能動 カエノハブディティス・エレガンス 核抽出物の分離と インビトロ 転写のための再構成

要約

ここでは、幼虫期 4C.エレガン スから活性核抽出物を単離し、 インビトロ 系で転写活性を可視化するための詳細なプロトコルについて説明する。

要約

カエノハブディティス・エレガンスは、1963年に導入されて以来、生物研究にとって重要なモデルシステムとなっています。しかし、C.エレガンスは、インビトロ転写やDNA複製などの核抽出物を用いた生物学的反応の生化学的研究に十分に利用されていない。生化学的研究でC.エレガンスを使用するための重要なハードルは、核抽出物の活性を犠牲にすることなく、線虫の厚い外側のキューティクルを破壊することです。ドオンス均質化や超音波処理など、キューティクルを壊すためにいくつかの方法が使用されますが、タンパク質の不安定性につながることがよくあります。インビトロ反応のために、活性核タンパク質を幼虫または成人C.エレガンスから単離するための確立されたプロトコルはありません。ここで、プロトコルは、バルチホモジナイザーを用いた幼虫ステージ4 C.エレガンスの均質化について詳細に説明する。バルチホモジナイザーは、圧力を使用して、その過程でキューティクルを壊す狭い隙間からゆっくりと動物を強制します。バルチホモジナイザーの均一な設計および精密な機械化は実験間の動物の一貫した粉砕を可能にする。バルチホモジナイザーから得られたホモジネートを分画すると、C.エレガンスの転写活性をアッセリングするインビトロ法で使用できる機能的に活性な核抽出物を得る。

概要

小さくて自由に生きている線虫カ エノハブディティスエレガンス は、幅広い生物学的問題に取り組むシンプルでありながら強力なモデル生物です。1963年の導入以来、線虫は神経生物学、代謝、老化、発達、免疫、遺伝学¹の質問に答えるのに非常に貴重なされています。理想的なモデル生物となる動物の多くの特徴のいくつかは、短い生成時間、RNA干渉の有効性、透明な身体、およびその細胞系統と神経系の両方の完成した地図を含む。

線虫の科学への貢献は膨大ですが、真核転写システムを解明するために十分に利用されておらず、酵母、フルーツフライ、哺乳類細胞培養からの核抽出物を用いた研究から得られたメカニズムに関する理解のほとんどが^{得ています。}研究者が機能性核抽出物を抽出するのを妨げる最大のハードルは、線虫のタフな外キューティクルです。この外骨格は、架橋されたコラーゲン、キューティクリン、糖タンパク質、および脂質を含み、幼虫期から化学的または^{機械的な力}を介したタンパク質抽出に耐性を持つC.エレガンスを作る3。C.エレガンス核抽出物を用いたインビトロ転写システムは、かつて開発されたが、システムの限られた範囲のために広く採用されておらず、抽出物を調製するためのDounceホモジナイザーの使用は、タンパク....

プロトコル

1. メディアの準備

1. メーカーの指示に従って、無菌リソジニーブロス(LB)寒天プレートと液体培地を準備します。
2. LB寒天板上のスリーク エシェリヒア大腸菌 (大腸菌)株OP50。一晩で37°Cで細菌ストリークをインキュベートします。
3. 大腸菌OP50ストリークプレートはインキュベーション後4°Cで保管してください。大腸菌OP50プレートは、水分損失を防ぐためにパラフィルムで包んだ場合、2週間4°Cで安全に保管することができます。
4. 表1のレシピを使用して、ネマトード成長培地(NGM)の2 Lを準備します。
   注: ナイスタチンはオプションです。ナイスタチンは、カビ、および他の真菌汚染がNGMプレート上で増殖するのを防ぐのに役立ちます。大きな150のmmの直径の版は、大 腸菌 OP50を注ぎ、播種するために蓋を取り除くときに真菌胞子を捕まえる可能性が高い。ナイスタチンは、10,000単位/mLのベンダーから滅菌溶液にあらかじめ混合して購入することも、滅菌粉末として購入して滅菌水と混合することができます。ナイスタチンはオートクレーブすることも、効果的に殺菌してフィルターすることもできません。無菌技術への注意は、実験室でナイスタチンの溶液を混合しながら重要です.オートクレーブ 1 M _CaCl2、1 M _....

結果

概説されたステップに従って機能的核抽出物 (図1)を得る必要があり、粉砕または洗浄ステップの偏差は、不十分な活動または低い収率につながる可能性があります。機能的 C.エレガンス 核抽出物が得られた場合、先に説明した インビトロ アッセイに添加した場合に、DNAテンプレート上のCMVプロモーターの下流の領域を転写する?.......

ディスカッション

C.エレガンス は、その低コストのメンテナンスと遺伝子操作の容易さのために真核生物転写システムを研究する魅力的なモデル生物です。ここでは、L4 C. エレガンス からの機能的に活性な核抽出物を一貫して分離するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは転写活性の可視化に焦点を当てたが、転写後に産生されたcDNAをRT-qPCRを用いて定量化し、転写活性の測定?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010