从人骨关节炎膝关节收集和RNA提取

摘要

从全膝关节置换术后的患者获得的原代组织为骨关节炎研究提供了一个实验模型，具有最大的临床可转化性。该协议描述了如何从七个独特的膝关节组织中鉴定，处理和分离RNA，以支持人类骨关节炎的机制研究。

摘要

骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，最常影响膝盖。由于目前尚无治愈方法，全膝关节置换术（TKA）是一种常见的手术干预。使用从TKA获得的原代人OA组织的实验提供了研究 离体疾病机制的能力。虽然OA以前被认为主要影响软骨，但现在已知它会影响关节中的多个组织。该协议描述了来自七个独特组织的患者选择，样品处理，组织均质化，RNA提取和质量控制（基于RNA纯度，完整性和产量），以支持膝关节的疾病机制研究。经知情同意，从接受TKA治疗OA的患者处获得样本。在手术后4小时内通过闪光冷冻RNA或福尔马林固定进行组织学检查，洗涤和储存组织组织。收集的组织包括关节软骨、软骨下骨、半月板、髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜和内侧斜肌。针对每种组织类型测试RNA提取方案。最显著的修饰涉及用于低细胞、高基质、硬组织（被视为软骨、骨骼和半月板）与相对高细胞、低基质、软组织（被视为脂肪垫、韧带、滑膜和肌肉）的崩解方法。研究发现，粉碎适用于硬组织，均质化适用于软组织。观察到一些受试者倾向于在多个组织中产生比其他受试者更高的RNA完整性数（RIN）值，这表明疾病严重程度等潜在因素可能会影响RNA质量。从原代人类OA组织中分离高质量RNA的能力为复杂的基因表达实验（包括测序）提供了生理相关模型，可以导致更容易转化为患者的临床见解。

引言

膝关节是人体最大的滑膜关节，包括胫骨和股骨之间的胫股关节以及髌骨和股骨之间的髌股关节^1。膝盖中的骨骼衬有关节软骨，并由各种结缔组织支撑，包括半月板，脂肪，韧带和肌肉，滑膜封装整个关节以形成充满滑液的腔^1，2，3（图1）。健康的膝盖作为一个移动的铰链关节，允许在额平面^1，3中无摩擦运动。在病理条件下，运动会受到限制和疼痛。最常见的退行性膝关节疾病是骨关节炎（OA）⁴。已知各种危险因素易发生OA发展，包括年龄较大，肥胖，女性，关节创伤和遗传学，除其他外^5，6。目前，美国估计有1400万人患有有症状的膝关节OA，由于人口年龄和肥胖率上升，患病率增加^7，8。OA最初被认为是软骨的疾病，现在被理解为整个关节的疾病^9。OA中通常观察到的病理变化包括关节软骨侵蚀，骨赘形成，软骨下骨增厚和滑膜^{炎症9，10。}由于OA没有已知的治愈方法，治疗主要集中在症状（例如，疼痛）管理^11，12，并且一旦OA进展到终末期，通常需要关节置换手术^13。

关节置换手术可以是部分或全膝关节置换术，全膝关节置换术（TKA）包括置换整个胫股关节和髌股关节。截至2020年，美国每年约有100万个TKA进行¹⁴。在TKA期间，整形外科医生切除胫骨平台的上部和下股骨髁（图2A，2B）以安装假体植入物。有时被患者误解，在TKA中，只有8-10毫米从每块骨头的末端切除，随后用金属覆盖或重新表面。插入的聚乙烯衬垫在两个金属植入物之间形成轴承表面（即衬垫）。此外，关节的几个软组织成分被完全或部分切除，以实现适当的关节平衡。这些组织包括内侧和外侧半月板（图2C），髌下脂肪垫（图2D），前交叉韧带（ACL;图2E）、滑膜（图2F）和内侧斜肌（VMO;图2G）^虽然TKA通常对OA治疗是成功的，但大约20%的患者报告手术后疼痛复发^16。除了手术的高成本和相对侵入性外，这些局限性表明需要进一步研究以确定替代疗法以减轻OA的进展。

为了探索OA中的疾病机制，这些机制可能为治疗干预提供新的途径，可以使用实验系统，包括细胞，组织外植体和动物模型。细胞通常在单层中培养，并且来源于原代人或动物组织（例如，从软骨中分离的软骨细胞）或永生化细胞（例如，ATDC5¹⁷ 和CHON-001^18）。虽然细胞可用于在受控培养环境中操纵实验变量，但它们不能捕获已知影响细胞表型的自然关节条件^19。为了更好地概括OA背后的化学，机械和细胞间通讯的复杂级联反应，在原代人或动物组织样品中发现了一种替代方案，无论是使用新鲜还是 培养的离体 作为外植体，以保留组织结构和细胞微环境^20。为了研究 体内关节，小（如小鼠^21）和大（如马^22）动物模型对OA（如手术诱导、遗传改变或衰老）也是有用的。然而，从这些模型到人类疾病的转化可能受到解剖学，生理学和代谢差异的限制，其中包括²³。考虑到实验系统的优缺点，物种特异性和维持主要人类OA组织提供的细胞外生态位的关键优势最大限度地发挥了研究结果的转化潜力。

原代人类OA组织在TKA之后可以很容易地获得，这使得TKA的高频率成为研究的宝贵资源。潜在的实验应用包括基因表达和组织学分析。为了实现初级人类OA组织在这些研究方法和其他方面的潜力，概述了以下关键考虑因素。首先，患者标本的使用受道德规范的约束，并且协议必须符合机构审查委员会（IRB）的批准^24。其次，人类原发性病变组织固有的异质性以及年龄和性别等变量的影响，使得需要仔细选择患者（即，应用资格标准）和数据解释。第三，关节中不同组织的独特生物学特性（例如，软骨和半月板²⁵的低细胞性）在实验过程中可能会带来挑战（例如，分离高质量和数量的RNA）。本报告解决了这些考虑因素，并提出了患者选择，样品处理，组织均质化，RNA提取和质量控制（即评估RNA纯度和完整性; 图 3）鼓励在研究界使用初级人类OA组织。

研究方案

该研究方案获得批准并遵循亨利福特卫生系统机构审查委员会（IRB #13995）制定的机构指南。

1. 患者选择

1. 从计划与整形外科医生一起接受TKA的患者中确定患者。
2. 根据研究方案定义的合格标准选择患者。纳入标准的示例包括年满 18 周岁且确诊为膝关节骨关节炎。排除标准的例子包括接受部分膝关节置换术或确诊为类风湿性关节炎。
3. 在手术前联系患者以获得知情同意。

2. 样品处理（用于RNA）

注意:在II类生物安全柜中执行所有组织处理，并遵循无菌技术。在处理人体样本时，始终佩戴适当的个人防护用品（丁腈手套、实验室外套、安全护目镜）。在TKA期间会产生几个骨碎片，大量的骨/软骨可能可用于解剖。由于疾病进展，某些骨骼部分的关节软骨变性可能更严重，这可以纳入实验设计。只有要求进行电烙术进行切除的组织才会有热边缘损伤，并且需要协同手术，用手术刀获取大多数组织，以尽量减少损伤。切除的组织必须始终使用无菌PBS保持水分。

1. 用70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理的水以及70%乙醇对所有工作台面和设备进行消毒。用干净、不起毛的纸巾擦去残留的液体。镊子，切骨刀和手术刀在使用前高压灭菌或浸泡在70%乙醇中至少10分钟。当不立即使用时，保持设备浸没在70%乙醇中。
2. 预先标记至少三个冷冻管，每个组织具有去识别的样品名称和等分试样号（例如，TKA-1软骨1）。
   1. 根据大小，形状，颜色和纹理的差异从标本中识别每种组织类型，如图2所示和描述。识别软骨（图2A箭头），骨骼（图2B箭头），半月板（图2C），髌下脂肪垫（图2D），前交叉韧带（图2E），滑膜（图2F）和腭内侧斜肌（图2G）。
3. 隔离关节软骨。
   1. 选择软骨退化最小的骨骼部分。
   2. 使用10号手术刀，尽可能切开软骨深度，以解剖软骨层的全部厚度。
      注意:10号手术刀只能穿透软骨，而不能穿透骨骼。
   3. 使用软骨的全厚度，解剖三个5毫米的立方体。
4. 分离软骨下骨。
   1. 使用从中收集软骨的同一骨骼部分。
   2. 使用10号手术刀，从骨表面刮掉任何剩余的软骨和残留组织。
   3. 握住要用镊子切割的骨头部分，并使用切骨刀切割三个5毫米的立方体。
5. 隔离半月板。
   1. 识别内侧或外侧半月板相对未受损的部分。
   2. 使用10号手术刀和镊子，解剖三个5毫米立方体。
6. 隔离髌下脂肪垫。
   1. 使用10号手术刀和镊子，将组织的黄色部分切成三个大小相等且均匀的部分（每个约500mg）。
7. 隔离前交叉韧带 （ACL）。
   1. 使用10号手术刀和镊子，解剖三个5毫米立方体。
8. 隔离滑膜。
   1. 使用10号手术刀和镊子，通过刮掉脂肪组织，尽可能多地分离膜的粉红色细胞部分。
   2. 解剖三个大小相等且均质的部分（每个约200mg）。
9. 隔离内侧斜肌 （VMO）。
   1. 使用10号手术刀和镊子，从标本中去除任何脂肪组织，只留下红肌组织。
   2. 解剖三个5毫米的立方体。
      注意:组织的初始大小限制了部分的大小。
10. 用无菌PBS冲洗组织部分，以除去任何残留物或碎屑。
11. 要进行组织学检查，请按照 第3部分所述固定每个组织部分。
12. 为了进行RNA提取，将三个组织部分中的每一个切成更小的块（〜1-2毫米   立方体）。
    1. 将较小的碎片转移到2 mL冷冻管中，紧紧固定盖子，通过浸没在液氮中30秒来快速冷冻，然后转移到-80°C冰箱中进行长期储存（在当前方案中测试长达4个月）。对所有组织的所有等分试样重复此操作。
    2. 继续按 第4部分所述进行组织均质化。

3. 样品处理（用于组织学）

注意:福尔马林是一种危险化学品，仅用于化学通风橱。

1. 用10%福尔马林溶液填充预先标记的15 mL锥形管。
2. 使用镊子将组织切片转移到福尔马林填充管中。
3. 将组织在室温下固定在福尔马林中1周，同时尽可能摇动/搅拌。
4. 1周后，将福尔马林丢弃到适当的化学废物处理中，用PBS冲洗组织，然后转移到含有70%乙醇的新鲜15mL锥形管中，在4°C下长期储存，直到嵌入样品进行切片。
   注意:仅适用于骨骼/软骨，请按如下方式进行脱钙。
5. 1周后，将福尔马林丢弃到适当的化学废物处理中，并用PBS冲洗组织。
6. 将组织转移到带有45mL 10%EDTA溶液（pH 7.4）的50mL锥形管中。
7. 如果无法摇晃/搅拌，则倒置试管10-15次，每日一次。
8. 丢弃并更换 EDTA 溶液，每周一次。
   1. 每周两次，用仪器（即刮刀）或戴手套的手指测试纹理，通过观察施加压力时的变形来确认脱钙。骨组织脱钙所需的时间在4-6周的样本之间会有所不同。
9. 脱钙后，用PBS冲洗组织，并转移到含有70%乙醇的新鲜15mL锥形管中，在4°C下长期储存，直到嵌入样品进行切片。

4. 组织均质化

注意:该协议使用有害化学物质苯酚。苯酚的工作必须在化学通风橱中进行。

注意:彻底清洁所有设备和表面，用70%乙醇（浸泡至少10分钟），然后使用RNase去污剂（浸泡至少10分钟），用DEPC处理的水冲洗，用干净的无绒纸巾擦拭，然后用70%乙醇重新喷洒或浸泡。

1. 硬组织均质化（关节软骨、软骨下骨、半月板）
   1. 在均质化之前，使用液氮冷却研钵，杵和刮刀。这些必须尽可能保持低温，以防止样品解冻。
   2. 一次处理一个样品，将其他样品保持在-80°C直至使用。
   3. 使用冷却的刮刀将组织样品转移到砂浆中;将额外的液氮倒在组织顶部，让它蒸发。使用杵压碎组织。反复向组织样品中加入更多的液氮，使其蒸发，然后继续用杵研磨以制成细粉。
   4. 尽可能多地将组织粉末化后，转移到预冷的1.5mL微量离心管中。
      1. 在组织转移之前，通过浸没在液氮中30s来预冷却管。
   5. 向每管中加入1 mL酸性胍苯酚溶液，并将其保持在冰上。
   6. 对每个硬组织样品重复步骤4.1.3-4.1.5。
   7. 在每个组织之后，用70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理的水和额外的浸泡在70%乙醇中清洁研钵，杵和刮刀。用干净、无绒毛的纸巾擦拭任何残留液体。
   8. 将样品在冰上再孵育20分钟。
2. 软组织均质化（髌下脂肪垫、前交叉韧带、滑膜、静脉血氧运动）
   1. 通过运行70%乙醇，RNase去污剂，DEPC处理水和额外的70%乙醇洗涤管对均质器进行消毒，每次30秒。用干净、无绒毛的纸巾擦拭任何残留液体。在每个样品之间重复此操作。
   2. 为每个样品预先贴上 5 mL 圆底管的标签。向每管中加入1 mL酸性胍苯酚溶液。
      1. 一次处理一个样品，保持其他样品在-80°C下处理直至使用。
   3. 将组织转移到带有酸性胍苯酚的预标记的5 mL管中。
   4. 在30秒脉冲中均质化组织，在脉冲期间和脉冲之间保持在冰上。重复此步骤，直到组织在视觉上溶解或最多五个30秒脉冲。
      注意:一些纤维组织（即肌肉）可能无法完全均质化。
   5. 将溶解的组织孵育在冰上，然后移动到下一个样品中。
      1. 按照步骤4.2.1中所述清洁均质器。确保组织块不会留在探针的牙齿中;如果需要，用无菌镊子取出。
   6. 所有样品均质后，在冰上嫳育酸性胍基苯酚20分钟。
   7. 将样品从圆底管转移到预先标记和预冷的1.5 mL微量离心管中。

5. 从组织中提取RNA

注意:本规程使用危险化学品，如苯酚、氯仿和异丙醇。在化学通风橱中执行所有工作。

注意:设备和试剂仅用于RNA工作，并且必须具有适当的化学等级，用于分子应用（即无菌，无核酸酶）。该协议继承了 第4.1部分 和第 4.2 部分的组织均质化方案。彻底清洁所有设备和表面，用70%乙醇使用（浸泡至少10分钟），然后使用RNase去污剂（浸泡至少10分钟）。用DEPC处理过的水冲洗，用干净的无绒纸巾擦拭残留的液体，然后用70%乙醇重新喷涂或浸泡。

1. 在4°C下以10000×g离心微量离心管10分钟以沉淀碎屑。
2. 将上清液转移到新鲜的1.5mL微量离心管中。
   注意:对于脂肪组织，脂质层有时会出现在顶部。通过用移液器吸头刺穿管侧的层来避免转移。
3. 向每个样品中每1mL酸性胍苯酚溶液加入200μL氯仿。用手用力摇晃管子30秒以混合。然后，在冰上孵育2分钟。
4. 在4°C下以10000×g离心样品12分钟。
   注意:离心后，将形成三层:含有RNA的水相，白色DNA间相和底部的粉红色蛋白质相。
5. 将~500μL上层水相转移到新鲜的1.5mL微量离心管中。
   注意:不要干扰相间和蛋白质组分。将这些相储存在-80°C，以备将来进行DNA或蛋白质分离。
6. 向转移的水相中加入等体积的酸-胍-苯酚溶液，通过倒置管8-10次混合。将管子在冰上孵育20分钟。
7. 向每个样品中每1mL酸性胍苯酚溶液加入200μL氯仿。用手剧烈摇晃30秒，混合，然后在冰上孵育2分钟。
8. 在4°C下以10000×g离心样品12分钟。
9. 将<500μL水相转移到新鲜的微量离心管中，注意不要用其他相污染样品。
   注意:使用适当的危险材料处理方法丢弃剩余的相。
10. 向每个样品中加入等体积（作为水相）100%异丙醇。倒置管8-10次混合。在冰上孵育5分钟。
    1. 向每个样品加入1μL糖原共沉淀剂，以帮助在离心后定位RNA沉淀。
11. 在4°C下以12000×g离心样品25分钟。
12. 在管中定位颗粒（如果使用共沉淀剂，它将显示为蓝色）。小心地倒出上清液。
13. 通过向每个样品中加入1mL冰冷的75%乙醇来洗涤沉淀，涡旋以将沉淀从管的底部移开。
    注意:使用分子级纯乙醇和无核酸酶水制备75%乙醇。
14. 在4°C下以7000×g离心5分钟。 小心地倒出上清液。
15. 再重复步骤 5.13 和 5.14 两次。
16. 快速旋转（<2000 x g 持续 5 秒），将任何残留液体带到管底部。使用P20移液器从管底部除去任何残留的乙醇。
    1. 避免用移液器吸头接触RNA沉淀。在样品之间更换吸头。
17. 打开管盖，在室温下风干样品10分钟。
    注意:颗粒在干燥时可能会变得半透明。确保所有残留的乙醇蒸发将提高RNA纯度。
18. 向每个管中加入25μL无核酸酶水以溶解沉淀。
19. 在室温下孵育5分钟。
20. 轻轻地上下移液以混合RNA。
21. 将5μL样品等分到新鲜管中进行质量控制分析（第6部分）。将剩余的20μL储存在-80°C下用于基因表达测定。

6. 质量控制

1. 根据制造商的说明，使用分光光度计确定RNA的浓度和纯度。
2. 根据制造商的说明，使用电泳装置确定RNA完整性。
   注意:将RNA稀释至在芯片检测限范围内。

结果

七种独特的人类膝关节组织可供接受TKA治疗OA的患者收集（图1）。在该协议中，这些组织中的每一个都被鉴定并在手术切除后的4小时内进行处理（图2）。按照 图3中概述的步骤，每个组织的一部分被福尔马林固定用于组织学评估（图4），而其他部分则被速冻以进行RNA分离。通过崩解方法（分别为粉碎与均?...

讨论

所提出的方案已被证明可以成功地收集七种主要的人类OA组织进行RNA提取（表1）和组织学处理（图4）。在收集患者样本之前，有必要建立IRB批准的方案，最好是与外科医生或手术团队合作。应用标准化的实验方案进行标本采集（例如，从一致的原位位置切除）对于最大限度地提高实验再现性至关重要。组织样本应装在无菌容器中运输到实验室，并在手术?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Eppendorf	05 402	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
10% Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Store in chemical cabinet when not in use.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	ICN19400290	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	BP2818500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)	Fisher Scientific	AC327272500	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use.
100% Reagent Alcohol	Cardinal Health	C4305	Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes.
15 cm sterile culture dishes	Thermo Scientific	12-556-003	Sterile, nuclease-free.
15 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	14 959 53A	Sterile, nuclease-free.
2 mL cryovials (externally threaded)	Fisher Scientific	10 500 26	Sterile, nuclease-free.
5 mL round-bottom tubes	Corning	352052	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
50 mL polypropylene (Falcon) tubes	Fisher Scientific	12 565 271	Sterile, nuclease-free.
Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	For RNA integrity measurement.
Biosafety Cabinet	General lab equipment
Bone Cutters	Fisher Scientific	08 990	Sterilized with 70% EtOH.
Chemical Fume Hood	General lab equipment
Disposable Scalpels (No.10)	Thermo Scientific	3120032	Sterile, nuclease-free.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	10% solution with dH2O.
Forceps	Any vendor		Sterilized with 70% EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Reserved for RNA work only, store at -20 °C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Liquid Nitrogen	Any vendor
Liquid Nitrogen Dewar	General lab equipment
Mortar and Pestle	Any vendor		Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	For RNA purity and yield measurements.
Nuclease-free/DEPC-treated water	Fisher Scientific		Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.
PBS (Sterile)	Gibco	20 012 050	Sterile, nuclease-free.
Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips	Any vendor		Sterile, nuclease-free.
Plasma/Serum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Refrigerated Centrifuge 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Sterile, nuclease-free.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatula (semimicro size)	Any vendor		Reserved for RNA work only.
Tissue homogenizer	Pro Scientific	01-01200	Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol.
TRIzol Reagent	Fisher Scientific	15 596 026	Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only.