בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .

Abstract

Caenorhabditis elegans היה מערכת מודל חשוב למחקר ביולוגי מאז הוצג בשנת 1963. עם זאת, C. elegans לא נוצל באופן מלא במחקר הביוכימי של תגובות ביולוגיות באמצעות תמציות גרעיניות שלה כגון תמלול במבחנה ושכפול DNA. משוכה משמעותית לשימוש C. elegans במחקרים ביוכימיים היא לשבש את החתך החיצוני העבה של הנמטודה מבלי להקריב את הפעילות של התמצית הגרעינית. בעוד מספר שיטות משמשות כדי לשבור את הקיטור, כגון הומוגניזציה Dounce או sonication, הם לעתים קרובות להוביל חוסר יציבות חלבון. אין פרוטוקולים מבוססים לבידוד חלבונים גרעיניים פעילים מזחלים או C. elegans למבוגרים לתגובות במבחנה . כאן, הפרוטוקול מתאר בפירוט את ההומוגניזציה של שלב זחל 4 C. elegans באמצעות הומוגניזר Balch. ההומוגניזר הבלץ' משתמש בלחץ כדי לאלץ את בעלי החיים באיטיות לעבור פער צר ששובר את הקיטור בתהליך. העיצוב האחיד והעיצוב המדויק של ההומוגניזר בלך מאפשרים שחיקה עקבית של בעלי חיים בין ניסויים. פירוק ההומוגנית המתקבלת מההומוגניזר Balch מניבה תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית שניתן להשתמש בה בשיטת מבחנה לבדיקת פעילות שעתוק של C. elegans.

Introduction

הנמטודה הקטנה, החיה החופשית Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל פשוט אך רב עוצמה לטיפול במגוון רחב של שאלות ביולוגיות. מאז הצגתו בשנת 1963, הנמטודות היו יקרות ערך לענות על שאלות נוירוביולוגיה, חילוף החומרים, הזדקנות, התפתחות, חסינות, ^{וגנטיקה1}. חלק מהמאפיינים הרבים של החיה שהופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי כוללים זמן דור קצר, האפקטיביות של הפרעות RNA, גוף שקוף, ואת המפות הושלמו של שושלת התאים שלה ומערכת העצבים.

בעוד שתרומת הנמטודה למדע היא עצומה, הם נוצלו פחות כדי להדגיש את מערכת התמלול האוקריוטית, כאשר רוב הבנתנו לגבי מנגנונים אלה מגיעה ממחקרים המשתמשים בתמצית גרעינית של שמרים, זבובי פירות ותרבות תאי ^{יונקים2}. המשוכה הגדולה ביותר שמניאת את החוקרים מחילוצת תמצית גרעינית תפקודית היא הגוון החיצוני הקשוח של הנמטודה. שלד חיצוני זה כולל קולגנים מקושרים, חותך, גליקופרוטאין ושומנים, מה שהופך את C. elegans משלב הזחל לבגרות עמידים להפקת חלבונים באמצעות כוחות כימיים או ^{מכניים3}. מערכת תמלול במבחנה באמצעות תמצית גרעינית C. elegans פותחה בעבר אך לא אומצה באופן נרחב בשל ההיקף המוגבל של המערכת, והשימוש בהומוגניזר Dounce להכנת התמצית עלול להוביל לחוסר יציבות ^{בחלבון4,5}.

שלא כמו הפרוטוקול הקודם לבידוד תמצית גרעינית אשר השתמש homogenizer Dounce לשבור C. elegans, פרוטוקול זה משתמש homogenizer Balch. ההומוגניזר Balch מורכב משני מרכיבים עיקריים: כדור קרביד טונגסטן ובלוק נירוסטה עם ערוץ משועמם דרך מקצה לקצה. ההומוג'ייזר Balch טעון עם כדור קרביד טונגסטן וכתרים משני הצדדים כדי לאטום את תא הטחינה. מזרקים ניתן לטעון על שתי היציאות האנכיות המובילות לתא הטחינה. כאשר החומר מועבר ממזרק אחד לשני דרך תא הטחינה, הלחץ מהמזרקים מאלץ את החומר דרך רווח צר בין הכדור לקיר התא. לחץ איטי וקבוע זה שובר את החומר עד שהוא מגיע לגודל עקבי המסוגל לעבור דרך הפער הצר בקלות. אילוץ C. elegans דרך הפער הצר באמצעות לחץ מתמיד אך עדין שובר את בעלי החיים פתוח, שחרור התוכן שלהם לתוך חוצץ שמסביב. החלפת גדלי הכדור מהדקת עוד יותר את הפער, שוברת את התאים החדשים ששוחררו ומשחררת את הגרעינים לתוך המאגר. מקרים מרובים של צנטריפוגה מפרידים את הגרעינים משאר פסולת התא, ומאפשרים איסוף של תמצית גרעינית נקייה. הומוגניזר Balch מועדף על פני homogenizer Dounce מכמה סיבות: המערכת יכולה להתמודד עם מספר רב של בעלי חיים, מה שמאפשר לחלץ כמות גבוהה של חלבונים פעילים בניסיון אחד; עיבוד מדויק של הכדורים ואת בלוק הפלדה מאפשר שחיקה עקבית בין דגימות מרובות; בלוק הפלדה הכבדה משמש ככיור חום, מושך חום באופן אחיד מתא הטחינה, ומונע דנטורינג.

לאחר הבידוד, יש לאמת את פעילות התמלול של התמלול של התמליל של התמצית הגרעינית לפני השימוש בניסויים ביוכימיים כלשהם. באופן מסורתי, פעילות שעתוק נמדדה באמצעות נוקלאוטידים עם תווית רדיו כדי לעקוב ולדמיין את הרנ"א המסונתז החדש. עם זאת, תיוג רדיואקטיבי יכול להיות מעיק כפי שהוא דורש זהירות במהלך השימוש ^{וסילוק6}. ההתקדמות הטכנולוגית מאפשרת לחוקרים כיום להשתמש בשיטות הרבה פחות מזיקות או בעייתיות כדי למדוד אפילו כמויות RNA קטנות באמצעות טכניקות כגון PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR)⁷. כאן, הפרוטוקול מתאר שיטה לבודד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 (L4) C. elegans ולדמיין פעילות שעתוק במערכת במבחנה.

Protocol

1. הכנות לתקשורת

1. הכן צלחות אגר ציר ליסוגניים סטריליות (LB) ומדיה נוזלית בהתאם להוראות היצרן.
2. פס Escherichia coli (E. coli) זן OP50 על צלחת אגר LB. לדגור את פס החיידקים ב 37 °C (50 °F) לילה.
3. אחסן את צלחת פס E. coli OP50 ב 4 °C (7 °F) לאחר הדגירה. צלחת E. coli OP50 ניתן לאחסן בבטחה ב 4 °C (70 °F) במשך 2 שבועות אם עטוף parafilm כדי למנוע אובדן לחות.
4. הכן 2 L של נמטודה צמיחה מדיה (NGM) באמצעות המתכון בטבלה 1.
   הערה: Nystatin הוא אופציונלי. Nystatin מסייע במניעת עובש, ומזהמים פטרייתיים אחרים מגידול על לוחות NGM. לוחות גדולים בקוטר 150 מ"מ יש סיכוי גבוה יותר לתפוס נבגים פטרייתיים כאשר המכסה מוסר לשפוך וזריעה E. coli OP50. Nystatin ניתן לרכוש מראש מעורבב פתרון סטרילי מספקים ב 10,000 יחידות / מ"ל או ניתן לרכוש כמו אבקה סטרילית מעורבב עם מים סטריליים. Nystatin לא יכול להיות autoclaved, וגם זה לא יכול להיות מסנן ביעילות מעוקר. תשומת לב לטכניקה אספטית היא חיונית תוך ערבוב פתרון של nystatin במעבדה. Autoclave 1 M _CaCl2, 1 M _KPO4 pH 6.0, ו 1 M _MgSO4 ב 121 °C (70 °F) במשך 15 דקות. מסנן לעקר כולסטרול באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לאחר מומס 95% אתנול.
5. לאחר הוספת ריאגנטים לתקשורת, לשפוך NGM לתוך ארבעים מנות פטרי 150 מ"מ. כל מנה 150 מ"מ דורשת 50 מ"ל כדי למלא. תן לצלחות ה-NGM להתקרר בלילה בטמפרטורת החדר.
6. לחסן שני צינורות חרוט 50 מ"ל המכילים 25 מ"ל של LB סטרילי עם E. coli OP50 מצלחת הרצף הקודם. לדגור את המרק ב 37 °C (55 °F) במשך 24 שעות באינקובטור רועד נשמר ב 200 סל"ד.
   הערה: עבור עקביות, לחסן את שני הצינורות עם אותה מושבה אחת מצלחת הפס. אם זה מוכיח קשה, לחסן 5 מ"ל של LB סטרילי עם מושבה אחת בצינור חרוט 50 מ"ל ולדגירה את התרבות במשך 16 שעות ב 37 °C בחממה רועדת נשמר ב 200 סל"ד יום לפני הכנת לוחות NGM. לאחסן את התרבות הנוזלית הטרייה ב 4 °C (5 °F) עד יומיים. לחסן את שני 25 מ"ל של מרק עם 25 μL של תרבות נוזלית ודגרה באותם תנאים כאמור לעיל.
7. זרע לוחות NGM טריים עם 1 מ"ל של תרבית נוזלית E . coli OP50 טרי להתפשט עם מפזר מעוקר להבה באופן שווה על פני השטח של הצלחת asepticly כדי ליצור מדשאת חיידקים גדולה המכסה את רוב הצלחת, דואג לא להפיץ את החיידקים מקצה לקצה. אפשר E. coli OP50 לגדול בטמפרטורת החדר עבור 72-96 שעות או עד דשא עבה בעליל מופיע.
   הערה: לאחר 24 שעות, להעביר את צלחות NGM זרע טרי למיכל מכוסה כדי להפחית את אובדן לחות ולהאריך את חיי הצלחות.

2. הכנות לבעלי חיים וסנכרון אקונומיקה

1. העבירו 5 אלגנים בוגרים מאכילים היטב, מסוג בר וgravid C. elegans לכל אחד מ-10 לוחות ה-NGM הטריים המוזרעים ב-E . coli OP50, בסך הכל 50 בעלי חיים.
2. אפשר לבעלי החיים להטיל ביצים. תן לצאצאים לגדול ב 20 °C (50 °F) עד שהם מגיעים לשלב המבוגרים gravid.
3. השתמש 15 מ"ל של חוצץ M9 (טבלה 2) כדי לאסוף את החדש מוזן היטב סוג בר, מבוגרים gravid מתוך עשר לוחות תחזוקה ולהעביר את החיות לצינור חרוטי 15 מ"ל שכותרתו.
4. צנטריפוגות בעלי החיים ב 1,000 x g במשך 3 דקות כדי גלולה כל בעלי החיים בתחתית הצינור.
5. בצינור חרוט נפרד, המסומן בתווית של 15 מ"ל, יש לערבב 2 מ"ל של אקונומיקה עם 5 מ"ל של 1 N NaOH לסנכרון אקונומיקה. מערבולת הפתרון לערבב ביסודיות.
   הערה: השתמש בפתרון אקונומיקה + NaOH באותו יום שהוא מוכן להיות יעיל.
6. הסר בעדינות את supernatant מן החיות הצנטריפוגה באמצעות פיפטה סטרילית 10 מ"ל. נסה להסיר כמה שיותר חוצץ M9 כדי לשפר את שבירת בעלי החיים.
7. הוסף 500 μL של אקונומיקה + פתרון NaOH לכדור בעלי חיים ולהתחיל טייסר במשך 4 דקות.
8. או ביד או באמצעות רוקר, בעדינות לטלטל את הצינור כדי לשבור את הכדור החייתי לחלוטין ולתת לבעלי החיים לנוע בחופשיות בתמיסת אקונומיקה + NaOH. המשך לטלטל את הצינור במשך כל 4 דקות.
   הערה: כמות אקונומיקה + פתרון NaOH הדרוש יכול להשתנות בהתאם לגודל של גלולה בעלי חיים להיות מסונכרן. מטב טכניקה זו מראש עם כמויות שונות של בעלי חיים ופתרון אקונומיקה + NaOH.
9. לאחר 4 דקות, בדוק את יעילות שבירה תחת מיקרוסקופ ניתוח. ודא שרוב בעלי החיים הבוגרים ההובשים שבורים, ותכולתם הפנימית משוחררת, כולל הביצים.
10. אם בעלי החיים אינם מפוצלים, מערבולת קצרה הצינור במהירות המרבית, ולאחר מכן לבדוק שוב תחת המיקרוסקופ.
    הערה: בעוד הביצים עמידות בפני אקונומיקה + פתרון NaOH, הם אינם אטום. ביצים אסור לחשוף את הפתרון אקונומיקה + NaOH יותר מהנדרש. השתהות זמן רב מדי במהלך שלב שבירת בעלי החיים יכולה להוביל לבעיות התפתחותיות עבור צאצאים.
11. הוסף 10 מ"ל של מאגר M9 לפתרון בעלי החיים השבורים.
12. צנטריפוגות הביצים והשרידים ב 1,000 x גרם במשך 3 דקות.
13. פיפטה את supernatant משם, הקפדה לא לגעת הכדור החדש המכיל את כל הביצים בתחתית הצינור.
14. הוסף עוד 10 מ"ל של חוצץ M9 וצנטריפוגה שוב במשך 3 דקות ב 1,000 x g.
15. חזור על שלבים 2.13-2.14 פעמיים נוספות כדי להבטיח שאף אחד מפתרון המלבין + NaOH לא יישאר.
16. לאחר שטיפת החיץ השלישית של M9, הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של חוצץ S-basal (טבלה 2).
17. הפוך את הצינור כדי לשבור את הכדור בתחתית כדי להשעות את הביצים באופן שווה במאגר.
18. מניחים את הצינור על נדנדה בעדינות לטלטל את הצינור במשך 22 שעות ב 20 °C (70 °F) כדי לאפשר את הביצים לבקוע ולהגיע זחל שלב 1 (L1) מעצר.
19. לאחר 22 שעות, צנטריפוגה הצינור המכיל בעלי חיים L1 מסונכרנים במשך 3 דקות ב 1000 x גרם.
20. פיפטה ולהשליך את supernatant משאיר כ 1 מ"ל של חוצץ בצינור.
21. באמצעות מיקרופיט, להפריע גלולה בעלי חיים לעשות השעיה הומוגנית של בעלי חיים L1 במאגר הנותר.
22. העבר טיפה אחת של ההשעיה ההומוגנית של בעלי חיים L1 לצלחת NGM 150 מ"מ שזרעה עם E. coli OP50.
23. חשב את צפיפות בעלי החיים לכל טיפה על ידי ספירה חזותית של מספר בעלי החיים L1 לכל טיפה באמצעות מיקרוסקופ ניתוח. צלחת NGM 150 מ"מ עם דשא בוגר של E. coli OP50 יכול לתמוך עד 500 בעלי חיים של שלב L1 כדי להגיע לשלב המבוגרים gravid.
24. העבר את בעלי החיים L1 לשש לוחות NGM 150 מ"מ עם E. coli OP50. הקפד לא להעמיס על הצלחת.
    הערה: אם לא ברור אם לבעלי החיים יהיה מספיק מזון להתפתחות בין L1 למבוגר gravid, להוסיף פחות בעלי חיים לכל צלחת ולהשתמש יותר צלחות.
25. אפשר לבעלי החיים לגדול במשך 72 שעות ב 20 °C (70 °F) עד שהם מגיעים לשלב המבוגר gravid ולהתחיל להטיל ביצים.
26. בצעו סיבוב שני של סנכרון אקונומיקה על בעלי החיים הבוגרים המסונכרנים והמוזנים היטב.
27. מניחים את בעלי החיים המסונכרנים L1 על עשר לוחות NGM 150 מ"מ זרעים עם E. coli OP50, עם כ 1,000 בעלי חיים לכל צלחת.
28. אפשר לבעלי החיים המסונכרנים החדשים L1 לגדול במשך 48 שעות ב 20 °C (70 °F) עד שהם מגיעים לשלב L4.
    הערה: המטרה היא להשיג כ 700 - 800 כדורי μL של בעלי חיים L4. יותר מדי בעלי חיים יכולים להקשות על השימוש בהומוגניזר בלך; זה יכול להוביל למתח שרירים בעת הפעלת homogenizer ודליפה אפשרית מן המזרקים בשל הלחץ המוגבר.

3. הכנת הומוגניזר בלך

1. הכן מאגרים היפוטוניים והיפרטוניים כפי שצוין בטבלה 3 ובטבלה 4.
   הערה: המאגרים ההיפוטוניים וההיפרטוניים ניתן להכין מראש ולאחסן בבטחה ב 4 °C (70 °F).
2. נקה את homogenizer Balch על ידי הצפת תא הטחינה עם 70% אתנול, ולאחר מכן לשטוף את התא עם מים deionized כדי להסיר אתנול עודף.
   הערה: הימנע משימוש בסוכנים קאוסטית לניקוי ההומוגניזר Balch. שטיפה יסודית עם אתנול ומים דה-יונום צריכה להספיק כדי לנקות אותו.
3. הכנס את כדור קרביד 7.9820 מ"מ (18 מיקרומטר מרווח) כדור קרביד טונגסטן לתוך תא הטחינה.
4. מכסים כל קצה של הקנה של הומוגניזר Balch ולאבטח את הכובעים עם thumbscrews שסופקו.
5. הכן 5 מ"ל של 'חיץ היפוטוני מלא' לכל דגימה: הוסף 5 μL של 1 M DTT (ריכוז סופי: 1 mM DTT) ו 100 μL של מעכב פרוטאז 100x, קוקטייל חד פעמי (ריכוז סופי: 2x). שמור את המאגר על קרח.
6. הכן 5 מ"ל של 'חיץ היפרטוני מלא' לכל דגימה: הוסף 5 μL של 1 M DTT (ריכוז סופי: 1 mM DTT) ו 100 μL של מעכב פרוטאז 100x, קוקטייל חד פעמי (ריכוז סופי: 2x). שמור את המאגר על קרח.
   הערה: השתמש במאגר ההיפוטוני וההיפרטוני המלא באותו יום של הכנה. אין לאחסן אותו לשימוש מאוחר יותר. אחסן 1 M DTT כ- aliquots לשימוש יחיד ב - 20 °C (70 °F). יש לאחסן את מעכב הפרוטאז לשימוש חד פעמי ב-4 מעלות צלזיוס.
7. מלא מזרק סטרילי 2 מ"ל עם 1 מ"ל של "חוצץ היפוטוני מלא" ולשטוף בעדינות את תא הטחינה של homogenizer Balch. השאירו כ 500 μL של "חיץ היפוטוני מלא" בתא.
8. לאחסן את homogenizer סמוק על קרח ולתת לו להתקרר במשך 30 דקות.
   הערה: ההומוגניזר חייב להיות קר כקרח לפני שחיקת בעלי החיים. תהליך הטחינה יכול לייצר חום עקב חיכוך ולהכתים את החלבונים הגרעיניים. ודא כי homogenizer מתכת הוא קר כקרח כדי לעזור למנוע את זה מלקרות. הקפידו להימנע ממים מהקרח שמסביב מלהיכנס להומוגניזר. השתמש בשני מזרקים סטריליים כדי לסתום את החורים בהומוגניזר ולחסום כל נוזלים לא מכוונים מלהיכנס לתא הטחינה.

4. אוסף בעלי חיים

הערה: מדריך לעיון מהיר מסופק, המסמן את השלבים העיקריים לאיסוף, שיבושים ופירוק של בעלי החיים (איור 1).

1. לאסוף את בעלי החיים L4 מוזן היטב עם חוצץ M9 בצינור חרוט 15 מ"ל צנטריפוגות בעלי החיים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות. הסר את supernatant ולהמשיך לשטוף את גלולה בעלי חיים עד supernatant הוא ברור.
2. לשטוף את החיות עם 3 מ"ל של 4 °C חיץ היפוטוני וצנטריפוגה שוב ב 1000 x גרם במשך 3 דקות.
   הערה: במהלך השטיפה הסופית עם חיץ היפוטוני 4 °C, בעלי החיים עשויים להיצמד לצד הצינור. זה נורמלי ועלול לגרום לאובדן קטן של בעלי חיים במהלך הסרת supernatant.
3. הסר את המאגר ההיפוטוני ולהוסיף 1 מ"ל של "חוצץ היפוטוני מלא" לכדור החיה. העבר את ההשעיה של החיה למזרק סטרילי חדש של 2 מ"ל.
   הערה: בעת העברת בעלי החיים למזרק באמצעות מיקרופיפט, בעדינות pipette פתרון סטרילי 0.1% Tween20 כדי לצפות את החלק הפנימי של קצה פיפטה כדי להפחית את מספר בעלי החיים שאבדו עקב היצמדות לקירות קצה פיפטה.

5. שבר

1. על הקרח, הומוגניזציה של בעלי החיים על ידי דחיפת בעלי החיים בעדינות דרך תא הטחינה של הומוגניזר Balch טעון עם כדור 7.9820 מ"מ לתוך מזרק סטרילי חדש. חוזר דוחף את החיות דרך תא הטחינה במשך 30 מחזורים שלמים.
   הערה: 'מחזור שלם' מוגדר כתנועה מלאה למעלה ולמטה של בוכנה של מזרק.
   שלב שחיקה זה משתמש בכדור 7.9820 מ"מ (18 מיקרומטר מיסבים כדוריים).
2. לאחר 30 מחזורים, להסיר כמה שיותר של השעיית בעלי חיים ככל האפשר מן homogenizer Balch ולאחסן את המזרק, טיפ למטה ב microtube 1.7 מ"ל.
3. מוציאים את כדור ה-7.9820 מ"מ מתא הטחינה ומנקים אותו במים מתובלים. יבש ולהחזיר את הכדור לצינור המסומן שלו.
4. הכנס את הכדור 7.9880 מ"מ (12 מיקרומטר מרווח) לתוך תא הטחינה וסגור מחדש את homogenizer.
5. לשטוף את תא הטחינה שוב עם 1 מ"ל של קרח קר "חיץ היפוטוני מלא".
6. טוחנים את ההשעיה במשך 25 מחזורים שלמים.
7. לאחר 25 מחזורים, להסיר את ההשעיה החיה מן homogenizer Balch, להעביר את ההשעיה לתוך microtube נקי 1.7 מ"ל, ולאחסן אותו על קרח.
   הערה: לפרק ולנקות את homogenizer Balch עם 70% אתנול ומים deionized. הקפידו להחזיר את כדור ה-7.9880 מ"מ לצינור המתאים לו.
8. גלולה את גופם של בעלי החיים ואת הפסולת על ידי צנטריפוגת ההשעיה ב 500 x g, 4 °C (5 דקות).
9. Pipette 40 μL של supernatant לצינור שכותרתו "שבר קלט" ולאחסן אותו על קרח.
   הערה: כתוב את כל התוויות עם עט חסין אלכוהול כדי להימנע ממרוח אותן מאוחר יותר.
10. העבר את supernatant הנותרים צינור חדש 1.7 מ"ל, דואג להימנע מלגעת בכדור בתחתית הצינור ולאחר מכן להשליך את הכדור.
11. צנטריפוגות supernatant כדי גלולה הגרעינים ב 4,000 x גרם, 4 °C (5 דקות).
12. העבר את supernatant, זהיר לא להפריע גרעינים גלולה, לצינור חדש 1.7 מ"ל ולתייג את הצינור כמו "שבר ציטוטוסולי".
    הערה: צנטריפוגה השבר הציטוטוסולי עוד יותר ב 17,000 x גרם, 4 °C במשך 30 דקות כדי להסיר כל חומר מסיס שנותר, ולהשתמש בו כשליטה שלילית עבור כתמים מערביים (במיוחד עבור חלבונים גרעיניים).
13. לשטוף את גלולה גרעינים עם 500 μL של "חוצץ היפוטוני מלא" ולהעביר את הכדור לצינור חדש 1.7 מ"ל. צנטריפוגות הכדור מושעה ב 4,000 x גרם, 4 °C (5 דקות).
14. להשליך את supernatant ולהוסיף 500 μL של טרי "חוצץ היפוטוני מלא" לכדור הגרעיני ולהעביר את ההשעיה לצינור חדש 1.7 מ"ל. צנטריפוגה הדגימה שוב ב 4,000 x גרם, 4 °C (5 דקות).
15. הסר את supernatant ולהמיס את הכדור ב 40 μL של "חוצץ היפרטוני מלא". העבר את המתלים הגרעיניים החדשים לצינור חדש של 1.7 מ"ל, תייג את הצינור כ"שבר גרעיני", ואחסן אותו על קרח.
16. קבעו את ריכוז החלבון של שלושת השברים באמצעות ערכת כימות פלואורסצנטית.
    הערה: כמות החלבון הגרעיני שנרכשה משיטת זה יכולה לנוע בין 1-2 מיקרוגרם / μL.
17. Aliquot שברים גרעיניים לתוך צינורות חד פעמיים המכילים 6 מיקרוגרם של חלבון גרעיני ולהישבר בקרח יבש ואמבט אתנול. יש לאחסן ב-80 °C (70°F) עד לשימוש נוסף.

6. תעתיק

1. להפעיל ולחמם מראש בלוק חום ל 30 °C (50 °F).
2. הסר את הדברים הבאים ממערכת התמלול של Nulcear במערכת תמלול במבחנה : 50 מ"מ _MgCl2, חיץ תמלול 1x תמצית גרעינית, 100 mM rATP, 100 mM rGTP, 100 mM rUTP ותבנית השליטה החיובית של מקדם CMV. להפשיר על קרח.
   הערה: להגביר את תבנית ה- DNA שליטה חיובית באמצעות פולימראז בעל נאמנות גבוהה ולאחסן אותו כאליקוטים חד-פעמיים מנורמלים.
3. מערבבים וצנטריפוגות את rNTPs מופשר לפני הכנת פתרון עבודה 10 mM.
   הערה: הוסף 2 μL של כל rATP, rCTP, rGTP ו- rUTP ל- 12 μL של _H2O כדי להשיג 10 mM של כל rNTP. הרכב זה ניתן להגדיל במידת הצורך.
4. Aliquot תערובת rNTP לתווית צינורות חד פעמיים ולאחסן ב -20 °C (70 °F) לשימוש עתידי.
5. בצינור 1.5 מ"ל טרי שכותרתו "Mastermix" להוסיף את הריאגנטים לכל תגובה כאמור בטבלה 5
6. העבר 14 μL של Mastermix לכל צינור תגובה
7. הוסף 11 μL מינוס (נפח עבור 5 מיקרוגרם של התמצית הגרעינית) של 1x חיץ שעתוק לכל צינור תגובה.
8. הוסף 5 מיקרוגרם של התמצית הגרעינית לכל צינור תגובה.
9. הקש בעדינות על צינור התגובה כדי לערבב את התוכן בפנים ואת צנטריפוגות הדופק את הצינורות לאחר ערבוב כדי להבטיח שום חומר תגובה תקוע לקיר הצינורות.
10. לדגור על התגובות ב 30 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
11. הפסק מיד את התגובה על-ידי הוספת 400 μL של מאגר RLT המסופק על-ידי ערכת החילוץ של ה- RNA.
    הערה: בשלב זה, זה בטוח לעצור. ניתן לאחסן דגימות ב-80 °C (80 °F) עד לניקוי נוסף עם ערכת החילוץ של הרנ"א.

7. ניקוי RNA

1. הכן פתרון מלאי DNase I באמצעות ערכת DNase ללא RNase המסופקת בערכת החילוץ של ה- RNA. להמיס את DNase ליופילי I ב 550 μL של מים ללא RNase. מערבבים בעדינות את התמיסה. אל תמערבולת. Aliquot פתרון DNase I לתוך 10 צינורות חד פעמיים μL ולאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F).
2. הכן 70% ו 80% אתנול באמצעות אתנול מולקולרי ומים ללא RNase.
3. העבר את הדגימות והריגנטים לסביבת עבודה ללא RNase לפני תחילת הניקוי.
4. מוסיפים 400 μL של 70% אתנול לכל דגימה בעדינות פיפטה לערבב היטב.
5. העבר 400 μL של המדגם לעמוד ספין חילוץ RNA שכותרתו עם צינור איסוף 2 מ"ל וצנטריפוגה המדגם ב 8,500 x גרם עבור 30 s. זרוק את הזרימה דרך.
6. חזור על שלב 7.5 עם המדגם הנותר ומחק את הזרימה דרכה.
7. הוסף 350 μL של מאגר RW1 (ערכת חילוץ RNA) לכל עמודה. צנטריפוגה העמודות ב 8,500 x g עבור 30 s. זרוק את הזרימה דרך.
8. הוסף 70 μL של מאגר RDD (ערכת החילוץ RNA) כדי 10 μL aliquot יחיד של פתרון מלאי DNase I ולערבב בעדינות. אל תמערבולת.
9. מוסיפים את תערובת הדגירה DNase I (80 μL) ישירות לקרום עמוד הספין. לדגור על העמודים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
   הערה: הקפד להוסיף את פתרון DNase I לממברנה. הימנע מאובדן חלק מהפתרון לקיר העמודה או לטבעת O.
10. לאחר 15 דקות, הוסף 350 μL של מאגר RW1 לעמודות. צנטריפוגה ל-30 s ב-8,500 x גרם. זרוק את הזרימה דרך.
11. מקם את העמודות בצינורות איסוף חדשים של 2 מ"ל. הוסף 500 μL של מאגר RPE (ערכת חילוץ RNA) לעמודת הסיבוב. צנטריפוגות העמודים ב 8,500 x g עבור 30 s לשטוף את הממברנה. זרוק את הזרימה דרך.
12. הוסף 500 μL של 80% אתנול לכל עמודה וצנטריפוגה העמודות ב 8,500 x g עבור 30 s. זרוק את הזרימה דרך.
13. מקם את העמודות בצינורות איסוף חדשים של 2 מ"ל. השאר את מכסי העמודות פתוחים, צנטריפוגה העמודות ב 17,900 x g במשך 5 דקות. זרוק את הזרימה דרך.
14. מקם את העמודות לתוך תוויות 1.7 mL צינורות. הוסף 17 μL של מים ללא RNase ישירות למרכז קרום עמוד ספין. תן לעמודים לנוח בטמפרטורת החדר במשך דקה אחת. צנטריפוגות העמודות ב 17,900 x g במשך 1 דקות.
15. השלך את העמודה ולשמור את צינור 1.7 מ"ל עם דגימת RNA מטוהרת טרי.

8. עיכול DNA

1. מחממים שני גושי חום ב-37 °C (65 °F) ו-65 °C (65 °F).
2. הוסף 2 μL של מאגר תגובה 10x לכל מדגם.
3. הוסף 1 μL (1 MBU) של DNase לכל מדגם.
4. הגדר פיפטה ל 10 μL ו pipette הפתרון החדש למעלה ולמטה לערבב בעדינות. אל תמערבולת.
5. לדגור על דגימות RNA ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות כדי לעכל את כל ה- DNA הנותר.
6. לנטרל את DNase על ידי דגירה הדגימות על בלוק החום ב 65 °C (65 °F) במשך 10 דקות.
   הערה: זה בטוח לעצור בשלב זה ולאחסן את RNA ב -80 °C (80 °F) כדי לבצע תמלול הפוך מאוחר יותר.

9. תמלול הפוך

1. בעת תכנות התרמוציקלר, להוסיף עוד 1 שעות, 37 °C צעד לפני הדגירה לחמם מראש את התרמוציקלר. הפעל את התוכנית עם 'שלב לחמם מראש' תוך הכנת הדגימות ולתת התרמוציקלר להגיע 37 °C (50 °F). כאשר הדגימות עבור תמלול הפוך מוכנות, דלג על שלב התחממות מראש של 37 °C והמשיך לשלב הדגירה בפועל (טבלה 6). אם התרמו-מחזור אין תכונה לדלג, להוסיף 1 דקות 37 °C צעד לפני הדגירה. אפשר התרמוציקלר לחמם לטמפרטורה הנכונה לפני השהייה של המערכת והוספת הדגימות המוכנות.
2. הכן פתרון עבודה של 10 מיקרומטר של פריימר הפוך תמלול ב- _H2O ללא RNase ולאחסן אותו על קרח.
3. הפשרה על קרח, חיץ פי 10 מערכת התמלול ההפוכה, תערובת dNTP (5 מ"מ כל dNTP), מעכב RNase והתמלול ההפוך.
4. הכן Mastermix (לכל תגובה) על-ידי הוספת המרכיבים המוזכרים בטבלה 7 לצינור PCR נקי של 0.2 מ"ל.
5. Aliquot 18 μL של Mastermix לתוך צינורות PCR חדשים 0.2 מ"ל עבור כל מדגם.
6. הוסף 2 μL של RNA מטופל DNase עבור כל מדגם לתוך הצינורות שלהם בהתאמה מסומנת.
7. לדגור על הדגימות ב 37 °C (55 °F) במשך 1 שעות תרמוציקלר מחומם מראש.
8. העבר את הדגימות אל -20 °C לאחסון לאחר תמלול הפוך או המשך ישירות לשלב הבא.
   הערה: זה בטוח לעצור בשלב זה; לאחסן את cDNA ב -20 °C (50 °F) לשימוש מאוחר יותר.

10. הגברת מוצר ספציפית

1. הפשרה על קרח: cDNA, 10 μM שעתוק קדימה 10 μM תמלול הפריימרים הפוכים, ואת PCR 2x Premix A.
   הערה: Aliquot ה- PCR 2x Premix A לאמצעי אחסון קטנים יותר כדי לקצר את זמן ההפשרה.
2. צור Mastermix (לכל תגובה) על-ידי הוספת המרכיבים המוזכרים בטבלה 8 לצינור PCR נקי של 0.2 מ"ל.
3. Aliquot 24 μL של Mastermix עבור כל מדגם לתוך נקי שכותרתו 0.2 מ"ל PCR צינורות.
4. הוסף 1 μL של cDNA של כל דגימה לתוך הצינורות המתאימים שלהם.
5. לדגור על הדגימות בתרמוציקלר באמצעות תנאי התוכנית המוזכרים בטבלה 9
6. לאחר הדגירה, לאחסן את מוצרי PCR ב 4 °C (5 °F) או -20 °C (50 °F) לאחסון לטווח ארוך יותר.

11. ניתוח ג'ל

1. השתמש במאגר 1x TAE להכנת ג'ל המכיל 2% w /v של אגרוז וכתם ג'ל 1x.
2. הפעל את מוצרי PCR ב 50 V ו 300 mA עבור 1 שעה או עד שיש הפרדת פס ברורה.
3. צלם את הג'ל באמצעות תוכנת החשיפה האוטומטית שנטענה מראש בדימוי הג'ל.

תוצאות

בעקבות הצעדים המתוארים אמור להניב תמצית גרעינית תפקודית (איור 1),סטייה בשלבי השחיקה או הכביסה עלולה להוביל לפעילות לקויה או לתפוקות נמוכות. אם תתקבל תמצית גרעינית פונקציונלית C. elegans , זה יהיה לתמלל את האזור במורד הזרם של מקדם CMV על תבנית ה- DNA כאשר נוסף ...

Discussion

C. elegans הוא אורגניזם מודל מושך ללמוד את מערכת התמלול האוקריוטית בגלל התחזוקה הזולה שלה ואת הקלות של מניפולציה גנטית. כאן פרוטוקול לבידוד עקבי של תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית מ L4 C. elegans מתואר. למרות שפרוטוקול זה התמקד בהדמיית פעילות התמלול, ניתן לכמת את ה- cDNA שהופק לאחר שעתוק ב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010