima traducibilidad clínica. Este protocolo describe cómo identificar, procesar y aislar el ARN de siete tejidos únicos de la rodilla para apoyar la investigación mecanicista en la osteoartritis humana.

Resumen

La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular crónica y degenerativa que afecta con mayor frecuencia a la rodilla. Como actualmente no hay cura, la artroplastia total de rodilla (ATC) es una intervención quirúrgica común. Los experimentos con tejidos primarios de OA humana obtenidos de TKA proporcionan la capacidad de investigar los mecanismos de la enfermedad ex vivo. Si bien anteriormente se pensaba que la OA afectaba principalmente al cartílago, ahora se sabe que afecta a múltiples tejidos de la articulación. Este protocolo describe la selección del paciente, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (basado en la pureza, integridad y rendimiento del ARN) de cada uno de los siete tejidos únicos para apoyar la investigación del mecanismo de la enfermedad en la articulación de la rodilla. Con consentimiento informado, se obtuvieron muestras de pacientes sometidos a ATC para OA. Los tejidos se diseccionaron, lavaron y almacenaron dentro de las 4 h posteriores a la cirugía mediante congelación instantánea para la fijación de ARN o formalina para histología. Los tejidos recolectados incluyeron cartílago articular, hueso subcondral, menisco, almohadilla de grasa infrapatelar, ligamento cruzado anterior, sinovial y músculo oblicuo vasto medialis. Se probaron protocolos de extracción de ARN para cada tipo de tejido. La modificación más significativa involucró el método de desintegración utilizado para tejidos duros de células bajas, de matriz alta (considerados como cartílago, hueso y menisco) versus tejidos blandos de células relativamente altas, de matriz baja (considerados como almohadilla de grasa, ligamento, sinovial y músculo). Se encontró que la pulverización era apropiada para los tejidos duros, y la homogeneización era apropiada para los tejidos blandos. Se observó una proclividad de algunos sujetos a producir valores de número de integridad de ARN (RIN) más altos que otros sujetos consistentemente en múltiples tejidos, lo que sugiere que factores subyacentes como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN. La capacidad de aislar ARN de alta calidad de tejidos primarios de OA humana proporciona un modelo fisiológicamente relevante para experimentos sofisticados de expresión génica, incluida la secuenciación, que pueden conducir a conocimientos clínicos que se traducen más fácilmente a los pacientes.

Introducción

La rodilla es la articulación sinovial más grande del cuerpo humano, que comprende la articulación tibiofemoral entre la tibia y el fémur y la articulación patelofemoral entre la rótula y el fémur¹. Los huesos de la rodilla están revestidos con cartílago articular y soportados por varios tejidos conectivos, incluidos meniscos, grasa, ligamentos y músculos, y una membrana sinovial encapsula toda la articulación para crear una cavidad llena de líquido sinovial^1,2,3 (Figura 1). Una rodilla sana funciona como una articulación de bisagra móvil que permite un movimiento sin fricción en el plano frontal^1,3. En condiciones patológicas, el movimiento puede volverse restringido y doloroso. La enfermedad degenerativa de la articulación de la rodilla más común es la osteoartritis (OA)⁴. Se sabe que una variedad de factores de riesgo predisponen al desarrollo de OA, incluida la edad avanzada, la obesidad, el sexo femenino, el trauma articular y la genética, entre otros^5,6. Actualmente se estima que hay 14 millones de personas en los Estados Unidos con OA de rodilla sintomática, con la prevalencia aumentando debido al aumento de la edad de la población y las tasas de obesidad^7,8. Inicialmente considerada como una enfermedad del cartílago, la OA ahora se entiende como una enfermedad de toda la articulación⁹. Los cambios patológicos comúnmente observados en la OA incluyen erosión del cartílago articular, formación de osteofitos, engrosamiento óseo subcondral e inflamación de la membrana sinovial^9,10. Dado que no existe una cura conocida para la OA, los tratamientos se centran principalmente en el manejo de los síntomas (por ejemplo, dolor)^11,12, y una vez que la OA ha progresado a la etapa final, la cirugía de reemplazo articular a menudo está indicada¹³.

Las cirugías de reemplazo articular pueden ser reemplazos parciales o totales de rodilla, con artroplastia total de rodilla (TKA) que incluye el reemplazo de toda la articulación tibiofemoral y la articulación patelofemoral. A partir de 2020, aproximadamente 1 millón de TKAs se realizan en los EE.UU. cada año¹⁴. Durante la TKA, un cirujano ortopédico resecta la parte superior de la meseta tibial y los cóndilos femorales inferiores(Figura 2A,2B)para ser equipado con implantes protésicos. A veces malinterpretado por los pacientes, en un TKA, solo se resejan 8-10 mm del extremo de cada hueso, que posteriormente se tapa o resurge, con metal. Un revestimiento de polietileno interpuesto forma la superficie del rodamiento (es decir, el acolchado) entre los dos implantes metálicos. Además, varios componentes de tejidos blandos de la articulación se extirpan total o parcialmente para lograr un equilibrio articular adecuado. Entre estos tejidos se encuentran los meniscos medial y lateral(Figura 2C),almohadilla de grasa infrapatelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E),sinovial(Figura 2F),y músculo oblicuo vasto medialis (VMO; Figura 2G) ¹⁵. Aunque los TKAs son generalmente exitosos para el tratamiento de la OA, alrededor del 20% de los pacientes reportan recurrencia del dolor después de la cirugía¹⁶. Junto con el alto costo y la relativa invasividad del procedimiento, estas limitaciones apuntan a la necesidad de más investigación para identificar tratamientos alternativos para mitigar la progresión de la OA.

Para explorar los mecanismos de la enfermedad en la OA que pueden presentar nuevas vías para la intervención terapéutica, se pueden utilizar sistemas experimentales, incluidas células, explantes de tejidos y modelos animales. Las células se cultivan típicamente en monocapa y se derivan de tejidos humanos o animales primarios (por ejemplo, condrocitos aislados del cartílago) o células inmortalizadas (por ejemplo, ATDC5¹⁷ y CHON-001¹⁸). Si bien las células pueden ser útiles para manipular variables experimentales en un entorno de cultivo controlado, no capturan las condiciones de la articulación natural que se sabe que afectan los fenotipos celulares¹⁹. Para recapitular mejor la compleja cascada de comunicación química, mecánica y de célula a célula subyacente a la OA, se encuentra una alternativa en muestras primarias de tejido humano o animal, ya sea que se utilicen frescas o cultivadas ex vivo como explantes, para preservar la estructura del tejido y el microambiente celular²⁰. Para estudiar la articulación in vivo,también son útiles los modelos animales pequeños (por ejemplo,^{ratón 21)}y grandes (por ejemplo, caballo²²⁾para OA (por ejemplo, a través de inducción quirúrgica, alteración genética o envejecimiento). Sin embargo, la traducción de estos modelos a la enfermedad humana puede estar limitada por diferencias anatómicas, fisiológicas y metabólicas, entre otras²³. Teniendo en cuenta las ventajas y desventajas de los sistemas experimentales, las fortalezas clave de ser específico de la especie y mantener el nicho extracelular ofrecido por los tejidos primarios de OA humana maximizan el potencial de traducción de los hallazgos de la investigación.

Los tejidos primarios de OA humana se pueden obtener fácilmente después de la TKA, lo que hace que la alta frecuencia de TKA sea un recurso valioso para la investigación. Entre las posibles aplicaciones experimentales se encuentran la expresión génica y los análisis histológicos. Para darse cuenta del potencial de los tejidos primarios de OA humana para estos enfoques de investigación y otros, se describen las siguientes consideraciones clave. En primer lugar, el uso de muestras de pacientes está sujeto a regulación ética, y los protocolos deben cumplir con las aprobaciones de la Junta de Revisión Institucional (IRB)²⁴. En segundo lugar, la heterogeneidad inherente de los tejidos primarios enfermos humanos y la influencia de variables como la edad y el sexo, entre otras, crean la necesidad de una cuidadosa selección del paciente (es decir, la aplicación de criterios de elegibilidad) y la interpretación de los datos. En tercer lugar, las propiedades biológicas únicas de diferentes tejidos en la articulación (por ejemplo, baja celularidad del cartílago y el menisco²⁵⁾pueden presentar desafíos durante los experimentos (por ejemplo, aislar alta calidad y cantidad de ARN). Este informe aborda estas consideraciones y presenta un protocolo para la selección de pacientes, el procesamiento de muestras, la homogeneización de tejidos, la extracción de ARN y el control de calidad (es decir, la evaluación de la pureza e integridad del ARN; Figura 3) fomentar el uso de tejidos primarios de OA humana en la comunidad investigadora.

Protocolo

Este protocolo de estudio fue aprobado y siguió las pautas institucionales establecidas por la Junta de Revisión Institucional del Sistema de Salud Henry Ford (IRB # 13995).

1. Selección de pacientes

1. Identifique a los pacientes de entre los programados para someterse a TKA con un cirujano ortopédico.
2. Seleccionar a los pacientes en función de los criterios de elegibilidad definidos por el protocolo del estudio. Ejemplos de criterios de inclusión incluyen tener 18 años de edad o más y tener un diagnóstico confirmado de osteoartritis de rodilla. Los ejemplos de criterios de exclusión incluyen someterse a un reemplazo parcial de rodilla o tener un diagnóstico confirmado de artritis reumatoide.
3. Póngase en contacto con los pacientes para obtener el consentimiento informado antes de la cirugía.

2. Procesamiento de muestras (para ARN)

NOTA: Realice todo el procesamiento de tejidos en un gabinete de bioseguridad de clase II y siga técnicas estériles. Siempre use epp apropiado (guantes de nitrilo, bata de laboratorio, gafas de seguridad) al procesar muestras humanas. Varios fragmentos de hueso se producen durante la TKA, una gran cantidad de hueso / cartílago estará potencialmente disponible para la disección. Debido a la progresión de la enfermedad, la degeneración del cartílago articular puede ser más grave en algunas porciones óseas, lo que se puede tener en cuenta en el diseño experimental. Solo los tejidos que exigen electrocauterización para la resección tienen daño térmico en el borde, y se realiza un esfuerzo quirúrgico concertado para obtener la mayoría de los tejidos con un bisturí para minimizar el daño. Los tejidos resecados deben mantenerse hidratados en todo momento con PBS estéril.

1. Desinfecte todas las superficies y equipos de trabajo con etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y, nuevamente, con etanol al 70%. Limpie el líquido residual con pañuelos limpios y sin pelusa. Las torzas, los cortadores de huesos y los bisturíes se colocan en autoclave o se empapan en etanol al 70% durante al menos 10 minutos antes de su uso. Mantenga el equipo sumergido en etanol al 70% cuando no esté en uso inmediato.
2. Pre-etiquetar al menos tres crioviales con el nombre de la muestra no identificado y el número de alícuota para cada tejido (por ejemplo, cartílago TKA-1 1).
   1. Identifique cada tipo de tejido de la muestra en función de las diferencias de tamaño, forma, color y textura como se muestra y describe en la Figura 2. Identificar el cartílago(Flecha Figura 2A), hueso(Flecha Figura 2B), menisco(Figura 2C),almohadilla grasa infrapatelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior(Figura 2E),sinovial(Figura 2F),y el músculo oblicuo vasto medialis(Figura 2G).
3. Aislar el cartílago articular.
   1. Seleccione una porción ósea con una degradación mínima del cartílago.
   2. Usando un bisturí No.10, corte la profundidad del cartílago en la medida de lo posible para diseccionar todo el grosor de la capa de cartílago.
      NOTA: Un bisturí No.10 solo penetrará en el cartílago, no en el hueso.
   3. Usando todo el grosor del cartílago, diseccione tres cubos de 5 mm.
4. Aislar el hueso subcondral.
   1. Use la misma sección ósea de la que se recolectó el cartílago.
   2. Usando un bisturí No.10, raspe el cartílago restante y los tejidos residuales de la superficie ósea.
   3. Sostenga la porción de hueso que se cortará con fórceps y use los cortadores de hueso para cortar tres cubos de 5 mm.
5. Aislar el menisco.
   1. Identifique una porción relativamente no dañada del menisco medial o lateral.
   2. Usando un bisturí No.10 y fórceps, disecciona tres cubos de 5 mm.
6. Aísle la almohadilla de grasa infrapatelar.
   1. Usando un bisturí No.10 y fórceps, corte la porción amarilla del tejido en tres porciones de igual tamaño y homogéneas (~ 500 mg cada una).
7. Aislar el ligamento cruzado anterior (LCA).
   1. Usando un bisturí No.10 y fórceps, disecciona tres cubos de 5 mm.
8. Aislar la membrana sinovial.
   1. Usando un bisturí No.10 y forrórceps, aísle la porción celular rosa de la membrana tanto como sea posible raspando el tejido graso.
   2. Diseccionar tres porciones de igual tamaño y homogéneas (~200 mg cada una).
9. Aislar el músculo oblicuo vasto medialis (VMO).
   1. Usando un bisturí No.10 y forrórceps, elimine cualquier tejido graso de la muestra, dejando solo el tejido muscular rojo.
   2. Diseccionar tres cubos de 5 mm.
      NOTA: El tamaño inicial del tejido limita el tamaño de las porciones.
10. Enjuague las porciones de tejido con PBS estéril para eliminar cualquier residuo o desecho.
11. Para realizar la histología, fije cada porción de tejido como se describe en la Parte 3.
12. Para realizar la extracción de ARN, corte cada una de las tres porciones de tejido en trozos más pequeños (cubos de ~ 1-2   mm).
    1. Transfiera las piezas más pequeñas a un criovial de 2 ml, asegure las tapas herméticamente, congele rápidamente sumergiéndose en nitrógeno líquido durante 30 s, y luego transfiera a un congelador de -80 ° C para su almacenamiento a largo plazo (hasta 4 meses probado en el protocolo actual). Repita esto para todas las alícuotas de todos los tejidos.
    2. Continúe con la homogeneización de tejidos como se describe en la Parte 4.

3. Procesamiento de muestras (para histología)

PRECAUCIÓN: La formalina es un producto químico peligroso, solo se usa en una campana de humos químicos.

1. Llene los tubos cónicos preeticalados de 15 ml con solución de formalina al 10%.
2. Con bórceps, transfiera la sección de tejido a los tubos llenos de formalina.
3. Fije los tejidos en formalina durante 1 semana a temperatura ambiente mientras agita / agita si es posible.
4. Después de 1 semana, deseche la formalina en la eliminación adecuada de desechos químicos, enjuague los tejidos con PBS y luego transfiera a un tubo cónico fresco de 15 ml que contenga etanol al 70% para su almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta que las muestras se incrusten para la sección.
   NOTA: Solo para huesos/cartílagos, realice la descalcificación de la siguiente manera.
5. Después de 1 semana, deseche la formalina en la eliminación adecuada de desechos químicos y enjuague los tejidos con PBS.
6. Transfiera el tejido a un tubo cónico de 50 ml con 45 ml de solución de EDTA al 10% (pH 7.4).
7. Si no es posible agitar/agitar, invierta los tubos 10-15 veces al día.
8. Deseche y reemplace la solución de EDTA una vez a la semana.
   1. Dos veces por semana, pruebe la textura con un instrumento (es decir, espátula) o un dedo enguantado para confirmar la descalcificación observando la deformación cuando se aplica presión. El tiempo requerido para descalcificar el tejido óseo variará entre muestras de 4 a 6 semanas.
9. Una vez descalcificado, enjuague el tejido con PBS y transfiéralo a un tubo cónico fresco de 15 ml que contenga 70% de etanol para su almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta que las muestras se incrusten para la sección.

4. Homogeneización tisular

PRECAUCIÓN: El protocolo utiliza el químico peligroso fenol. El trabajo con fenol debe realizarse en una campana de humos químicos.

NOTA: Limpie a fondo todos los equipos y superficies que se utilizarán con etanol al 70% (remoje durante un mínimo de 10 minutos), seguido de descontaminante RNasa (remoje durante un mínimo de 10 minutos), enjuague con agua tratada con DEPC, limpie con una toalla de papel limpia y sin pelusa, y luego vuelva a pulverizar o remojar con etanol al 70%.

1. Homogeneización de tejidos duros (cartílago articular, hueso subcondral, menisco)
   1. Antes de la homogeneización, enfríe el mortero, el mortero y la espátula con nitrógeno líquido. Estos deben mantenerse lo más fríos posible para evitar el deshielo de la muestra.
   2. Procese las muestras una a la vez, manteniendo las otras muestras a -80 °C hasta que se utilicen.
   3. Transfiera la muestra de tejido al mortero utilizando una espátula refrigerada; vierta nitrógeno líquido adicional sobre el tejido y deje que se evapore. Aplasta el tejido con el mortero. Agregue repetidamente más nitrógeno líquido a la muestra de tejido, deje que se evapore y luego continúe moliendo con el mortero para hacer un polvo fino.
   4. Después de pulverizar el tejido tanto como sea posible, transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml preenfriado.
      1. Pre-enfriar los tubos sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante 30 s antes de la transferencia de tejido.
   5. Agregue 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada tubo y manténgalo en hielo.
   6. Repita los pasos 4.1.3-4.1.5 para cada muestra de tejido duro.
   7. Después de cada tejido, limpie el mortero, el mortero y la espátula con etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y un remojo adicional en etanol al 70%. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa.
   8. Incubar las muestras en hielo durante 20 minutos adicionales.
2. Homogeneización de tejidos blandos (almohadilla de grasa infrapatular, LCA, sinovial, VMO)
   1. Desinfecte el homogeneizador haciendo correr tubos de etanol al 70%, descontaminante RNasa, agua tratada con DEPC y un lavado adicional de etanol al 70%, cada uno durante 30 s. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa. Repita esto entre cada muestra.
   2. Pre-etiqueta 5 ml de tubos de fondo redondos para cada muestra. Agregue 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada tubo.
      1. Trabaje en una muestra a la vez, manteniendo otras muestras para ser procesadas a -80 °C hasta su uso.
   3. Transfiera el tejido a un tubo de 5 ml preetitiqueta con ácido-guanidinio-fenol.
   4. Homogeneizar los tejidos en pulsos de 30 s, manteniéndose en hielo durante y entre pulsos. Repetir hasta que el tejido se disuelva visualmente o durante un máximo de cinco pulsos de 30 s.
      NOTA: Algunos tejidos fibrosos (es decir, músculo) pueden no homogeneizarse completamente.
   5. Incubar el tejido disuelto en hielo y pasar a la siguiente muestra.
      1. Limpie el homogeneizador como se describe en el paso 4.2.1. Asegúrese de que los trozos de tejido no permanezcan en los dientes de la sonda; retirar con pórceps estériles si es necesario.
   6. Después de la homogeneización de todas las muestras, incubar en hielo en ácido-guanidinio-fenol durante 20 minutos adicionales.
   7. Transfiera las muestras de los tubos de fondo redondos a los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml preetitiqueados y preenfriados.

5. Extracción de ARN de los tejidos

PRECAUCIÓN: Este protocolo utiliza productos químicos peligrosos como fenol, cloroformo e isopropanol. Realiza todo el trabajo en una campana extractora de humos químicos.

NOTA: El equipo y los reactivos están reservados solo para el trabajo de ARN y deben ser de grado químico adecuado para aplicaciones moleculares (es decir, estériles, libres de nucleasas). Este protocolo sucede a los protocolos de homogeneización de tejidos de las partes 4.1 y 4.2. Limpie a fondo todos los equipos y superficies que se utilizarán con etanol al 70% (remojo durante un mínimo de 10 min), seguido de descontaminante RNasa (remojo durante un mínimo de 10 min). Enjuague con agua tratada con DEPC, limpie el líquido residual con una toalla de papel limpia y sin pelusa, y luego vuelva a pulverizar o remojar con etanol al 70%.

1. Centrifugar los tubos de la microcentrífuga a 10000 x g durante 10 min a 4 °C para peletizar los escombros.
2. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 ml.
   NOTA: Para los tejidos grasos, una capa lipídica a veces estará presente en la parte superior. Evite transferir esto perforando la capa en el lado del tubo con una punta de pipeta.
3. Añadir 200 μL de cloroformo por 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada muestra. Agite los tubos vigorosamente a mano durante 30 s para mezclar. Luego, incubar en hielo durante 2 min.
4. Muestras de centrífugas a 10000 x g durante 12 min a 4 °C.
   NOTA: Después de la centrifugación, se habrán formado tres capas: una fase acuosa que contiene ARN, una interfase de ADN blanco y una fase de proteína rosa en la parte inferior.
5. Transfiera ~ 500 μL de la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga fresco de 1.5 ml.
   NOTA: No altere la interfase y las fracciones de proteínas. Almacene estas fases a -80 °C para futuros aislamientos de ADN o proteínas.
6. Agregue un volumen igual de solución de ácido-guanidinio-fenol a la fase acuosa transferida, mezcle invirtiendo el tubo 8-10 veces. Incubar el tubo en hielo durante 20 min.
7. Añadir 200 μL de cloroformo por 1 ml de la solución de ácido-guanidinio-fenol a cada muestra. Agitar vigorosamente a mano durante 30 s para mezclar y luego incubar en hielo durante 2 min.
8. Muestras de centrífugas a 10000 x g durante 12 min a 4 °C.
9. Transfiera <500 μL de la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco, con cuidado de no contaminar la muestra con las otras fases.
   PRECAUCIÓN: Deseche las fases restantes con los métodos apropiados de eliminación de materiales peligrosos.
10. Añadir un volumen igual (como fase acuosa) de 100% de isopropanol a cada muestra. Mezclar invirtiendo el tubo 8-10 veces. Incubar en hielo durante 5 min.
    1. Agregue 1 μL de coprecipitante de glucógeno a cada muestra para ayudar a localizar el pellet de ARN después de la centrifugación.
11. Centrifugar las muestras a 12000 x g durante 25 min a 4 °C.
12. Ubique el gránulo en el tubo (si usa coprecipitant, aparecerá azul). Vierta con cuidado el sobrenadante.
13. Lave el pellet agregando 1 ml de etanol helado al 75% a cada muestra, vórtice para desalojar el pellet del fondo del tubo.
    NOTA: Prepare etanol al 75% utilizando etanol puro de grado molecular y agua libre de nucleasas.
14. Centrifugadora a 7000 x g durante 5 min a 4 °C. Vierta con cuidado el sobrenadante.
15. Repita los pasos 5.13 y 5.14 dos veces más.
16. Giro rápido (<2000 x g durante 5 s) para llevar cualquier líquido residual al fondo del tubo. Use una pipeta P20 para eliminar cualquier etanol residual de la parte inferior de los tubos.
    1. Evite tocar el pellet de ARN con una punta de pipeta. Cambiar consejos entre muestras.
17. Con las tapas de los tubos abiertas, seque al aire las muestras a temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: El pellet puede volverse translúcido a medida que se seca. Asegurarse de que todo el etanol residual se haya evaporado mejorará la pureza del ARN.
18. Agregue 25 μL de agua libre de nucleasa a cada tubo para disolver el pellet.
19. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
20. Pipete suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar el ARN.
21. Alícuota de 5 μL de la muestra en un tubo fresco para el análisis de control de calidad (Parte 6). Almacene los 20 μL restantes a -80 °C para los ensayos de expresión génica.

6. Control de calidad

1. Determine la concentración y pureza del ARN utilizando un espectrofotómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Determine la integridad del ARN utilizando un dispositivo de electroforesis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Diluya el ARN para que esté dentro del rango de los límites de detección del chip.

Resultados

Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana están disponibles para su recolección de pacientes sometidos a ATC para OA(Figura 1). En este protocolo, cada uno de estos tejidos fue identificado y procesado dentro de las 4 h de la extirpación quirúrgica (Figura 2). Siguiendo los pasos descritos en la Figura 3,las porciones de cada tejido se fijaron en formalina para la evaluación histológica

Discusión

El protocolo presentado ha demostrado ser exitoso para la recolección de siete tejidos primarios de OA humana para la extracción de ARN(Tabla 1)y el procesamiento histológico(Figura 4). Antes de recolectar muestras de pacientes, es necesario establecer un protocolo aprobado por el IRB, idealmente en colaboración con un cirujano o equipo quirúrgico. La aplicación de un protocolo estandarizado para la recolección de muestras (por ejemplo, la resección desde ubicaciones...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.