عزل نشط Caenorhabditis elegans استخراج النووية وإعادة تشكيل للنسخ في المختبر

Summary

هنا، نقوم بوصف بروتوكول مفصل لعزل المستخلص النووي النشط من المرحلة الرابعة من اليرقات وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر .

Abstract

كان Caenorhabditis elegans نظاما نموذجيا مهما للأبحاث البيولوجية منذ عرضه في عام 1963. ومع ذلك، لم يتم استخدام C. elegans بشكل كامل في الدراسة الكيميائية الحيوية للتفاعلات البيولوجية باستخدام مستخلصاتها النووية مثل النسخ المختبري وتكرار الحمض النووي. هناك عقبة كبيرة أمام استخدام سي إليغانس في الدراسات الكيميائية الحيوية هي تعطيل الجلد الخارجي السميك للنيماتودا دون التضحية بنشاط المستخلص النووي. في حين يتم استخدام العديد من الطرق لكسر كتيكل، مثل تجانس دونس أو سونيكيشن، فإنها غالبا ما تؤدي إلى عدم استقرار البروتين. لا توجد بروتوكولات راسخة لعزل البروتينات النووية النشطة عن اليرقات أو البالغين C. elegans لتفاعلات المختبر. هنا ، يصف البروتوكول بالتفصيل تجانس المرحلة 4 C. elegans اليرقات باستخدام متجانس بالش. يستخدم المتجانس بالش الضغط لإجبار الحيوانات ببطء من خلال فجوة ضيقة تكسر السفاح في هذه العملية. يسمح التصميم الموحد والآلات الدقيقة للمتجانس بالش بطحن الحيوانات بشكل متسق بين التجارب. تجزئة المتجانسة التي تم الحصول عليها من المتجانس بالش تسفر عن استخراج النووية النشطة وظيفيا التي يمكن استخدامها في طريقة في المختبر لاقتناص نشاط النسخ من elegans C.

Introduction

الصغيرة، والعيش الحر النيماتودا Caenorhabditis elegans هو كائن نموذجي بسيط ولكن قوية لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. منذ إدخالها في عام 1963 ، كانت الديدان الخيطية لا تقدر بثمن للإجابة على الأسئلة في علم الأعصاب والتمثيل الغذائي والشيخوخة والتنمية والمناعة وعلم ^{الوراثة1}. بعض من العديد من الخصائص الحيوانية التي تجعل من كائن نموذجي مثالي تشمل وقت الجيل القصير، وفعالية تدخل الحمض النووي الريبي، والجسم الشفاف، والخرائط المكتملة لكل من النسب الخلوي والجهاز العصبي.

في حين أن مساهمات النيماتودا في العلوم واسعة ، إلا أنها لم تستخدم بشكل كاف لتوضيح نظام النسخ النواخي ، مع معظم فهمنا حول هذه الآليات القادمة من الدراسات باستخدام الاستخراج النووي من الخميرة وذبابة الفاكهة وثقافة خلايا ^{الثدييات2}. أكبر عقبة تثني الباحثين عن استخراج استخراج نووي وظيفي هو لطيف النيماتود الخارجي الصعب. يتكون هذا الهيكل الخارجي من الكولاجينات المتقاطعة و البشرة و البروتينات الجليكوبروتينية والدهون ، مما يجعل C. elegans من مرحلة اليرقات إلى مرحلة البلوغ مقاوما لاستخراج البروتين عن طريق القوى الكيميائية أو الميكانيكية3. وقد تم تطوير نظام نسخ في المختبر باستخدام مستخلص C. elegans النووي مرة واحدة ولكن لم يتم اعتماده على نطاق واسع بسبب النطاق المحدود للنظام ، واستخدام Dounce homogenizer لإعداد المستخلص يمكن أن يؤدي إلى عدم استقرار ^{البروتين4،5}.

على عكس البروتوكول السابق لعزل الاستخراج النووي الذي استخدم متجانس Dounce لكسر C. elegans ، يستخدم هذا البروتوكول متجانس Balch. يتكون المتجانس بالش من مكونين رئيسيين: كرة كربيد التنغستن وكتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ مع قناة بالملل من نهاية إلى أخرى. يتم تحميل المتجانس بالش مع الكرة كربيد التنغستن وتوج على جانبي لختم غرفة طحن. يمكن تحميل المحاقن على المنفذين العموديين المؤديين إلى غرفة الطحن. كما يتم تمرير المواد من حقنة واحدة إلى أخرى من خلال غرفة طحن، والضغط من المحاقن يجبر المواد من خلال فجوة ضيقة بين الكرة وجدار الغرفة. هذا الضغط البطيء والمستمر يكسر المادة حتى تصل إلى حجم ثابت قادر على المرور عبر الفجوة الضيقة بسهولة. إجبار C. elegans من خلال الفجوة الضيقة عبر ضغط ثابت بعد لطيف يكسر الحيوانات مفتوحة، والإفراج عن محتواها في المخزن المؤقت المحيطة بها. تبديل أحجام الكرة يزيد من تضييق الفجوة، وكسر الخلايا الصادرة حديثا ويحرر النوى في المخزن المؤقت. وتفصل حالات متعددة من الطرد المركزي النوى عن بقية حطام الخلية، مما يسمح بجمع مستخلص نووي نظيف. ويفضل المتجانس بالش على التجانس Dounce لعدة أسباب: يمكن للنظام التعامل مع عدد كبير من الحيوانات، مما يجعل من الممكن لاستخراج كمية عالية من البروتينات النشطة في محاولة واحدة. الآلات الدقيقة للكرات وكتلة الصلب يسمح لطحن متسقة بين عينات متعددة؛ كتلة الصلب الثقيلة بمثابة بالوعة الحرارة، ورسم الحرارة بشكل موحد بعيدا عن غرفة طحن، ومنع التدهور.

بعد العزل، يجب التحقق من نشاط النسخ المستخلص النووي قبل استخدامه في أي تجارب بيوكيميائية. تقليديا، تم قياس نشاط النسخ باستخدام النيوكليوتيدات التي تم تصنيفها إشعاعيا لتتبع وتصور الحمض النووي الريبي المركب حديثا. ومع ذلك، يمكن أن يكون وضع العلامات المشعة مرهقا لأنه يتطلب الحذر أثناء الاستخدام ^{والتخلص6}. تسمح التطورات التكنولوجية للباحثين اليوم باستخدام أساليب أقل ضررا أو إزعاجا لقياس حتى كميات الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام تقنيات مثل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)⁷. هنا، يصف البروتوكول طريقة لعزل الاستخراج النووي النشط من المرحلة اليرقات 4 (L4) C. elegans وتصور نشاط النسخ في نظام المختبر.

Protocol

1. الاستعدادات الإعلامية

1. إعداد مرق الليوجيني العقيم (LB) لوحات أجار والوسائط السائلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. سلالة Streak Escherichia coli (الإشريكية القولونية) OP50 على طبق أجار LB. احتضان سلسلة البكتيريا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
3. تخزين لوحة E. coli OP50 المتتالية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد الحضانة. يمكن تخزين لوحة E. coli OP50 بأمان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين إذا كانت ملفوفة في البارافيلم لمنع فقدان الرطوبة.
4. إعداد 2 L من وسائل الإعلام نمو النيماتودا (NGM) باستخدام وصفة في الجدول 1.
   ملاحظة: نيستاتين اختياري. النيستاتين يساعد على منع العفن، وغيرها من اللوث الفطرية من النمو على لوحات NGM. لوحات كبيرة قطرها 150 ملم لديها فرصة أكبر للقبض على الجراثيم الفطرية عندما تتم إزالة الغطاء لصب وبذر E. القولونية OP50. يمكن شراء النيستاتين مسبقا في محلول معقم من البائعين بسعر 10,000 وحدة / مل أو يمكن شراؤه كمسحوق معقم ومختلط بالماء العقيم. لا يمكن أن يكون النيستاتين autoclaved، ولا يمكن أن يكون على نحو فعال تصفية تعقيمها. الاهتمام بتقنية العقيم أمر بالغ الأهمية في حين خلط حل النيستاتين في المختبر. أوتوكلاف 1 M _CaCl2، 1 M _KPO4 درجة الحموضة 6.0، و 1 M MgSO4 في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تصفية تعقيم الكوليسترول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر بعد أن حلت في الإيثانول 95٪.
5. بعد إضافة الكواشف إلى وسائل الإعلام، صب NGM في أربعين أطباق بيتري 150 ملم. كل طبق 150 ملم يتطلب 50 مل لملء. دع لوحات NGM تبرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
6. تلقيح اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل تحتوي على 25 مل من LB معقمة مع E. coli OP50 من لوحة خط السابقة. احتضان مرق في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة تهتز الحفاظ عليها في 200 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: للاتساق، تلقيح كلا الأنبوبين مع نفس مستعمرة واحدة من لوحة خط. إذا ثبت أن هذا صعب، قم بتطعيم 5 مل من LB العقيم مع مستعمرة واحدة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل واحتضان الثقافة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز تم الحفاظ عليها عند 200 دورة في الدقيقة في اليوم السابق لإعداد لوحات NGM. تخزين الثقافة السائلة الطازجة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين. تلقيح اثنين من 25 مل من مرق مع 25 ميكرولتر من الثقافة السائلة واحتضان تحت نفس الشروط المذكورة أعلاه.
7. البذور الطازجة لوحات NGM مع 1 مل من الطازجة E. القولونية OP50 الثقافة السائلة وانتشرت مع انتشار اللهب المعقمة بالتساوي عبر سطح لوحة مطهر لخلق حديقة البكتيريا الكبيرة التي تغطي غالبية لوحة، مع الحرص على عدم نشر البكتيريا من الحافة إلى الحافة. السماح لE. القولونية OP50 لتنمو في درجة حرارة الغرفة لمدة 72-96 ساعة أو حتى يظهر حديقة سميكة بشكل واضح.
   ملاحظة: بعد 24 ساعة، نقل لوحات NGM المصنف حديثا إلى حاوية مغطاة للحد من فقدان الرطوبة وإطالة عمر لوحات.

2. الاستعدادات الحيوانية وتزامن التبييض

1. نقل 5 تغذية جيدة، البرية من نوع، gravid الكبار C. elegans إلى كل من لوحات NGM الطازجة 10 بذر مع E. القولونية OP50، لما مجموعه 50 الحيوانات.
2. السماح للحيوانات لوضع البيض. دع ذرية تنمو في 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة الكبار gravid.
3. استخدام 15 مل من العازلة M9 (الجدول 2) لجمع جديدة جيدة تغذية البرية من نوع, البالغين gravid من لوحات الصيانة العشرة ونقل الحيوانات إلى أنبوب مخروطي المسمى 15 مل.
4. الطرد المركزي الحيوانات في 1000 × ز لمدة 3 دقائق لبيليه جميع الحيوانات في الجزء السفلي من الأنبوب.
5. في أنبوب مخروطي منفصل، يحمل علامة 15 مل، اخلط 2 مل من التبييض مع 5 مل من 1 N NaOH لمزامنة التبييض. دوامة الحل لخلط جيدا.
   ملاحظة: استخدم محلول التبييض + NaOH في نفس اليوم الذي يكون فيه جاهزا ليكون فعالا.
6. إزالة بلطف supernatant من الحيوانات الطرد المركزي باستخدام ماصة معقمة 10 مل. محاولة لإزالة أكبر قدر ممكن من العازلة M9 لتحسين كسر الحيوانات.
7. إضافة 500 ميكرولتر من محلول التبييض + NaOH إلى بيليه الحيوان وبدء جهاز توقيت لمدة 4 دقائق.
8. إما باليد أو باستخدام الروك، صخرة بلطف أنبوب لكسر بيليه الحيوان تماما والسماح للحيوانات تتحرك بحرية في محلول التبييض + NaOH. مواصلة هزاز الأنبوب لمدة 4 دقائق كاملة.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية محلول التبييض + NaOH المطلوب اعتمادا على حجم بيليه الحيوان الذي تتم مزامنة. تحسين هذه التقنية مسبقا مع كميات متفاوتة من الحيوانات والتبييض + NaOH الحل.
9. بعد 4 دقائق، تحقق من كفاءة كسر تحت المجهر تشريح. تأكد من كسر غالبية الحيوانات البالغة المرقة ، والإفراج عن محتوياتها الداخلية ، بما في ذلك البيض.
10. إذا لم يتم تقسيم الحيوانات مفتوحة، دوامة لفترة وجيزة الأنبوب في أقصى سرعة، ثم تحقق مرة أخرى تحت المجهر.
    ملاحظة: في حين أن البيض مقاومة للمحلول التبييض + NaOH، فهي ليست منيعة. يجب عدم تعرض البيض لمحلول التبييض + NaOH لفترة أطول من اللازم. المماطلة لفترة طويلة جدا خلال خطوة كسر الحيوان يمكن أن يؤدي إلى مشاكل في النمو للذرية.
11. إضافة 10 مل من المخزن المؤقت M9 إلى حل animal مكسورة.
12. طرد مركزي البيض وبقايا في 1000 × غرام لمدة 3 دقائق.
13. ماصة العملاق بعيدا، مع التأكد من عدم لمس بيليه جديدة تحتوي على جميع البيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
14. إضافة 10 مل أخرى من العازلة M9 والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 3 دقائق في 1000 x ز.
15. كرر الخطوات 2.13-2.14 مرتين إضافيتين لضمان عدم بقاء أي من محلول التبييض + NaOH.
16. بعد غسل المخزن المؤقت M9 الثالث، قم بإزالة الناطقة الخارقة وأضف 10 مل من المخزن المؤقت S-basal (الجدول 2).
17. عكس أنبوب لكسر بيليه في الجزء السفلي لتعليق البيض على قدم المساواة في المخزن المؤقت.
18. ضع الأنبوب على الروك والصخور بلطف أنبوب لمدة 22 ساعة في 20 درجة مئوية للسماح للبيض يفقس والوصول إلى المرحلة اليرقات 1 (L1) اعتقال.
19. بعد 22 ساعة، طرد مركزي أنبوب يحتوي على الحيوانات L1 متزامنة لمدة 3 دقائق في 1000 x ز.
20. ماصة والتخلص من supernatant ترك ما يقرب من 1 مل من العازلة في الأنبوب.
21. باستخدام micropipette، تعكر صفو بيليه الحيوان لجعل تعليق متجانسة من الحيوانات L1 في العازلة المتبقية.
22. نقل قطرة واحدة من التعليق المتجانس للحيوانات L1 إلى لوحة NGM 150 ملم المسمى بذر مع E. coli OP50.
23. حساب كثافة الحيوان لكل قطرة عن طريق عد بصريا عدد الحيوانات L1 لكل قطرة باستخدام المجهر تشريح. يمكن للوحة NGM مقاس 150 مم مع حديقة كاملة النمو من E. coli OP50 دعم ما يصل إلى 500 من مرحلة L1 للوصول إلى مرحلة البالغين المرق.
24. نقل الحيوانات L1 إلى ست لوحات NGM 150 ملم مع E. coli OP50. تأكد من عدم إثقال اللوحة.
    ملاحظة: إذا كان من غير الواضح ما إذا كانت الحيوانات سيكون لديها ما يكفي من الغذاء للتنمية بين L1 والبالغين gravid، إضافة عدد أقل من الحيوانات إلى كل لوحة واستخدام المزيد من لوحات.
25. السماح للحيوانات لتنمو لمدة 72 ساعة في 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة الكبار gravid والبدء في وضع البيض.
26. إجراء جولة ثانية من تزامن التبييض على الحيوانات البالغة المتزامنة والغذاء بشكل جيد من النوع البري.
27. ضع L1 المتزامنة على عشرة لوحات NGM مقاس 150 مم بذرها E. coli OP50 ، مع ما يقرب من 1000 لكل طبق.
28. السماح للحيوانات L1 متزامنة جديدة لتنمو لمدة 48 ساعة في 20 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4.
    ملاحظة: الهدف هو الحصول على حوالي 700 - 800 ميكرولتر بيليه من الحيوانات L4. يمكن أن تجعل الكثير من الحيوانات من الصعب استخدام المتجانس بالش. وهذا يمكن أن يؤدي إلى إجهاد العضلات أثناء تشغيل المتجانس والتسرب المحتمل من المحاقن بسبب زيادة الضغط.

3. إعداد المتجانس بالش

1. إعداد كل من المخازن المؤقتة هيتونيك وفرط الطنين كما هو مذكور في الجدول 3 والجدول 4.
   ملاحظة: يمكن إعداد المخازن المؤقتة الهكتونية والهايبرتونية مسبقا وتخزينها بأمان عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
2. تنظيف المتجانس بالش عن طريق إغراق غرفة طحن مع الإيثانول 70٪، ثم شطف الغرفة مع الماء deionized لإزالة الإيثانول الزائد.
   ملاحظة: تجنب استخدام أي عوامل كاوية لتنظيف متجانس بالش. وينبغي أن يكون الشطف الشامل مع الإيثانول والمياه deionized كافية لتنظيفه.
3. أدخل 7.9820 مم (18 ميكرومتر إزالة الفجوة) التنغستن كربيد الكرة في غرفة طحن.
4. قم بسقف كل طرف من برميل المتجانس بالش وتأمين القبعات باستخدام أطقم الإبهام المقدمة.
5. إعداد 5 مل من "العازلة هيبوتونيك كاملة" لكل عينة: إضافة 5 ميكرولتر من 1 M DTT (التركيز النهائي: 1 mM DTT) و 100 ميكروغرام من مثبط 100x بروتياز، كوكتيل أحادي الاستخدام (التركيز النهائي: 2x). أبقي المخزن المؤقت على الجليد
6. إعداد 5 مل من "العازلة هايبرتونيك كاملة" لكل عينة: إضافة 5 ميكرولتر من 1 M DTT (التركيز النهائي: 1 mM DTT) و 100 ميكروغرام من مثبط 100x بروتيز، كوكتيل أحادي الاستخدام (التركيز النهائي: 2x). أبقي المخزن المؤقت على الجليد
   ملاحظة: استخدم المخزن المؤقت الهكتونية و hypertonic كاملة في نفس يوم التحضير. لا تخزنه للاستخدام لاحقا. تخزين 1 M DTT كما aliquots ذات الاستخدام الواحد في -20 درجة مئوية. تخزين البروتيز مثبط كوكتيل واحد الاستخدام في 4 °C.
7. ملء حقنة معقمة 2 مل مع 1 مل من "العازلة هيبوتونيك كاملة" وتدفق بلطف غرفة طحن من المتجانس بالش. ترك ما يقرب من 500 ميكرولتر من "العازلة هيبوتونيك كاملة" في الغرفة.
8. تخزين التجانس مسح على الجليد والسماح لها تبرد لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يجب أن يكون المتجانس باردا قبل طحن الحيوانات. يمكن أن تنتج عملية الطحن الحرارة بسبب الاحتكاك وإزالة البروتينات النووية. تأكد من أن المتجانس المعدني بارد الجليد للمساعدة في منع حدوث ذلك. تأكد من تجنب أي ماء من الجليد المحيط من دخول المتجانس. استخدام اثنين من المحاقن المعقمة لسد الثقوب في المتجانس ومنع أي سوائل غير مقصودة من دخول غرفة الطحن.

4. مجموعة من الحيوانات

ملاحظة: يتم توفير دليل مرجعي سريع، بمناسبة الخطوات الرئيسية لجمع، وتعطيل، وتشريع الحيوانات (الشكل 1).

1. جمع الحيوانات L4 تغذية جيدة مع المخزن المؤقت M9 في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي الحيوانات في 1000 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة supernatant ومواصلة غسل بيليه الحيوان حتى يكون supernatant واضحة.
2. غسل الحيوانات مع 3 مل من 4 درجة مئوية عازلة هيبوتونيك والطرد المركزي مرة أخرى في 1000 × ز لمدة 3 دقائق.
   ملاحظة: أثناء الغسيل النهائي مع العازلة هيبوتونيك 4 درجة مئوية، قد الحيوانات التمسك جانب الأنبوب. هذا أمر طبيعي وقد يؤدي إلى فقدان صغير للحيوانات أثناء إزالة الناسخة.
3. إزالة العازلة hypotonic وإضافة 1 مل من "العازلة هيبوتونيك كاملة" إلى بيليه الحيوان. نقل تعليق الحيوان إلى حقنة معقمة جديدة 2 مل.
   ملاحظة: أثناء نقل الحيوانات إلى المحقنة باستخدام micropipette، ماصة بلطف محلول Tween20 0.1٪ معقمة لمعطف داخل طرف ماصة للحد من عدد الحيوانات المفقودة بسبب التمسك جدران تلميح ماصة.

5. الكسر

1. على الجليد، تجانس الحيوانات عن طريق دفع بلطف الحيوانات من خلال غرفة طحن التجانس بالش محملة الكرة 7.9820 ملم وإلى حقنة معقمة جديدة. كرر دفع الحيوانات من خلال غرفة الطحن لمدة 30 دورة كاملة.
   ملاحظة: يتم تعريف "دورة كاملة" كحركة كاملة صعودا وهبوطا من المكبس حقنة.
   تستخدم هذه الخطوة الطحن 7.9820 مم الكرة (18 ميكرومتر حامل الكرة).
2. بعد 30 دورة، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من تعليق الحيوان من المتجانس بالش وتخزين الحقنة، وتلميح أسفل في الأنابيب الدقيقة 1.7 مل.
3. إزالة الكرة 7.9820 مم من غرفة طحن وتنظيفه مع الماء deionized. الجافة والعودة الكرة إلى أنبوب المسمى.
4. أدخل الكرة 7.9880 مم (12 ميكرومتر إزالة الفجوة) في غرفة الطحن وإعادة ختم المتجانس.
5. اغسل غرفة الطحن مرة أخرى مع 1 مل من الجليد البارد "العازلة تحت الحجرية كاملة".
6. طحن تعليق لمدة 25 دورات كاملة.
7. بعد 25 دورة، قم بإزالة تعليق الحيوان من متجانس بالش، ونقل التعليق إلى أنابيب دقيقة نظيفة سعة 1.7 مل، وتخزينه على الجليد.
   ملاحظة: تفكيك وتنظيف المتجانس بالش مع الإيثانول 70٪ والمياه deionized. تأكد من إعادة الكرة 7.9880 ملم إلى أنبوب السليم.
8. بيليه الحيوانات الجثث والحطام عن طريق الطرد المركزي تعليق في 500 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
9. ماصة 40 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب المسمى 'جزء الإدخال' وتخزينها على الجليد.
   ملاحظة: اكتب كافة التسميات بقلم مقاوم للكحول لتجنب تشويهها لاحقا.
10. نقل الناطقة المتبقية إلى أنبوب جديد 1.7 مل، مع الحرص على تجنب لمس بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب ومن ثم التخلص من بيليه.
11. الطرد المركزي العملاقة بيليه النوى في 4000 س غ ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
12. نقل supernatant، الحرص على عدم تعكير صفو النوى بيليه، إلى أنبوب 1.7 مل جديدة وتسمية الأنبوب بأنه "كسر السيتوسوليك".
    ملاحظة: الطرد المركزي كسر السيتوسوليك أبعد من ذلك في 17،000 × ز، 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة أي مادة غير قابلة للذوبان المتبقية، واستخدامه كتحكم سلبي لللطخات الغربية (خصيصا للبروتينات النووية).
13. غسل بيليه النوى مع 500 ميكرولتر من "العازلة هيبوتونيك كاملة" ونقل بيليه إلى أنبوب جديد 1.7 مل. طرد مركزي بيليه علقت في 4000 س غ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
14. تجاهل supernatant وإضافة 500 ميكرولتر من جديد 'العازلة هيبوتونيك كاملة' إلى بيليه النووية ونقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.7 مل. طرد مركزي العينة مرة أخرى في 4000 س غ، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
15. إزالة supernatant وتذوب بيليه في 40 ميكرولتر من "العازلة فرطتونية كاملة". نقل التعليق النووي الجديد إلى أنبوب جديد 1.7 مل، وتسمية الأنبوب بأنه "كسر النووية"، وتخزينه على الجليد.
16. تحديد تركيز البروتين من الكسور الثلاثة باستخدام عدة الفلورسنت القياس الكمي.
    ملاحظة: يمكن أن تتراوح كمية البروتين النووي المكتسبة من هذه الطريقة من 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر.
17. Aliquot الكسور النووية في أنابيب ذات استخدام واحد تحتوي على 6 ميكروغرام من البروتين النووي وتجميد المفاجئة في الجليد الجاف وحمام الإيثانول. يخزن عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامه مرة أخرى.

6. المقايسة النسخ

1. تشغيل وتسخين كتلة الحرارة إلى 30 درجة مئوية.
2. إزالة ما يلي من استخراج Nulcear في نظام النسخ المختبري : 50 mM _MgCl2, استخراج النووية 1x النسخ العازلة, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP, وCMV المروج قالب التحكم الإيجابي. ذوبان على الجليد.
   ملاحظة: تضخيم قالب الحمض النووي للتحكم الإيجابي باستخدام بوليمراز عالي الدقة وتخزينه ك ayquots عادية ذات استخدام واحد.
3. قم بمزج أجهزة rNTPs المذابة وطاردتها قبل إعداد حل عمل 10 mM.
   ملاحظة: أضف 2 ميكرولتر من كل rATP و rCTP و rGTP و rUTP إلى 12 ميكرولتر من _H2O لتحقيق 10 mM من كل rNTP. ويمكن توسيع نطاق هذا التكوين إذا لزم الأمر.
4. Aliquot خليط rNTP إلى أنابيب ذات استخدام واحد المسمى وتخزينها في -20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
5. في أنبوب جديد 1.5 مل المسمى "Mastermix" إضافة الكواشف لكل رد فعل على النحو المذكور في الجدول 5
6. نقل 14 ميكرولتر من Mastermix إلى كل أنبوب رد فعل
7. إضافة 11 ميكرولتر ناقص (حجم ل5 ميكروغرام من الاستخراج النووي) من 1x النسخ العازلة إلى كل أنبوب رد فعل.
8. إضافة 5 ميكروغرام من الاستخراج النووي إلى كل أنبوب رد فعل.
9. اضغط بلطف على أنبوب التفاعل لخلط المحتويات داخل ونبض الطرد المركزي الأنابيب بعد خلط لضمان عدم وجود مادة رد فعل عالقة على جدار الأنابيب.
10. احتضان ردود الفعل في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
11. وقف رد الفعل فورا بإضافة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت RLT التي تقدمها عدة استخراج الجيش الملكي النيبالي.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، من الآمن إيقاف. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى يتم تنظيفها باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي.

7. RNA تنظيف

1. إعداد DNase I الأسهم الحل باستخدام مجموعة DNase RNase خالية المنصوص عليها في عدة استخراج الجيش الملكي النيبالي. حل DNase lyophilized I في 550 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. مزيج بلطف الحل. لا دوامة . Aliquot حل DNase I في أنابيب 10 μL ذات الاستخدام الواحد وتخزين aliquots في -20 درجة مئوية.
2. إعداد الإيثانول 70٪ و 80٪ باستخدام الإيثانول الجزيئية الصف والمياه الخالية من RNase.
3. نقل العينات والكواشف إلى مساحة عمل خالية من RNase قبل بدء التنظيف.
4. إضافة 400 ميكرولتر من الإيثانول 70٪ إلى كل عينة وماصة بلطف لخلط جيدا.
5. نقل 400 ميكرولتر من العينة إلى عمود تدور استخراج الحمض النووي الريبي المسمى مع أنبوب جمع 2 مل والطرد المركزي العينة في 8500 × غرام لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
6. كرر الخطوة 7.5 مع العينة المتبقية وتجاهل التدفق من خلال.
7. إضافة 350 ميكرولتر من RW1 العازلة (RNA استخراج عدة) إلى كل عمود. طرد مركزي الأعمدة في 8500 س ز لمدة 30 s. تجاهل التدفق من خلال.
8. إضافة 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت RDD (RNA استخراج عدة) إلى واحد 10 ميكرولتر aliquot من DNase I حل الأسهم ومزيج بلطف. لا دوامة.
9. أضف مزيج حضانة DNase I (80 ميكرولتر) مباشرة إلى غشاء العمود الدوار. احتضان الأعمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: تأكد من إضافة حل DNase I إلى الغشاء. تجنب فقدان جزء من الحل لجدار العمود أو O-ring.
10. بعد 15 دقيقة، أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 إلى الأعمدة. جهاز طرد مركزي لمدة 30 s عند 8,500 x g. تجاهل التدفق من خلال.
11. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع 2 مل جديدة. إضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت RPE (عدة استخراج الجيش الملكي النيبالي) إلى العمود تدور. الطرد المركزي الأعمدة في 8500 × ز لمدة 30 ق لغسل الغشاء. تجاهل التدفق من خلال.
12. إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول 80٪ إلى كل عمود والطرد المركزي الأعمدة في 8500 × ز لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
13. ضع الأعمدة في أنابيب تجميع 2 مل جديدة. ترك أغطية العمود مفتوحة، والطرد المركزي الأعمدة في 17900 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل التدفق من خلال.
14. ضع الأعمدة في أنابيب 1.7 مل المسماة. أضف 17 ميكرولتر من المياه الخالية من الرناز مباشرة إلى مركز غشاء العمود الدوار. دع الأعمدة ترتاح في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. طرد مركزي الأعمدة في 17900 س غ لمدة دقيقة واحدة.
15. تجاهل العمود والحفاظ على أنبوب 1.7 مل مع عينة الحمض النووي الريبي النقي حديثا.

8. هضم الحمض النووي

1. سخني كتلتين حراريتين عند 37 درجة مئوية و65 درجة مئوية.
2. إضافة 2 ميكرولتر من 10x رد فعل المخزن المؤقت لكل عينة.
3. إضافة 1 ميكرولتر (1 MBU) من DNase إلى كل عينة.
4. تعيين ماصة إلى 10 ميكرولتر وماصة الحل الجديد صعودا وهبوطا لخلط بلطف. لا دوامة.
5. احتضان عينات الحمض النووي الريبي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم أي الحمض النووي المتبقية.
6. تعطيل DNase عن طريق احتضان العينات على كتلة الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: من الآمن التوقف عند هذه الخطوة وتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لإجراء النسخ العكسي لاحقا.

9. النسخ العكسي

1. عند برمجة دراجة حرارية، أضف خطوة إضافية 1 ساعة و 37 درجة مئوية قبل الحضانة لتسخين دورة الحرارة. تشغيل البرنامج مع 'خطوة سخني' أثناء إعداد العينات والسماح لther thermocycler تصل إلى 37 درجة مئوية. عندما تكون العينات للنسخ العكسي جاهزة، قم بتخطي خطوة التسخين المسبق 37 درجة مئوية وانتقل إلى خطوة الحضانة الفعلية (الجدول 6). إذا لم يكن لدى المدور الحراري ميزة تخطي، أضف خطوة 1 دقيقة 37 درجة مئوية قبل الحضانة. السماح لثيرموسيكلر للحرارة إلى درجة الحرارة المناسبة قبل التوقف عن النظام وإضافة عينات المعدة.
2. إعداد حل عمل 10 ميكرومتر من التمهيدي عكس النسخ في RNase خالية _H2O وتخزينه على الجليد.
3. ذوبان الجليد، 10x العازلة من عدة النسخ العكسي، مزيج dNTP (5 mM كل dNTP)، RNase المانع، والنسخ العكسي.
4. إعداد Mastermix (لكل رد فعل) عن طريق إضافة المكونات المذكورة في الجدول 7 في أنبوب PCR 0.2 مل نظيفة.
5. Aliquot 18 ميكرولتر من Mastermix في أنابيب PCR 0.2 مل جديدة لكل عينة.
6. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي DNase المعالجة لكل عينة في أنابيب المسمى على التوالي.
7. احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دراجة حرارية مسخنة.
8. نقل العينات إلى -20 درجة مئوية لتخزين بعد النسخ العكسي أو المضي قدما مباشرة إلى الخطوة التالية.
   ملاحظة: من الآمن إيقاف عند هذه الخطوة; تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.

10. تضخيم المنتج محددة

1. ذوبان الجليد: cDNA، 10 ميكرومتر النسخ إلى الأمام و 10 ميكرومتر النسخ التمهيدي عكس، وPCR 2x بريميكس A.
   ملاحظة: Aliquot في PCR 2x بريميكس A إلى وحدات تخزين أصغر لتقليل وقت ذوبان الجليد.
2. إنشاء Mastermix (لكل رد فعل) عن طريق إضافة المكونات المذكورة في الجدول 8 في أنبوب PCR نظيفة 0.2 مل.
3. Aliquot 24 ميكرولتر من Mastermix لكل عينة في أنابيب نظيفة وصفت 0.2 مل PCR.
4. إضافة 1 ميكرولتر من cDNA من كل عينة في أنابيب كل منها.
5. احتضان العينات في الترموسيكلر باستخدام شروط البرنامج المذكورة في الجدول 9
6. بعد الحضانة، قم بتخزين منتجات PCR عند درجة حرارة 4 أو -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

11. تحليل جل

1. استخدام العازلة TAE 1x لإعداد هلام يحتوي على 2٪ ث / الخامس من agarose و1x وصمة عار هلام.
2. تشغيل منتجات PCR في 50 V و 300 mA لمدة 1 ساعة أو حتى يكون هناك فصل الفرقة واضحة.
3. صورة الجل باستخدام برنامج التعرض الآلي محملة مسبقا في الصور هلام.

النتائج

وينبغي أن يؤدي اتباع الخطوات المحددة إلى استخراج نووي وظيفي (الشكل 1)، ويمكن أن يؤدي الانحراف في خطوات الطحن أو الغسل إلى ضعف النشاط أو انخفاض الغلة. إذا تم الحصول على استخراج C . elegans النووية وظيفية ، فإنه سيتم نسخ المنطقة المصب من المروج CMV على قالب ال?...

Discussion

C. elegans هو كائن حي نموذج جذاب لدراسة نظام النسخ eukaryotic بسبب صيانته منخفضة التكلفة وسهولة التلاعب الجيني. هنا يتم وصف بروتوكول لعزل ثابت لاستخراج النووية النشطة وظيفيا من L4 C. elegans . على الرغم من أن هذا البروتوكول ركز على تصور نشاط النسخ ، يمكن قياس CDNA المنتجة بعد النسخ باستخدام RT-qPCR لل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010