JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Introdução

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur1. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia defluidos 1,2,3 (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite movimento sem atrito no plano frontal1,3. Em condições patológicas, o movimento pode se tornar restrito e doloroso. A doença degenerativa mais comum nas articulações do joelho é a osteoartrite (AA)4. Sabe-se que uma variedade de fatores de risco predispõem ao desenvolvimento de OA, incluindo idade mais avançada, obesidade, sexo feminino, trauma articular e genética, entre outros5,6. Atualmente, estima-se que existam 14 milhões de pessoas nos EUA com OA sintomático do joelho, com a prevalência aumentando devido ao aumento da idade populacional e às taxas de obesidade7,8. Inicialmente considerada uma doença da cartilagem, a OA agora é entendida como uma doença de toda a articulação9. As alterações patológicas comumente observadas na OA incluem erosão articular da cartilagem, formação de osteofitas, espessamento ósseo subcondral e inflamação do sinolário9,10. Como não há cura conhecida para OA, os tratamentos focam principalmente no tratamento de sintomas (por exemplo, dor)11,12, e uma vez que o OA progrediu para o estágio final, a cirurgia de substituição articular é frequentemente indicada13.

As cirurgias de substituição articular podem ser substituições parciais ou totais do joelho, com artroplastia total do joelho (TKA), incluindo a substituição de toda a articulação tibiofemoral e a articulação patelar. A partir de 2020, aproximadamente 1 milhão de TKAs são realizados nos EUA a cada ano14. Durante a TKA, um cirurgião ortopédico resseca a porção superior do platô tibial e os condyles femorais inferiores(Figura 2A, 2B) a serem equipados com implantes protéticos. Às vezes mal interpretado pelos pacientes, em um TKA, apenas 8-10 mm é ressecado a partir da extremidade de cada osso, que é posteriormente tampado ou ressurgido, com metal. Um forro de polietileno interposto forma a superfície de rolamento (ou seja, estofamento) entre os dois implantes metálicos. Além disso, vários componentes de tecido mole da articulação são total ou parcialmente extirpados para alcançar o equilíbrio articular adequado. Entre esses tecidos estão o menisco medial e lateral(Figura 2C),bloco de gordura infrapator(Figura 2D),ligamento cruzado anterior (LCA; Figura 2E), sinovia(Figura 2F), e vasto músculo oblíquo de vastus medialis (VMO; Figura 2G) 15. Embora os TKAs sejam geralmente bem sucedidos para o tratamento de OA, cerca de 20% dos pacientes relatam recorrência de dor pós-cirurgia16. Juntamente com o alto custo e a invasividade relativa do procedimento, essas limitações apontam para a necessidade de novas pesquisas para identificar tratamentos alternativos para mitigar a progressão da OA.

Para explorar mecanismos de doenças em OA que possam apresentar novos caminhos para a intervenção terapêutica, podem ser utilizados sistemas experimentais, incluindo células, explantas teciduais e modelos animais. As células são tipicamente cultivadas em monocamadas e são derivadas de tecidos humanos ou animais primários (por exemplo, condrócitos isolados da cartilagem) ou células imortalizadas (por exemplo, ATDC517 e CHON-00118). Embora as células possam ser úteis para manipular variáveis experimentais em um ambiente de cultura controlada, elas não capturam condições da articulação natural que são conhecidas por impactar fenótiposcelulares 19. Para recapitular melhor a complexa cascata de comunicação química, mecânica e célula-celular subjacente OA, uma alternativa é encontrada em amostras primárias de tecido humano ou animal, sejam elas usadas como explants frescas ou cultivadas, para preservar a estrutura tecidual e o microambientecelular 20. Para estudar a articulação in vivo,pequenos (por exemplo, mouse21) e grandes (por exemplo, cavalo22) modelos animais para OA (por exemplo, por indução cirúrgica, alteração genética ou envelhecimento) também são úteis. No entanto, a tradução desses modelos para a doença humana pode ser limitada por diferenças anatômicas, fisiológicas e metabólicas, entre outras23. Considerando as vantagens e desvantagens dos sistemas experimentais, os principais pontos fortes de serem específicos das espécies e manter o nicho extracelular oferecido pelos tecidos OA humanos primários maximizam o potencial translacional dos achados da pesquisa.

Tecidos OA humanos primários podem ser facilmente obtidos após a TKA, tornando a alta frequência de TKAs um recurso valioso para a pesquisa. Entre as aplicações experimentais potenciais estão expressão genética e análises histológicas. Para perceber o potencial dos tecidos OA humanos primários para essas abordagens de pesquisa e outros, delineados são as seguintes considerações-chave. Em primeiro lugar, o uso de amostras de pacientes está sujeito a regulação ética, e os protocolos devem atender às aprovações do Conselho de Revisão Institucional (IRB)24. Em segundo lugar, a heterogeneidade inerente aos tecidos primários doentes humanos e a influência de variáveis como idade e sexo, entre outras, criam a necessidade de seleção cuidadosa do paciente (ou seja, aplicação de critérios de elegibilidade) e interpretação dos dados. Em terceiro lugar, as propriedades biológicas únicas de diferentes tecidos na articulação (por exemplo, baixa celularidade da cartilagem e menisco25) podem apresentar desafios durante os experimentos (por exemplo, isolando alta qualidade e quantidade de RNA). Este relatório aborda essas considerações e apresenta um protocolo para seleção de pacientes, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (ou seja, avaliação da pureza e integridade do RNA; Figura 3) para incentivar o uso de tecidos OA humanos primários na comunidade de pesquisa.

Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995).

1. Seleção de pacientes

  1. Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico.
  2. Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter diagnóstico confirmado de osteoartrite do joelho. Exemplos de critérios de exclusão incluem submeter-se a substituição parcial do joelho ou ter um diagnóstico confirmado de artrite reumatoide.
  3. Entre em contato com os pacientes para obter consentimento informado antes da cirurgia.

2. Processamento de amostras (para RNA)

NOTA: Realize todo o processamento de tecidos em um armário de biossegurança classe II e siga técnicas estéreis. Use sempre EPI apropriado (luvas de nitrito, jaleco, óculos de segurança) ao processar amostras humanas. Vários fragmentos ósseos são produzidos durante a TKA, uma grande quantidade de osso/cartilagem estará potencialmente disponível para dissecção. Devido à progressão da doença, a degeneração da cartilagem articular pode ser mais grave em algumas porções ósseas, que podem ser fatoradas em design experimental. Apenas tecidos que obrigam eletrocauteria para ressecção têm danos na borda térmica, e um esforço cirúrgico concertado é feito para obter a maioria dos tecidos com um bisturi para minimizar os danos. Os tecidos ressecados devem ser mantidos hidratados o tempo todo com PBS estéril.

  1. Desinfetar todas as superfícies de trabalho e equipamentos com 70% de etanol, descontaminante RNase, água tratada com DEPC e novamente com 70% de etanol. Limpe o líquido residual com tecidos limpos e livres de fiapos. Fórceps, cortadores ósseos e bisturis são autoclavados ou encharcados em 70% de etanol por pelo menos 10 minutos antes do uso. Mantenha o equipamento submerso em 70% de etanol quando não estiver em uso imediato.
  2. Pré-rotular pelo menos três criovias com nome amostral desidenti identificada e número de alíquota para cada tecido (por exemplo, TKA-1 Cartilagem 1).
    1. Identifique cada tipo de tecido da amostra com base nas diferenças de tamanho, forma, cor e textura, como mostrado e descrito na Figura 2. Identifique a cartilagem(Figura 2A, osso(Figura 2B de seta), menisco(Figura 2C),bloco de gordura infrapaelar(Figura 2D),ligamento cruzado anterior(Figura 2E),sinodolio(Figura 2F),e o vasto músculo oblíquo medialis(Figura 2G).
  3. Isole a cartilagem articular.
    1. Selecione uma porção óssea com degradação mínima da cartilagem.
    2. Usando um bisturi nº 10, corte a profundidade da cartilagem o mais longe possível para dissecar toda a espessura da camada de cartilagem.
      NOTA: Um bisturi nº 10 só penetrará na cartilagem, não no osso.
    3. Usando a espessura total da cartilagem, disseca três cubos de 5 mm.
  4. Isole o osso subcondral.
    1. Use a mesma seção óssea da qual a cartilagem foi coletada.
    2. Usando um bisturi nº 10, raspe qualquer cartilagem restante e tecidos residuais da superfície óssea.
    3. Segure a porção óssea a ser cortada com fórceps e use os cortadores ósseos para cortar três cubos de 5 mm.
  5. Isole o menisco.
    1. Identifique uma parte relativamente intacta do menisco medial ou lateral.
    2. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, disseca três cubos de 5 mm.
  6. Isole a almofada de gordura infrapator.
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, corte a porção amarela do tecido em três porções iguais e homogêneas (~500 mg cada).
  7. Isole o ligamento cruzado anterior (LCA).
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, disseca três cubos de 5 mm.
  8. Isole o sinolio.
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, isole a porção celular rosa da membrana o máximo possível, raspando o tecido adiposo.
    2. Disseca três porções iguais e homogêneas (~200 mg cada).
  9. Isolar o vasto músculo oblíquo medial (VMO).
    1. Usando um bisturi nº 10 e fórceps, remova qualquer tecido adiposo da amostra, deixando apenas o tecido muscular vermelho.
    2. Disseca três cubos de 5 mm.
      NOTA: O tamanho inicial do tecido limita o tamanho das porções.
  10. Enxágüe as porções de tecido com PBS estéril para remover qualquer resíduo ou detrito.
  11. Para realizar a histologia, fixar cada porção de tecido conforme descrito na Parte 3.
  12. Para realizar a extração de RNA, corte cada uma das três porções de tecido em pedaços menores (~cubos de 1-2   mm).
    1. Transfira as peças menores para um criovial de 2 mL, proteja firmemente as tampas, congele o flash submergindo em nitrogênio líquido por 30 s e, em seguida, transfira para um congelador de -80 °C para armazenamento a longo prazo (até 4 meses testado no protocolo atual). Repita isso para todas as alíquotas de todos os tecidos.
    2. Continue a homogeneização do tecido conforme descrito na Parte 4.

3. Processamento de amostras (para histologia)

ATENÇÃO: A formalina é um produto químico perigoso, usado apenas em um capô de fumaça química.

  1. Encha tubos cônicos pré-rotulados de 15 mL com solução de formalina de 10%.
  2. Usando fórceps, transfira a seção de tecido para os tubos cheios de formalina.
  3. Fixar os tecidos em formalina por 1 semana à temperatura ambiente enquanto treme/agita, se possível.
  4. Após 1 semana, descarte a formalina no descarte adequado de resíduos químicos, enxágue os tecidos com PBS e, em seguida, transfira para um tubo cônico fresco de 15 mL contendo 70% de etanol para armazenamento a longo prazo a 4 °C até que as amostras sejam incorporadas para secção.
    NOTA: Somente para osso/cartilagem, realize a decalcificação da seguinte forma.
  5. Após 1 semana, descarte a formalina no descarte adequado de resíduos químicos e enxágue os tecidos com PBS.
  6. Transfira o tecido para um tubo cônico de 50 mL com 45 mL de solução EDTA de 10% (pH 7.4).
  7. Se não for possível sacudir/agitar, inverta os tubos 10-15 vezes uma vez por dia.
  8. Descarte e substitua a solução EDTA uma vez por semana.
    1. Duas vezes por semana, teste a textura com um instrumento (ou seja, espátula) ou dedo enluvado para confirmar a decalcificação observando a deformação quando a pressão é aplicada. O tempo necessário para descalcificar o tecido ósseo varia entre amostras de 4 a 6 semanas.
  9. Uma vez descalcificado, enxágue o tecido com PBS e transfira para um tubo cônico fresco de 15 mL contendo 70% de etanol para armazenamento a longo prazo a 4 °C até que as amostras sejam incorporadas para secção.

4. Homogeneização de tecidos

ATENÇÃO: O protocolo utiliza o fenól químico perigoso. O trabalho com fenol deve ser realizado em um capuz de fumaça química.

NOTA: Limpe completamente todos os equipamentos e superfícies a serem utilizados com 70% de etanol (mergulhe por um mínimo de 10 minutos), seguido pelo descontaminante RNase (mergulhe por um mínimo de 10 minutos), enxágue com água tratada com DEPC, limpe com uma toalha de papel limpa e sem fiapos e, em seguida, respray ou mergulhe com 70% de etanol.

  1. Homogeneização do tecido duro (cartilagem articular, osso subcondral, menisco)
    1. Antes da homogeneização, esfrie a argamassa, pilão e espátula usando nitrogênio líquido. Estes devem ser mantidos o mais frio possível para evitar o degelo da amostra.
    2. Processe as amostras uma de cada vez, mantendo as outras amostras a -80 °C até que usem.
    3. Transfira a amostra de tecido para argamassa usando uma espátula resfriada; despeje nitrogênio líquido adicional em cima do tecido e permita que ele evapore. Esmague o tecido usando o pilão. Adicione repetidamente mais nitrogênio líquido à amostra de tecido, permita que ele evapore e, em seguida, continue moendo com o pilão para fazer um pó fino.
    4. Depois de colocar o tecido em pó o máximo possível, transfira para um tubo de microcentrifus de 1,5 mL pré-refrigerado.
      1. Tubos pré-frio submergindo em nitrogênio líquido por 30 s antes da transferência de tecido.
    5. Adicione 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada tubo e mantenha-o no gelo.
    6. Repetir as etapas 4.1.3-4.1.5 para cada amostra de tecido duro.
    7. Após cada tecido, limpe a argamassa, o pilão e a espátula com 70% de etanol, descontaminante de RNase, água tratada com DEPC e um molho adicional em 70% de etanol. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos.
    8. Incubar as amostras no gelo por mais 20 minutos.
  2. Homogeneização de tecido mole (bloco de gordura infrapator, ACL, sinovial, VMO)
    1. Desinfete o homogeneizador por tubos de 70% de etanol, descontaminante de RNase, água tratada com DEPC e uma lavagem adicional de 70% de etanol, cada um por 30 s. Limpe qualquer líquido residual com um tecido limpo e sem fiapos. Repita isso entre cada amostra.
    2. Pré-rotular tubos de fundo redondos de 5 mL para cada amostra. Adicione 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada tubo.
      1. Trabalhe em uma amostra de cada vez, mantendo outras amostras a serem processadas a -80 °C até o uso.
    3. Transfira o tecido para um tubo pré-rotulado de 5 mL com ácido-guanidinium-phenol.
    4. Homogeneize os tecidos em pulsos de 30 s, mantendo-se no gelo durante e entre pulsos. Repita até que o tecido sejalvido visualmente ou por um máximo de cinco pulsos de 30 s.
      NOTA: Alguns tecidos fibrosos (ou seja, músculo) podem não homogeneizar completamente.
    5. Incubar o tecido dissolvido no gelo e passar para a próxima amostra.
      1. Limpe o homogeneizador conforme descrito na etapa 4.2.1. Certifique-se de que os pedaços de tecido não permaneçam nos dentes da sonda; remover com fórceps estéreis, se necessário.
    6. Após a homogeneização de todas as amostras, incubar no gelo em ácido-guanidinium-phenol por mais 20 minutos.
    7. Transfira as amostras de tubos de fundo redondos para tubos de microcentrifus de 1,5 mL pré-rotulados e pré-refrigerados.

5. Extração de RNA de tecidos

ATENÇÃO: Este protocolo utiliza produtos químicos perigosos como fenol, clorofórmio e isopropanol. Realize todo o trabalho em um capuz de fumaça química.

NOTA: Equipamentos e reagentes são reservados apenas para trabalhos de RNA e devem ser de grau químico adequado para aplicações moleculares (ou seja, estéreis, livres de nuclease). Este protocolo sucede ambos os protocolos de homogeneização de tecidos das partes 4.1 e 4.2. Limpe minuciosamente todos os equipamentos e superfícies a serem utilizados com 70% de etanol (de molho por um mínimo de 10 minutos), seguido pelo descontaminante RNase (molho por um mínimo de 10 minutos). Enxágüe com água tratada com DEPC, limpe o líquido residual com uma toalha de papel limpa e sem fiapos e, em seguida, respray ou mergulhe com 70% de etanol.

  1. Centrifugar os tubos de microcentrifuuge a 10000 x g por 10 min a 4 °C para pelotar os detritos.
  2. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mL.
    NOTA: Para tecidos gordurosos, uma camada lipídica às vezes estará presente na parte superior. Evite transferi-lo perfurando a camada na lateral do tubo com uma ponta de pipeta.
  3. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada amostra. Aperte os tubos vigorosamente à mão por 30 s para misturar. Em seguida, incubar no gelo por 2 minutos.
  4. Centrífuga amostras a 10000 x g para 12 min a 4 °C.
    NOTA: Após a centrifugação, três camadas terão se formado: uma fase aquosa contendo RNA, uma interfase de DNA branco e uma fase de proteína rosa na parte inferior.
  5. Transfira ~500 μL da fase superior e aquosa para um tubo de microcentrifuge fresco de 1,5 mL.
    NOTA: Não perturbe a interfase e as frações proteicas. Armazene essas fases a -80 °C para futuro DNA ou isolamento de proteínas.
  6. Adicione um volume igual de solução ácido-guanidinium-fenol à fase aquosa transferida, misture invertendo o tubo 8-10 vezes. Incubar o tubo no gelo por 20 minutos.
  7. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL da solução ácido-guanidinium-fenol a cada amostra. Agite vigorosamente à mão por 30 s para misturar e, em seguida, incubar no gelo por 2 min.
  8. Centrífuga amostras a 10000 x g para 12 min a 4 °C.
  9. Transfira <500 μL da fase aquosa para um tubo de microcentrifuuge fresco, com cuidado para não contaminar a amostra com as outras fases.
    ATENÇÃO: Descarte as demais fases com métodos adequados de descarte de materiais perigosos.
  10. Adicione um volume igual (como fase aquosa) de 100% isopropanol a cada amostra. Misture invertendo o tubo 8-10 vezes. Incubar no gelo por 5 minutos.
    1. Adicione 1 μL de glicógeno coprecipitante a cada amostra para ajudar na localização da pelota de RNA pós-centrifugação.
  11. Centrifugar as amostras a 12000 x g por 25 min a 4 °C.
  12. Localize a pelota no tubo (se usar coprecipitante, ela aparecerá azul). Despeje cuidadosamente o supernatante.
  13. Lave a pelota adicionando 1 mL de etanol gelado de 75% a cada amostra, vórtice para desalojar a pelota do fundo do tubo.
    NOTA: Prepare 75% de etanol usando etanol puro de grau molecular e água sem nuclease.
  14. Centrifugar a 7000 x g por 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente o supernatante.
  15. Repita as etapas 5.13 e 5.14 mais duas vezes.
  16. Giro rápido (<2000 x g para 5 s) para trazer qualquer líquido residual para o fundo do tubo. Use uma pipeta P20 para remover qualquer etanol residual da parte inferior dos tubos.
    1. Evite tocar na pelota de RNA com uma ponta de pipeta. Mude as dicas entre as amostras.
  17. Com tampas de tubo abertas, amostras secas ao ar à temperatura ambiente por 10 minutos.
    NOTA: A pelota pode se tornar translúcida à medida que seca. Garantir que todo o etanol residual tenha evaporado melhorará a pureza do RNA.
  18. Adicione 25 μL de água sem nuclease a cada tubo para dissolver a pelota.
  19. Incubar em temperatura ambiente por 5 minutos.
  20. Pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar o RNA.
  21. Alíquota 5 μL da amostra em um tubo fresco para análise de controle de qualidade(Parte 6). Armazene os 20 μL restantes a -80 °C para ensaios de expressão genética.

6. Controle de qualidade

  1. Determine a concentração e pureza do RNA usando um espectotômetro de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Determine a integridade do RNA usando um dispositivo de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Diluir o RNA para estar dentro do alcance dos limites de detecção do chip.

Resultados

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas ...

Discussão

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essenci...

Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos participantes do estudo que tornaram essa pesquisa possível e dedicam este relatório a novos cientistas no campo da osteoartrite.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf05 402Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificICN19400290Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificBP2818500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificAC327272500Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent AlcoholCardinal HealthC4305Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishesThermo Scientific12-556-003Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific14 959 53ASterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)Fisher Scientific10 500 26Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubesCorning352052Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubesFisher Scientific12 565 271Sterile, nuclease-free.
BioanalyzerAgilentG2939BAFor RNA integrity measurement.
Biosafety CabinetGeneral lab equipment
Bone CuttersFisher Scientific08 990Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume HoodGeneral lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)Thermo Scientific3120032Sterile, nuclease-free.
EDTALife Technologies15-576-02810% solution with dH2O.
ForcepsAny vendorSterilized with 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Liquid NitrogenAny vendor
Liquid Nitrogen DewarGeneral lab equipment
Mortar and PestleAny vendorReserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop SpectrophotometerThermo ScientificND-2000For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated waterFisher ScientificSterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)Gibco20 012 050Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tipsAny vendorSterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kitQiagen217204
Refrigerated Centrifuge 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatula (semimicro size)Any vendorReserved for RNA work only.
Tissue homogenizerPro Scientific01-01200Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol ReagentFisher Scientific15 596 026Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.

Referências

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
  26. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  27. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  28. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  29. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  30. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  31. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
  32. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  33. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
  34. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  35. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
  36. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  37. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  38. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

BiologiaEdi o 173

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados