Aktif Caenorhabditis elegans'ın in vitro transkripsiyon için Nükleer Ekstrakt ve Rekonsitasyonu İzolasyonu

Özet

Burada, larva evresi 4 C. eleganlardan aktif nükleer özü izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Caenorhabditis elegans, 1963 yılında piyasaya sürüldüldüklerinden beri biyolojik araştırmalar için önemli bir model sistemidir. Bununla birlikte, C. elegans, in vitro transkripsiyon ve DNA replikasyon gibi nükleer özlerini kullanarak biyolojik reaksiyonların biyokimyasal çalışmasında tam olarak kullanılmamıştır. Biyokimyasal çalışmalarda C. elegans'ı kullanmanın önemli bir engeli, nükleer özün aktivitesini feda etmeden nematodun kalın dış kütikülünü bozuyor. Kıtkeni kırmak için Dounce homojenizasyon veya sonication gibi çeşitli yöntemler kullanılırken, genellikle protein kararsızlığına yol açarlar. Aktif nükleer proteinlerin in vitro reaksiyonlar için larva veya yetişkin C. eleganlardan izole edilmesi için belirlenmiş bir protokol yoktur. Burada protokol, larva evresi 4 C. eleganların balç homojenizatörü kullanılarak homojenizasyonunu ayrıntılı olarak açıklar. Balch homojenizatör, hayvanları bu süreçte kütikülleri kıran dar bir boşluktan yavaşça zorlamak için basınç kullanır. Balch homojenizatörün düzgün tasarımı ve hassas işlenmesi, deneyler arasında hayvanların tutarlı bir şekilde taşlanmasına izin verir. Balch homojenizatörden elde edilen homojenatın fraksiyone edilmesi, C. eleganların transkripsiyon aktivitesini test etmek için bir in vitro yöntemde kullanılabilecek işlevsel olarak aktif nükleer ekstrakt sağlar.

Giriş

Küçük, serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans , çok çeşitli biyolojik soruları ele almak için basit ama güçlü bir model organizmadır. 1963'te piyasaya sürülmesinden bu yana, nematodlar nörobiyoloji, metabolizma, yaşlanma, gelişim, bağışıklık ve ^genetik1 sorularını yanıtlamak için paha biçilmez olmuştur1. Hayvanın ideal bir model organizma olmasını sağlayan birçok özelliğinden bazıları arasında kısa nesil süre, RNA parazitinin etkinliği, şeffaf vücut ve hem hücresel soyunun hem de sinir sisteminin tamamlanmış haritaları bulunur.

Nematodun bilime katkıları çok büyük olsa da, ökaryotik transkripsiyon sistemini aydınlatmak için yetenmemiştir, bu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızın çoğu maya, meyve sineği ve memeli hücre kültüründen nükleer ekstrakt kullanan çalışmalardan ^gelmektedir2. Araştırmacıları fonksiyonel nükleer özüt çıkarmaktan vazgeçiren en büyük engel nematodun sert dış manikürüdür. Bu dış iskelet çapraz bağlı kollajenler, cuticlins, glikoproteinler ve lipitlerden oluşur ve C. eleganları larva aşamasından yetişkinliğe kadar kimyasal veya mekanik kuvvetlerle protein ekstraksiyona dayanıklı hale ^getirir3. C. elegans nükleer ekstresi kullanan bir in vitro transkripsiyon sistemi bir zamanlar geliştirilmiştir, ancak sistemin sınırlı kapsamı nedeniyle yaygın olarak benimsenmemiştir ve özü hazırlamak için Dounce homojenizatörün kullanılması protein kararsızlığına yol ^açabilir4,5.

C. eleganları kırmak için bir Dounce homojenizatör kullanan nükleer ekstrakt izolasyonu için önceki protokolün aksine, bu protokol bir Balch homojenizatör kullanır. Balch homojenizatör iki ana bileşenden oluşur: bir tungsten karbür topu ve bir uçtan diğerine sıkılmış bir kanala sahip paslanmaz çelik bir blok. Balch homojenizatörü tungsten karbür topu ile yüklenir ve taşlama odasını kapatmak için her iki tarafa da kapatılmıştır. Şırınnalar, taşlama odasına giden iki dikey bağlantı noktasına yüklenebilir. Malzeme bir şırınnadan diğerine taşlama odasından geçirilirken, şırınnalardan gelen basınç malzemeyi top ile odanın duvarı arasındaki dar bir boşluktan geçirir. Bu yavaş ve sabit basınç, dar boşluktan kolayca geçebilen tutarlı bir boyuta ulaşana kadar malzemeyi kırar. C. elegans'ı sürekli ama yumuşak bir basınçla dar boşluktan zorlamak, hayvanları açar ve içeriklerini çevredeki tampona bırakır. Top boyutlarının değiştirilmesi boşluğu daha da sıkılaştırarak yeni salınan hücreleri kırar ve çekirdeği tampona boşaltır. Santrifüjlemenin birden fazla örneği çekirdekleri hücre kalıntılarının geri kalanından ayırarak temiz bir nükleer özün toplanmasına izin verir. Balch homojenizatör, Dounce homojenizatöre göre birkaç nedenden dolayı tercih edilir: sistem çok sayıda hayvanı idare edebilir ve tek bir denemede yüksek miktarda aktif protein çıkarmayı mümkün hale getirir; topların ve çelik bloğun hassas işlenmesi, birden fazla numune arasında tutarlı taşlama sağlar; ağır çelik blok bir ısı emici görevi görür, ısıyı taşlama odasından düzgün bir şekilde çeker ve denatüre etmeyi önler.

İzolasyondan sonra, nükleer ekstrakt transkripsiyon aktivitesi herhangi bir biyokimyasal deneyde kullanılmadan önce doğrulanmalıdır. Geleneksel olarak, transkripsiyon aktivitesi, yeni sentezlenen RNA'yı izlemek ve görselleştirmek için radyolabelli nükleotidler kullanılarak ölçüldü. Bununla birlikte, radyoaktif etiketleme, kullanım ve bertaraf sırasında önlem gerektirdiği için külfetli ^olabilir6. Günümüzde teknolojik gelişmeler, araştırmacıların nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)⁷ gibi teknikleri kullanarak küçük RNA miktarlarını bile ölçmek için çok daha az zararlı veya zahmetli yöntemler kullanmalarına izin verir. Burada protokol, aktif nükleer özü larva evresi 4 (L4) C. eleganlardan izole etmek ve transkripsiyon aktivitesini bir in vitro sistemde görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

1. Medya hazırlıkları

1. Üreticinin talimatlarına uyarak steril lysogeny et suyu (LB) agar plakaları ve sıvı ortam hazırlayın.
2. Çizgi Escherichia coli (E. coli) bir LB agar plakası üzerinde OP50 suş. Bakteri çizgisini bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
3. E. coli OP50 çizgi plakasını kuluçkadan sonra 4 °C'de saklayın. E. coli OP50 plaka, nem kaybını önlemek için parafilme sarılırsa 2 hafta boyunca 4 °C'de güvenle saklanabilir.
4. Tablo 1'deki tarifi kullanarak 2 L Nematod Growth Media (NGM) hazırlayın.
   NOT: Nystatin isteğe bağlıdır. Nystatin, KÜFün ve diğer mantar kontaminasyonlarının NGM plakalarında büyümesini önlemeye yardımcı olur. 150 mm çapındaki büyük plakaların, E. coli OP50'nin dökülmesi ve tohumlama için kapağı çıkarıldığında mantar sporlarını yakalama şansı daha yüksektir. Nystatin, 10.000 birim / mL'deki satıcılardan steril çözeltide önceden karıştırılabilir veya steril bir toz olarak satın alınabilir ve steril su ile karıştırılabilir. Nystatin otomatik olarak kapatılamaz ve etkili bir şekilde sterilize edilemez. Laboratuvarda bir nystatin çözeltisi karıştırılırken aseptik tekniğe dikkat etmek çok önemlidir. 15 dakika boyunca ₁₂₁ °C'de 1 M CaCl2, 1 M KPO4 _pH 6.0 ve 1 M _MgSO4 otomatik olarak. Filtre, % 95 etanolde çözüldükten sonra kolesterolü 0.22 μm filtre ile sterilize eder.
5. Reaktifleri medyaya ekledikten sonra, NGM'yi kırk 150 mm Petri kabına dökün. Her 150 mm'lik tabağın doldurulması için 50 mL gerekir. NGM plakalarını oda sıcaklığında gece boyunca soğumaya bırakın.
6. Önceki çizgi plakasından E. coli OP50 ile 25 mL steril LB içeren iki adet 50 mL konik tüpü aşıla. Suyu 37 °C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de tutulan titreyen bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kıvam için, her iki tüpü de çizgi plakasından aynı tek koloniye sahip aşıla. Bu zor olursa, 50 mL konik tüpte tek bir koloni ile 5 mL steril LB aşılayın ve NGM plakalarını hazırlamadan bir gün önce 200 rpm'de tutulan bir sallama inkübatöründe kültürü 37 ° C'de 16 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Taze sıvı kültürünü 4 °C'de iki güne kadar saklayın. İki 25 mL'lik suyu 25 μL sıvı kültürü ile aşılayın ve yukarıda belirtildiği gibi aynı koşullarda kuluçkaya yatırın.
7. Tohum taze NGM plakaları 1 mL taze E. coli OP50 sıvı kültürü ve bir alev sterilize spreader ile eşit plaka yüzeyine yayılmış, plakanın büyük bir kısmını kapsayan büyük bir bakteri çim oluşturmak için, kenardan kenara bakteri yaymamaya özen. E. coli OP50'nin oda sıcaklığında 72-96 saat veya gözle görülür şekilde kalın bir çim görünene kadar büyümesine izin verin.
   NOT: 24 saat sonra, nem kaybını azaltmak ve plakaların ömrünü uzatmak için taze tohumlu NGM plakalarını kapalı bir kaba taşıyın.

2. Hayvan preparatları ve çamaşır suyu senkronizasyonu

1. Toplam 50 hayvan için E. coli OP50 ile tohumlanmış 10 taze NGM plakasının her birine 5 iyi beslenmiş, yabani tip, gravid yetişkin C. elegan transfer edin.
2. Hayvanların yumurta bırakmasına izin verin. Gravid yetişkin aşamasına ulaşana kadar soyun 20 ° C'de büyümesine izin verin.
3. On bakım plakasından iyi beslenen yeni yabani tip, gravid yetişkinleri toplamak ve hayvanları etiketli 15 mL konik tüpe aktarmak için 15 mL M9 tamponu (Tablo 2) kullanın.
4. Tüp altındaki tüm hayvanları peletmek için hayvanları 3 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.
5. Ayrı, etiketli 15 mL konik tüpte, çamaşır suyu senkronizasyonu için 2 mL çamaşır suyunu 5 mL 1 N NaOH ile karıştırın. Vortex iyice karıştırmak için çözüm.
   NOT: Çamaşır suyu + NaOH sokumini etkili olmaya hazırlandığı gün kullanın.
6. 10 mL steril pipet kullanarak süpernatantı santrifüjlü hayvanlardan hafifçe çıkarın. Hayvanların kırılmasını iyileştirmek için mümkün olduğunca çok M9 tamponu çıkarmaya çalışmayın.
7. Hayvan peletine 500 μL çamaşır suyu + NaOH çözeltisi ekleyin ve 4 dakika boyunca bir zamanlayıcı başlatın.
8. Elle veya bir rocker kullanarak, hayvan peletini tamamen kırmak için tüpü hafifçe sallayın ve hayvanların çamaşır suyu + NaOH çözeltisinde serbestçe hareket etmesine izin verin. 4 dakika boyunca tüpü sallamaya devam edin.
   NOT: Gerekli çamaşır suyu + NaOH çözeltisi miktarı, senkronize edilen hayvan peletinin boyutuna bağlı olarak değişebilir. Bu tekniği önceden çeşitli miktarlarda hayvan ve çamaşır suyu + NaOH çözeltisi ile optimize edin.
9. 4 dakika sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında kırılma verimliliğini kontrol edin. Gravid yetişkin hayvanların çoğunluğunun kırıldığından ve yumurtalar da dahil olmak üzere iç içeriklerinin serbest bırakıldığından emin olun.
10. Hayvanlar yarılmazsa, tüpü maksimum hızda kısaca girdapleyin, ardından mikroskop altında tekrar kontrol edin.
    NOT: Yumurtalar çamaşır suyu + NaOH çözeltisine dayanıklı olsa da, geçirimsiz değildir. Yumurtalar çamaşır suyu + NaOH çözeltisine gereğinden fazla maruz kalmamalıdır. Hayvan kırma adımı sırasında çok uzun süre oyalamak, soy için gelişimsel sorunlara yol açabilir.
11. Kırık hayvan çözeltisine 10 mL M9 tampon ekleyin.
12. Yumurtaları ve kalıntıları 3 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj edin.
13. Boru, tüpün altındaki tüm yumurtaları içeren yeni pelete dokunmamaya dikkat ederek süpernatant uzağa.
14. M9 tamponunun 10 mL'lik bir kısmını daha ekleyin ve 1.000 x g'da 3 dakika boyunca santrifüjüne tekrar ekleyin.
15. Çamaşır suyu + NaOH çözeltisinin kalmadığından emin olmak için 2.13-2.14 adımlarını iki kez daha tekrarlayın.
16. Üçüncü M9 tampon yıkamadan sonra, süpernatant çıkarın ve S-bazal tamponun 10 mL'si ekleyin (Tablo 2).
17. Yumurtaları tamponda eşit olarak askıya almak için alttaki peleni kırmak için tüpü ters çevirin.
18. Tüpü bir rocker üzerine yerleştirin ve yumurtaların yumurtadan çıkmasına ve larva aşaması 1 (L1) tutuklamasına ulaşmasına izin vermek için tüpü 20 °C'de 22 saat hafifçe sallayın.
19. 22 saat sonra, senkronize L1 hayvanları içeren tüpü 1000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
20. Pipet ve tüpte yaklaşık 1 mL tampon bırakarak süpernatant atın.
21. Bir mikropipette kullanarak, kalan tamponda L1 hayvanlarının homojen bir süspansiyonunu yapmak için hayvan peletini rahatsız edin.
22. L1 hayvanlarının homojen süspansiyonunun tek bir damlacığı E. coli OP50 ile tohumlanmış etiketli 150 mm NGM plakaya aktarın.
23. Diseksiyon mikroskobu kullanarak damla başına L1 hayvan sayısını görsel olarak sayarak damla başına hayvan yoğunluğunu hesaplayın. Tamamen büyümüş bir E. coli OP50 çimine sahip 150 mm NGM plaka, L1 aşamasının 500'e kadar hayvanını gravid yetişkin aşamasına ulaşmak için destekleyebilir.
24. L1 hayvanlarını E. coli OP50 ile altı 150 mm NGM plakaya aktarın. Plakayı aşırı yüklememeye dikkat edin.
    NOT: Hayvanların L1 ve gravid yetişkin arasında gelişme için yeterli yiyeceğe sahip olup olmayacağı belirsizse, her tabağa daha az hayvan ekleyin ve daha fazla tabak kullanın.
25. Hayvanların gravid yetişkin aşamasına ulaşana ve yumurta bırakmaya başlayana kadar 20 ° C'de 72 saat büyümesine izin verin.
26. Senkronize, iyi beslenen vahşi tip gravid yetişkin hayvanlarda ikinci bir çamaşır suyu senkronizasyonu gerçekleştirin.
27. Senkronize L1 hayvanlarını, plaka başına yaklaşık 1.000 hayvanla birlikte E. coli OP50 ile tohumlanmış on adet 150 mm NGM plakasına yerleştirin.
28. Yeni senkronize L1 hayvanlarının L4 aşamasına ulaşana kadar 20 °C'de 48 saat büyümesine izin verin.
    NOT: Amaç, L4 hayvanlarının yaklaşık 700 - 800 μL peletini elde etmektir. Çok fazla hayvan Balch homojenizatörünü kullanmayı zorlaştırabilir; bu, homojenizatörü çalıştırırken kas zorlanmasına ve artan basınç nedeniyle şırınglardan olası sızıntıya yol açabilir.

3. Balch homojenizatör hazırlığı

1. Tablo 3 ve Tablo 4'te belirtildiği gibi hem hipotonik hem de hipertonik tamponları hazırlayın.
   NOT: Hipotonik ve hipertonik tamponlar önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de güvenle saklanabilir.
2. Öğütme odasını% 70 etanol ile su basarak Balch homojenizatörunu temizleyin, ardından fazla etanolleri çıkarmak için hazneyi deiyonize su ile durulayın.
   NOT: Balch homojenizatörini temizlemek için herhangi bir kostik madde kullanmaktan kaçının. Etanol ve deiyonize su ile iyice durulama temizlemek için yeterli olmalıdır.
3. 7.9820 mm (18 μm boşluk boşluğu) tungsten karbür topını taşlama odasına yerleştirin.
4. Balch homojenizatör varilinin her ucunun kapla ve kapakları sağlanan başparmak vidalarıyla sabitle.
5. Numune başına 5 mL 'tam hipotonik tampon' hazırlayın: 5 μL 1 M DTT (son konsantrasyon: 1 mM DTT) ve 100 μL 100x proteaz inhibitörü, tek kullanımlık kokteyl (son konsantrasyon: 2x) ekleyin. Tamponu buzda tut.
6. Numune başına 5 mL 'komple hipertonik tampon' hazırlayın: 5 μL 1 M DTT (son konsantrasyon: 1 mM DTT) ve 100 μL 100x proteaz inhibitörü, tek kullanımlık kokteyl (son konsantrasyon: 2x) ekleyin. Tamponu buzda tut.
   NOT: Tam hipotonik ve hipertonik tamponu aynı hazırlık gününde kullanın. Daha sonra kullanmak üzere saklamayın. 1 M DTT'i -20 °C'de tek kullanımlık aliquots olarak saklayın. Proteaz inhibitör tek kullanımlık kokteyli 4 °C'de saklayın.
7. Steril bir 2 mL şırınnayı 1 mL 'tam hipotonik tampon' ile doldurun ve Balch homojenizatörün taşlama odasını hafifçe yıkayın. Hazneye yaklaşık 500 μL 'tam hipotonik tampon' bırakın.
8. Yıkanmış homojenizatörleri buzda saklayın ve 30 dakika soğumaya bırakın.
   NOT: Homojenizatör, hayvanları öğütmeden önce buz gibi olmalıdır. Taşlama işlemi sürtünme nedeniyle ısı üretebilir ve nükleer proteinleri denatüre edebilir. Bunun olmasını önlemek için metal homojenizatörslerinin buz gibi olduğundan emin olun. Çevredeki buzdan gelen herhangi bir suyun homojenizatöre girmesini önlediğinizden emin olun. Homojenizatördeki delikleri tıkamak ve kasıtsız sıvıların taşlama odasına girmesini engellemek için iki steril şırıng kullanın.

4. Hayvan koleksiyonu

NOT: Hayvanların toplanması, bozulması ve fraksiyonasyonu için önemli adımları işaretleyen hızlı bir referans kılavuzu sağlanmıştır (Şekil 1).

1. İyi beslenen L4 hayvanlarını M9 tamponu ile 15 mL konik bir tüpte toplayın ve hayvanları 3 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj edin. Süpernatant çıkarın ve süpernatant temiz olana kadar hayvan peletini yıkamaya devam edin.
2. Hayvanları 3 mL 4 °C hipotonik tampon ve santrifüj ile 3 dakika boyunca 1000 x g'da tekrar yıkayın.
   NOT: 4 °C hipotonik tampon ile son yıkama sırasında, hayvanlar tüpün kenarına yapışabilir. Bu normaldir ve süpernatant çıkarılması sırasında küçük bir hayvan kaybına neden olabilir.
3. Hipotonik tamponu çıkarın ve hayvan peletine 1 mL "tam hipotonik tampon" ekleyin. Hayvan süspansiyonu yeni bir 2 mL steril şırınna aktarın.
   NOT: Hayvanları bir mikropipette kullanarak şırıngaya aktarırken, pipet ucu duvarlarına yapışması nedeniyle kaybedilen hayvan sayısını azaltmak için pipet ucunun içini kaplamak için steril% 0,1 Tween20 çözeltisini hafifçe pipetlayın.

5. Kesirlenme

1. Buzda, hayvanları 7.9820 mm'lik top yüklü Balch homojenizatörün öğütme odasından hafifçe iterek ve yeni bir steril şırınna iterek hayvanları homojenize edin. Hayvanları 30 tam döngü boyunca taşlama odasından iterek tekrarlayın.
   NOT: 'Tam döngü', şırınna pistonunun tam yukarı ve aşağı hareketi olarak tanımlanır.
   Bu taşlama adımında 7.9820 mm bilya (18 μm bilyalı rulman) rulmanı rulmanı rulmanı 8.9820 mm'dir.
2. 30 döngüden sonra, Balch homojenizatörden mümkün olduğunca fazla hayvan süspansiyonunu çıkarın ve şırıngayı 1,7 mL mikrotüpte saklayın.
3. 7.9820 mm'lik topu öğütme odasından çıkarın ve deiyonize suyla temizleyin. Kurulayın ve topu etiketli tüpüne geri verin.
4. 7.9880 mm (12 μm boşluk boşluğu) toplarını taşlama odasına yerleştirin ve homojenizatörü yeniden yerleştirin.
5. Taşlama haznesini 1 mL buz gibi 'tam hipotonik tampon' ile tekrar yıkayın.
6. Süspansiyonu 25 tam döngü boyunca öğütün.
7. 25 döngüden sonra, hayvan süspansiyonu Balch homojenizatörden çıkarın, süspansiyonu temiz bir 1,7 mL mikrotüp içine aktarın ve buzda saklayın.
   NOT: Balch homojenizatörunu % 70 etanol ve deiyonize su ile sökün ve temizleyin. 7.9880 mm'lik topu uygun tüpüne geri verdiğinden emin olun.
8. Süspansiyonu 500 x g, 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyarak hayvan gövdelerini ve kalıntılarını peletin.
9. Pipet 40 μL süpernatant 'giriş fraksiyonu' etiketli bir tüpe ve buz üzerinde saklayın.
   NOT: Daha sonra bulaştırmamak için tüm etiketleri alkol geçirmez bir kalemle yazın.
10. Kalan süpernatant yeni bir 1.7 mL tüpe aktarın, tüpün altındaki pelete dokunmaktan kaçınmaya ve ardından peletin atılmasına dikkat edin.
11. Çekirdeği 4.000 x g, 4 °C'de 5 dakika boyunca peletmek için süpernatantı santrifüj edin.
12. Süpernatantı aktarın, peletlenmiş çekirdekleri rahatsız etmemeye dikkat edin, yeni bir 1.7 mL tüpe aktarın ve tüpü 'sitozolitik fraksiyon' olarak etiketleyin.
    NOT: Sitosolik fraksiyonu 17.000 x g, 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyarak kalan çözünmeyen maddeleri çıkarın ve batı lekeleri için negatif bir kontrol olarak kullanın (özellikle nükleer proteinler için).
13. Çekirdek peletini 500 μL 'tam hipotonik tampon' ile yıkayın ve peleti yeni bir 1,7 mL tüpe aktarın. Askıya alınan peletin santrifüjü 4.000 x g, 4 °C'de 5 dk.
14. Süpernatant atın ve nükleer pelete 500 μL taze 'tam hipotonik tampon' ekleyin ve süspansiyonu yeni bir 1,7 mL tüpe aktarın. Numuneyi 4.000 x g, 4 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin.
15. Süpernatantı çıkarın ve peleti 40 μL 'tam hipertonik tampon' içinde çözün. Yeni nükleer süspansiyonu yeni bir 1,7 mL tüpe aktarın, tüpü 'nükleer fraksiyon' olarak etiketleyin ve buz üzerinde saklayın.
16. Floresan nicelleştirme kiti kullanarak üç fraksiyonun protein konsantrasyonunu belirleyin.
    NOT: Bu yöntemden elde edilen nükleer protein miktarı 1-2 μg/μL arasında değişebilir.
17. Nükleer fraksiyonları 6 μg nükleer protein içeren tek kullanımlık tüplere ayırın ve kuru bir buz ve etanol banyosunda dondurun. Bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.

6. Transkripsiyon tahlilleri

1. Bir ısı bloğunu açın ve önceden 30 °C'ye ısıtın.
2. Nulcear Extract in vitro transkripsiyon sisteminden aşağıdakileri çıkarın: 50 mM _MgCl2, Nükleer Ekstrakt 1x Transkripsiyon Tamponu, 100 mM rATP, 100 mM rCTP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP ve CMV promotör pozitif kontrol şablonu. Buzda çözün.
   NOT: Pozitif kontrol DNA şablonlarını yüksek kaliteli bir polimeraz kullanarak güçlendirin ve normalleştirilmiş tek kullanımlık aliquots olarak saklayın.
3. 10 mM çalışma çözümü hazırlamadan önce çözülmüş rNTP'leri karıştırın ve santrifüj edin.
   NOT: Her rNTP'nin 10 mM'ini elde etmek için 12 μL H2O'ya her rATP, rCTP, rGTP ve rUTP'den ₂ μL ekleyin. Bu bileşim gerekirse ölçeklendirilebilir.
4. RNTP karışımını etiketli tek kullanımlık tüplere aliquotlayın ve ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.
5. "Mastermix" etiketli yeni bir 1,5 mL tüpte, Tablo 5'te belirtildiği gibi reaksiyon başına reaktifleri ekleyin
6. Mastermix'in 14 μL'lik kısmını her reaksiyon tüpüne aktarın
7. Her reaksiyon tüpüne 1x Transkripsiyon Tamponunun 11 μL eksisini (nükleer özün 5 μg'si için hacim) ekleyin.
8. Her reaksiyon tüpüne 5 μg nükleer ekstrakt ekleyin.
9. İçindeki içeriği karıştırmak için reaksiyon tüpüne hafifçe dokunun ve tüplerin duvarına reaksiyon malzemesi sıkışmamasını sağlamak için karıştırdıktan sonra tüpleri darbe santrifüjüne alın.
10. Reaksiyonları 30 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
11. RNA ekstraksiyon kiti tarafından sağlanan 400 μL RLT tamponu ekleyerek reaksiyonu hemen durdurun.
    NOT: Bu noktada, durdurmak güvenlidir. Numuneler, RNA ekstraksiyon kiti ile daha fazla temizlenine kadar -80 °C'de saklanabilir.

7. RNA temizleme

1. RNA çıkarma kitinde bulunan RNase-Free DNase setini kullanarak DNase I stok çözümünü hazırlayın. Liyofilize DNase I'i 550 μL RNase içermeyen suda çözün. Çözeltiyi yavaşça karıştırın. Girdap yapmayın. Aliquot DNase I çözeltisini 10 μL tek kullanımlık tüplere dönüştürün ve aliquotları -20 °C'de saklayın.
2. Moleküler sınıf etanol ve RNase içermeyen su kullanarak % 70 ve% 80 etanol hazırlayın.
3. Temizlemeye başlamadan önce örnekleri ve reaktifleri RNase içermeyen bir çalışma alanına taşıyın.
4. Her numuneye 400 μL% 70 etanol ekleyin ve iyice karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin.
5. Numunenin 400 μL'lik kısmını 2 mL toplama tüpüne sahip etiketli bir RNA ekstraksiyon spin sütununa aktarın ve numuneyi 30 s için 8.500 x g'da santrifüjlayın. Akışa geç.
6. Kalan örnekle birlikte 7.5.
7. Her sütuna 350 μL RW1 tampon (RNA çıkarma kiti) ekleyin. Sütunları 30 s için 8.500 x g'da santrifüj edin. Akışa geç.
8. Tek bir 10 μL DNase I stok çözeltisine 70 μL RDD tampon (RNA ekstraksiyon kiti) ekleyin ve hafifçe karıştırın. Girdap yapmayın.
9. DNase I inkübasyon karışımını (80 μL) doğrudan spin kolonu zarı ekleyin. Kolonları oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Membrana DNase I sosunu eklediğinizden emin olun. Çözeltinin bir kısmını sütun duvarına veya O halkasına kaybetmekten kaçının.
10. 15 dakika sonra sütunlara 350 μL RW1 arabelleği ekleyin. 8.500 x g'da 30 sn sn santrifüj. Akışa geç.
11. Sütunları yeni 2 mL toplama tüplerine yerleştirin. Spin sütununa 500 μL RPE tamponu (RNA çıkarma kiti) ekleyin. Membranı yıkamak için sütunları 30 s için 8.500 x g'da santrifüj edin. Akışa geç.
12. Her sütuna 500 μL% 80 etanol ekleyin ve sütunları 30 s için 8.500 x g'da santrifüjleyin. Akışa geç.
13. Sütunları yeni 2 mL toplama tüplerine yerleştirin. Sütun kapaklarını açık bırakarak, sütunları 5 dakika boyunca 17.900 x g'da santrifüj edin. Akışa geç.
14. Sütunları etiketli 1,7 mL tüplere yerleştirin. Spin sütunu zarının ortasına doğrudan 17 μL RNase içermeyen su ekleyin. Kolonları oda sıcaklığında 1 dakika dinlendirin. Sütunları 1 dakika boyunca 17.900 x g'da santrifüj edin.
15. Sütunu atın ve 1,7 mL'lik tüpü taze saflaştırılmış RNA örneğiyle saklayın.

8. DNA sindirimi

1. 37 °C ve 65 °C'de iki ısı bloğu önceden ısıtın.
2. Her numuneye 2 μL 10x Reaksiyon Tamponu ekleyin.
3. Her numuneye 1 μL (1 MBU) DNase ekleyin.
4. Bir pipeti 10 μL'ye ayarlayın ve yeni çözeltiyi hafifçe karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet. Girdap yapmayın.
5. Kalan DNA'ları sindirmek için RNA örneklerini 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
6. 65 °C'deki ısı bloğundaki numuneleri 10 dakika boyunca inkübe ederek DNaz'ı devre dışı bırakın.
   NOT: Bu adımda durmak ve daha sonra ters transkripsiyon yapmak için RNA'yı -80 °C'de saklamak güvenlidir.

9. Ters transkripsiyon

1. Termosikleyiciyi programlarken, termosikleyiciyi önceden ısıtmak için inkübasyondan önce 1 saat 37 °C daha ekleyin. Numuneleri hazırlarken programı 'önceden ısıtma adımı' ile çalıştırın ve termosikleyicinin 37 °C'ye ulaşmasına izin verin. Ters transkripsiyon için numuneler hazır olduğunda, 37 °C ön ısıtma adımını atlayın ve gerçek inkübasyon adımına geçin (Tablo 6). Termosikleyicinin atlama özelliği yoksa, inkübasyondan önce 1 dk 37 °C'lik bir adım ekleyin. Sistemi duraklatmadan ve hazırlanan numuneleri eklemeden önce termosikrin uygun sıcaklığa ısınmasını izin verin.
2. RNase içermeyen _H2O'da 10 μM çalışma transkripsiyon ters astar çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
3. Buzda çözün, ters transkripsiyon kitinden 10x tampon, dNTP karışımı (her dNTP'de 5 mM), RNaz Inhibitörü ve ters transkriptaz.
4. Tablo 7'de belirtilen bileşenleri temiz bir 0,2 mL PCR tüpüne ekleyerek bir Mastermix (reaksiyon başına) hazırlayın.
5. Mastermix'in Aliquot 18 μL'si her numune için yeni 0,2 mL PCR tüplerine.
6. Her örnek için 2 μL DNaz işlenmiş RNA'yı sırasıyla etiketli tüplerine ekleyin.
7. Numuneleri önceden ısıtılmış bir termositte 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
8. Ters transkripsiyondan sonra numuneleri depolama için -20 °C'ye taşıyın veya doğrudan bir sonraki adıma geçin.
   NOT: Bu adımda durmak güvenlidir; daha sonra kullanmak üzere cDNA'yı -20 °C'de saklayın.

10. Özel ürün amplifikasyonu

1. Buzda çözün: cDNA, ileriye doğru 10 μM transkripsiyon ve 10 μM transkripsiyon ters astar ve PCR 2x Premix A.
   NOT: Çözülme süresini azaltmak için PCR 2x Premix A'yı daha küçük birimlere aliquot.
2. Tablo 8'de belirtilen bileşenleri temiz bir 0,2 mL PCR tüpüne ekleyerek bir Mastermix (reaksiyon başına) oluşturun.
3. Temiz etiketli 0,2 mL PCR tüplerine her örnek için Aliquot 24 μL Mastermix.
4. Her numunenin 1 μL cDNA'ını ilgili tüplerine ekleyin.
5. Tablo 9'da belirtilen program koşullarını kullanarak termositlerdeki numuneleri kuluçkaya yatırın
6. Kuluçkadan sonra, PCR ürünlerini daha uzun süreli depolama için 4 °C veya -20 °C'de saklayın.

11. Jel analizi

1. 1x TAE tamponu kullanarak % 2 w/v agarose ve 1x jel lekesi içeren bir jel hazırlayın.
2. PCR ürünlerini 50 V ve 300 mA'da 1 saat boyunca veya net bir bant ayrımı olana kadar çalıştırın.
3. Jel görüntüleyicisinde önceden yüklenmiş otomatik pozlama programını kullanarak jelin görüntüsünü görüntüleyin.

Sonuçlar

Özetlenen adımların ardından fonksiyonel nükleer ekstrakt (Şekil 1) verilmelidir, taşlama veya yıkama adımlarındaki sapma zayıf aktiviteye veya düşük verime yol açabilir. Fonksiyonel C. elegans nükleer özü elde edilirse, daha önce açıklanan in vitro teste eklendiğinde CMV promotörünün bölgesini DNA şablonuna aşağı doğru yazıya dökecektir. Elde edilen RNA transkript, geleneksel yöntemler kullanılarak nükle...

Tartışmalar

C. elegans , düşük maliyetli bakımı ve genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle ökaryotik transkripsiyon sistemini incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada L4 C. elegans fonksiyonel olarak aktif nükleer özün tutarlı izolasyonu için bir protokol açıklanmıştır. Bu protokol transkripsiyon etkinliğini görselleştirmeye odaklansa da, transkripsiyon aktivitesinin daha hassas bir ölçümünü elde etmek için transkripsiyon sonrası üretilen cDNA RT-qPCR kullanılarak

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010