Coleta de tecidos e extração de RNA da articulação do joelho osteoartrítica humana

Resumo

Os tecidos primários obtidos de pacientes após a artroplastia total do joelho fornecem um modelo experimental para a pesquisa da osteoartrite com tradução clínica máxima. Este protocolo descreve como identificar, processar e isolar o RNA de sete tecidos únicos do joelho para apoiar a investigação mecanicista na osteoartrite humana.

Resumo

A osteoartrite (OA) é uma doença articular crônica e degenerativa que mais frequentemente afeta o joelho. Como atualmente não há cura, a artroplastia total do joelho (TKA) é uma intervenção cirúrgica comum. Experimentos com tecidos OA humanos primários obtidos da TKA fornecem a capacidade de investigar mecanismos de doença ex vivo. Embora o OA tenha sido pensado anteriormente para impactar principalmente a cartilagem, agora é conhecido por impactar múltiplos tecidos na articulação. Este protocolo descreve a seleção do paciente, processamento de amostras, homogeneização de tecidos, extração de RNA e controle de qualidade (com base na pureza, integridade e rendimento do RNA) de cada um dos sete tecidos únicos para apoiar a investigação do mecanismo da doença na articulação do joelho. Com consentimento informado, foram obtidas amostras de pacientes submetidos à TKA para OA. Os tecidos foram dissecados, lavados e armazenados dentro de 4h de cirurgia por congelamento de flash para fixação de RNA ou formalina para histologia. Os tecidos coletados incluíam cartilagem articular, osso subcondral, menisco, almofada de gordura infrapator, ligamento cruzado anterior, sinodio e músculo oblíquo vasto medialis. Os protocolos de extração de RNA foram testados para cada tipo de tecido. A modificação mais significativa envolveu o método de desintegração usado para tecidos duros de baixa célula, alta matriz (considerados como cartilagem, osso e menisco) versus células relativamente altas, baixa matriz, tecidos moles (considerados como almofada de gordura, ligamento, sinodio e músculo). Verificou-se que a pulverização era adequada para tecidos duros, e a homogeneização era apropriada para tecidos moles. Observou-se uma propensão para alguns sujeitos de produzir valores de número de integridade de RNA (RIN) mais elevados do que outros sujeitos consistentemente em múltiplos tecidos, sugerindo que fatores subjacentes, como a gravidade da doença, podem impactar a qualidade do RNA. A capacidade de isolar o RNA de alta qualidade dos tecidos OA humanos primários fornece um modelo fisiologicamente relevante para experimentos sofisticados de expressão genética, incluindo sequenciamento, que podem levar a insights clínicos que são mais facilmente traduzidos para os pacientes.

Introdução

O joelho é a maior articulação sinovial do corpo humano, compreendendo a articulação tibiofemoral entre a tíbia e o fêmur e a articulação patelar entre a patela e o fêmur¹. Os ossos do joelho são forrados com cartilagem articular e apoiados por vários tecidos conjuntivos, incluindo menisco, gordura, ligamentos e músculo, e uma membrana sinovial encapsula toda a articulação para criar uma cavidade sintetizada cheia de^{fluidos 1,2,3} (Figura 1). Um joelho saudável funciona como uma articulação de dobradiça móvel que permite mo....

Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado e seguiu as diretrizes institucionais estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional do Sistema de Saúde Henry Ford (IRB nº 13995).

1. Seleção de pacientes

1. Identificar os pacientes entre os agendados para serem submetidos à TKA com um cirurgião ortopédico.
2. Selecione os pacientes com base nos critérios de elegibilidade definidos pelo protocolo de estudo. Exemplos de critérios de inclusão incluem ter 18 anos ou mais e ter diagnóstico confirmado de osteoartrite do joelho. Exemplos de critérios de exclusão incluem submeter-se a substituição parcial do joelho ou ter um diagnóstico c....

Resultados

Sete tecidos articulares humanos únicos estão disponíveis para coleta de pacientes submetidos a TKA para OA(Figura 1). Neste protocolo, cada um desses tecidos foi identificado e processado dentro de 4h de remoção cirúrgica(Figura 2). Seguindo as etapas descritas na Figura 3,as porções de cada tecido foram fixadas para avaliação histológica(Figura 4),enquanto outras porções foram congeladas .......

Discussão

O protocolo apresentado mostrou-se bem sucedido na coleta de sete tecidos OA humanos primários para extração de RNA(Tabela 1) e processamento histológico(Figura 4). Antes de coletar amostras de pacientes, é necessário estabelecer um protocolo aprovado pelo IRB, idealmente em colaboração com um cirurgião ou equipe cirúrgica. A aplicação de um protocolo padronizado para coleta de amostras (por exemplo, ressecção de locais in situ consistentes) é essenci.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.