JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتصف الدراسة بروتوكولا لإنشاء كميات كبيرة من الحمض النووي (ميكروغرام ملغ) لحملات فحص البروتين من شظايا الجينات الاصطناعية دون استنساخ أو استخدام الخلايا الحية. يتم هضم القالب الحد الأدنى بشكل انزيمي وتعميمها ثم تضخيمها باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal. يمكن إجراء ردود فعل التعبير الخالي من الخلايا مع المنتج غير المتحقق منه.

Abstract

يصف هذا البروتوكول تصميم قالب الحمض النووي الأدنى وخطوات التضخيم الأنزيمي ، مما يتيح النماذج الأولية السريعة للبروتينات القابلة للقول في أقل من 24 ساعة باستخدام التعبير الخالي من الخلايا. بعد تلقي الحمض النووي من بائع ، يتم تضخيم جزء الجين PCR ، وقطع ، وتعميمها ، والتبريد المصرفية. ثم يتم تخفيف كمية صغيرة من الحمض النووي المصرفية وتضخيمها بشكل كبير (تصل إلى 106× ) باستخدام تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA). RCA يمكن أن تسفر عن كميات ميكروغرام من قالب التعبير الحد الأدنى من مستويات بيكوغرام من المواد بدءا (مستويات ملغ إذا تم استخدام كل جزء الاصطناعية بدءا). في هذا العمل، أدى مبلغ يبدأ من 20 pg في 4 ميكروغرام من المنتج النهائي. يمكن إضافة منتج RCA الناتج (سلسلة من القالب الأدنى) مباشرة إلى رد فعل خال من الخلايا دون خطوات تنقية. ونظرا إلى أن هذه الطريقة تعتمد كليا على PCR، فقد تمكن من بذل جهود فحص عالية الإنتاجية في المستقبل عندما تقترن بأنظمة مناولة السائل الآلي.

Introduction

وقد برز التعبير الجيني الخالي من الخلايا (CFE) كأداة قوية مع العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الكشف عن الأمراض1،2،3،4،5،6، المغذيات الدقيقة والكشف عن الجزيئات الصغيرة7،8،9،10،11،12، الكتلة الحيوية13،14،15،16،17 ,18, التعليم19,20,21, تصنيع البروتينات الصعبة17,22,23,24,25,26,27, وفرز المتغير23,28,29,30,31,32 ,33. ويرجع ذلك إلى الطبيعة المفتوحة للأنظمة الخالية من الخلايا والمرونة التي تمنحها. العديد من المقالات استعراض كبير تقديم التعليم التاريخي ووجهات النظر المستقبلية على التكنولوجيا34،35،36،37،38،39،40،41،42،43،44.

يتكون التفاعل النموذجي الخالي من الخلايا من ثلاثة مكونات رئيسية: استخراج الخلايا ومزيج الطاقة والقالب الوراثي. استخراج الخلية النشطة يحتوي على جميع الآلات اللازمة للنسخ والترجمة (TXTL) ويمكن معالجتها في مجموعة متنوعة من الطرق36. وسيطة جليكوليتيك، الشوارد، الأحماض الأمينية، والعوامل المساعدة في مزيج الطاقة دعم عملية TXTL. وهو مصدر رئيسي للتغير في التجارب الخالية من الخلايا45 ويمكن إعدادها بطرق عديدة34،46. وقد شهد إعداد القالب الجيني تحسينات أقل لأن أساليب الاستنساخ التقليدية تؤدي إلى البلازميدات ذات الخصائص التعبيرية الممتازة. والجانب السلبي لهذه الأساليب التقليدية هو وقت التحول ومقدار الخبرة البيولوجية اللازمة لبنائها ونشرها. وقد أسفرت جهود التحسين الأخيرة في سير العمل بسيطة 24 ساعة لإعداد استخراج الخلية47،48 التي يمكن القيام بها بالتوازي مع إعداد مزيج الطاقة49،50. ومع ذلك، يضيف الاستنساخ التقليدي عدة أيام إلى الجدول الزمني للنماذج الأولية CFE (الجدول 1)23. يمكن استخدام منتجات PCR المضخمة بسرعة من جزء الجينات التجارية مباشرة51، ولكن هذا يحد من عدد تجارب النماذج الأولية حيث يتم إنتاج 1 ميكروغرام فقط من الحمض النووي ، وهو ما يتوافق مع ما يقرب من خمسة ردود فعل (أحجام 15 ميكرولتر التقليدية). مع هذه الخطوات الإضافية من التعميم والتضخيم isothermal، أكبر من كميات ملليغرام من الحمض النووي ممكن (~ 5000 ردود الفعل ل1 ملغ). وهذا يزيد بشكل كبير من عدد الاختبارات التي يمكن إجراؤها في فحص عالي الإنتاجية للبروتينات أو شبكات الإنزيمات الجمعية (الهندسة الأيضية الخالية من الخلايا)؛ كما أنه يسمح للحفاظ الفعال على مكتبة القالب الخطي كما الحمض النووي تركيز عالية. وعلاوة على ذلك، سيكون من الضروري زيادة كمية القالب لنماذج أولية لكميات أكبر من البروتين اللازمة لتطبيقات علوم المواد (الألياف القائمة على البروتين والهيدروجلز). يمكن التغلب على بعض القيود من القوالب الخطية باستخدام استخراج من BL21 DE3 ستار أو باستخدام أساليب اكتشفت مؤخرا لحماية القوالب الخطية من تدهور52،53،54. بيد أن هذا لا يتناول وجود مخزونات محدودة من الحمض النووي المنتج من قبل البائعين من أجل تضخيم ال PCR أو مسألة الخبرة البيولوجية والمعدات اللازمة للاستنساخ.

يقدم هذا العمل بروتوكولا مصمما بشكل صريح لزيادة كمية قالب التعبير التي يمكن الحصول عليها من كميات صغيرة من شظايا الجينات المنتجة من قبل البائع (عادة 500-1000 نانوغرام من مسحوق الليوفيلي). ولا تتطلب الطريقة الموصوفة المهارات اللازمة لإجراء الاستنساخ التقليدي في البلازميدات أو التحول والانتشار في الخلايا الحية. عند تلقي جزء الجينات في البريد، يمكن للمستخدم إنتاج ما يكفي من القوالب للعديد من ردود الفعل الخالية من الخلايا عن طريق توظيف تضخيم دائرة المتداول isothermal (RCA) (الشكل 1)23. وفي حين أن كمية الحمض النووي الواردة من البائع قد تكون كافية لجهود الفحص المحدودة، فإنها تنفد بسرعة، وإعادة شراء شظايا الجينات تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. هذه الطريقة هي أيضا مناسبة بشكل خاص للجينات التي هي سامة ويصعب استنساخها في الإشريكية القولونية.

Protocol

1. تصميم جزء الجينات

ملاحظة: يجب أن تحتوي جزء الجينات على جميع العناصر الوراثية اللازمة للنسخ/ الترجمة، بما في ذلك المروج وموقع الربط الريبوسوم (RBS) وبدء كودون وجين الفائدة والمنهي. بينما المنهي غير ضروري لقالب تعبير خطي (LET) ، سيكون من المهم إذا قرر المستخدم إدراج التسلسل في plasmid. تم رفع هذه التسلسلات من pJL1-sfGFPplasmid 55 (هدية من مختبر مايكل جويت) ، والذي يستخدم مروج T7. بالإضافة إلى هذه العناصر الوراثية الضرورية ، يتم إضافة موقع قطع إنزيم تقييد ستة أزواج أساسية قبل المروج (موقع قطع 5) وستة أزواج أساسية أخرى بعد المنهي (موقع القطع 3) ، في هذه الحالة باستخدام HindIII (يمكن استخدام إنزيمات تقييد أخرى ، ولكن من المفيد توحيد التسلسلات مع إنزيم تقييد عالي الدقة لتقليل العدد اللازم للاحتفاظ به في المكتبة). يتم إضافة مواقع التمهيدي عشرة أزواج قاعدة المنبع من موقع قطع 5 'وعشرة أزواج قاعدة المصب من موقع قطع 3 '، في هذه الحالة باستخدام تسلسل التمهيدي M13 موحدة (التمهيديات هي عناصر الأسهم غير مكلفة). موقع إنزيم تقييد والمبرمجين المستخدمة هي في تقدير المستخدم. ومع ذلك، يجب على المستخدم التأكد من أن التسلسلات غير موجودة في أي مكان آخر في القالب (لا تريد إنشاء تخفيضات غير مرغوب فيها أو مواقع بدء التضخيم). يتم تفصيل تسلسل القوالب المستخدمة في هذا العمل في المواد التكميلية. يتم استخدام هذه الخطوات لتعديل من هذا القالب الأساسي.

  1. تحديد الجين المطلوب للتعبير عنه والحصول على تسلسل الأحماض الأمينية أو التسلسل الجيني إذا تم التعبير عنه في الإشريكية القولونية.
  2. إذا كان تسلسل الأحماض الأمينية، أداء كودون الأمثل لE. القولونية باستخدام واحدة من العديد من أدوات البائع القياسية56. إذا كنت تستخدم القالب المتوفر في الملحق، تأكد من أن التسلسل الأمثل لا يحتوي على مواقع تقييد HindIII (AAGCTT). في حالة حدوث ذلك، استمر في تحسين التسلسل حتى لا يعد هناك موقع HindIII.
  3. نسخ التسلسل ولصقه في القالب المقدم للتسلسل التكميلي رقم 1 حيث يشار إلى جين الاهتمام. إذا كان التعبير عن sfGFP، استخدم التسلسل التكميلي رقم 1 كما هو. إذا كان التعبير عن subtilisin، استخدم التسلسل التكميلي رقم 2 كما هو.
  4. اطلب الحد الأدنى من القالب والمبرمجين اللازمين من خدمة تركيب الحمض النووي المفضلة.

2. إعادة تعليق جزء الجينات والمبرمجين

ملاحظة: عند استلام جزء الجينات، اتبع بروتوكولات الشركة المصنعة لإعادة الإنفاق أو استخدم هذا الدليل البسيط لإنشاء مخزون الحمض النووي.

  1. الطرد المركزي الأنبوب (300 × ز لمدة 5 ق) لجمع بيليه الحمض النووي في الجزء السفلي.
  2. إضافة الماء المقطر مزدوجة (DDH2O) لجعل تركيز النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر من قالب الحمض النووي.
  3. دوامة الحل على إعداد متوسط لمدة 5-10 ق.
  4. حل بيليه كامل عن طريق احتضان في 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  5. دوامة لفترة وجيزة مرة أخرى
  6. جهاز طرد مركزي في 300 × ز لمدة 5 ق لجمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. تخزين في -20 درجة مئوية أو استخدامها في PCR.
  8. إعداد مخزون التمهيدي 100 ميكرومتر عن طريق إعادة تعليق التمهيديات في المياه الخالية من النيوكليز. لتحديد كمية المياه لإضافة، ضرب عدد نانومول من التمهيدي الليوفيلية بنسبة 10. على سبيل المثال، إذا كان الأنبوب يحتوي على 45 nM من التمهيدي lyophilized، إضافة 450 ميكرولتر من ddH2O ودوامة الحل.
  9. تخزين حلول الأسهم التمهيدي في -20 درجة مئوية أو الاستمرار في تنفيذ التضخيم.

3. تضخيم جزء الجينات عن طريق PCR

ملاحظة: تحديد أي مجموعة PCR هو حق لجين الفائدة. الجينات الصغيرة (<1000 كيلوبايت) قد تكون أكثر قابلية لبوليميراز تاك أرخص، في حين أن الجينات الكبيرة (≥1000 kb) قد تستفيد من البوليميراز عالية الدقة للحد من الأخطاء. ومن المهم ملاحظة أن هذا التضخيم الأولي ل PCR ليس ضروريا إذا لم يكن المستخدم مهتما بالحفاظ على جزء الجينات الأولي (فهو يوفر محاولات متعددة للتعميم ويسمح بإجراء دراسات مقارنة لمنتج LET vs. RCA). ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن هذا PCR تضخيم LET يمكن استخدامها مباشرة في ردود الفعل; غير أنه، كما ذكر في المقدمة، لن يسمح بعدد محدود من ردود الفعل إلا إذا تم تجاهل خطوات التضخيم الأخرى. يمكن إجراء الهضم وربط على جزء الجينات resuspended مباشرة57 (إذا كان أحد على يقين، فإنها لن تحتاج إلى مزيد من LET لأداء مخزونات التعميم إضافية). إذا كانت هذه هي الحالة، تخطي المقطع 3 ثم متابعة إلى القسم 4. لتنفيذ PCR اتبع الخطوات التالية.

  1. استخدم مخزون 100 ميكرومتر من الخطوة 2.8 لإنشاء حلول عمل 10 ميكرومتر. العديد من بروتوكولات عدة PCR الدعوة إلى حلول 10 ميكرومتر من التمهيديات.
  2. برمجة دورة الحرارية لإجراء رد الفعل وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة للمجموعة. مجموعات مختلفة تدعو إلى معلمات ركوب الدراجات متنوعة قليلا. بالنسبة للمجموعة المذكورة في جدول المواد، تكون الظروف 94 درجة مئوية لمدة 30 s من التشبع الأولي ؛ 30 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 s من الإزالة، 45 درجة مئوية لمدة 30 s من تمي التمهيدي، و 68 درجة مئوية لمدة 60 s من التمديد؛ مع تمديد النهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ وأخيرا، عقد 10 درجة مئوية لأجل غير مسمى.
    1. تأكد من تحديد وقت الاستطالة الصحيح (متغير اعتمادا على طول الجين الذي سيتم تضخيمه). لديك وقت استطالة 1 دقيقة لكل 1000 نقطة أساس.
    2. تأكد من إدخال درجة حرارة التلين الصحيحة للمبرمجين. استخدام آلة حاسبة TM على الانترنت التي تستخدم كل من التمهيديات كمدخلات لتحديد أفضل درجة حرارة التلين58. درجة حرارة التلين من 45 درجة مئوية كافية عند استخدام التمهيديات M13.
    3. عند تحديد عدد الدورات، راجع بروتوكول الشركة المصنعة، ولكن غالبا ما تؤدي 30 دورة إلى تضخيم كاف.
  3. إذا كان أداء PCR، إذابة دوامة dNTPs. استخدم المخزن المؤقت PCR المتوفر في المجموعة.
  4. في أنبوب PCR واحد، والجمع بين جميع مكونات عدة وفقا لتوجيهات في بروتوكول الشركة المصنعة. لضمان التضخيم الناجح، أضف 1 ميكرولتر من مخزون الحمض النووي الذي أعيد إنفاقه (الخطوة 2.6).
  5. تجانس الخليط برفق عن طريق الدوامة على إعداد متوسط لمدة 5-10 ق. بدلا من ذلك، ماصة نصف حجم صعودا وهبوطا 10-20 مرات إلى دوامة.
  6. تنفيذ رد فعل PCR.
  7. إذا لم يتضمن بروتوكول PCR خطوة تبريد نهائية، فسمح لرد الفعل بالتبريد لمدة 5 دقائق عند 10 درجة مئوية قبل إزالته لدفع التكثيف إلى أسفل الأنبوب.
  8. تنقية رد الفعل باستخدام مجموعة تنظيف PCR باتباع تعليمات البائع.
    1. في أنبوب 1.5 مل، أضف مخزن ربط الحمض النووي وعينة PCR بنسبة 5:1، على التوالي.
    2. نقل هذا الخليط إلى العمود تدور والطرد المركزي في 16،000 × ز لمدة دقيقة واحدة. تجاهل التدفق من خلال.
    3. أضف 200 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي إلى العمود واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
    4. جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 16،000 × ز والتخلص من تدفق من خلال.
    5. كرر الخطوتين 2.8.3 و 2.8.4 دون خطوة حضانة دقيقة واحدة.
    6. جهاز طرد مركزي لمدة 1-2 دقيقة إضافية في 16000 x g لإزالة أي عازلة المتبقية.
    7. Elute الحمض النووي في 46 ميكرولتر من DDH2O.
  9. قياس الحمض النووي المنقى باستخدام مطياف.
  10. تخزين الحمض النووي المنقى في -20 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.

4. الهضم والتعميم

ملاحظة: يمكن تحقيق المزيد من التضخيم عن طريق تعميم الحمض النووي متبوعا ب RCA. هضم الحمض النووي لإعداد القالب للتعميم. سيؤدي هذا إلى إزالة تسلسلات التمهيدي وإنشاء نهايات لزجة في طرفي 5 و 3 ' من القالب. إعادة ربط هذه الغايات عن طريق رد فعل الربط.

  1. في أنبوب PCR، اجمع 5 ميكرولتر من العازلة اللازمة، و20 U من HindIII، و45 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى من الخطوة 3.8.
  2. تجانس بلطف هذا الخليط مع ماصة.
  3. احتضان الخليط في دورة الحرارية لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
  4. الحرارة تعطيل HindIII عن طريق احتضان لمدة 20 دقيقة في 80 درجة مئوية.
  5. السماح لرد الفعل لتبرد إلى 10 درجة مئوية قبل إزالة لدفع التكثيف إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت T4 ligase و 800 U من T4 ligase إلى الحمض النووي هضم حديثا.
    1. استخدام T7 ligase، إذا رغبت في ذلك.
  7. تجانس بلطف هذا الخليط مع ماصة.
  8. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية لأداء رد فعل التعميم.
  9. تنقية رد الفعل باستخدام مجموعة تنظيف PCR باتباع تعليمات البائع. استخدم نفس البروتوكول المفصل في الخطوة 3.8.
  10. قياس الحمض النووي باستخدام مطياف. القيم المتوقعة هي ~ 20 نانوغرام / ميكرولتر.
  11. تخزين في -20 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.

5. تضخيم دائرة المتداول Isothermal

ملاحظة: يمكن إجراء تضخيم دائرة المتداول (RCA) باستخدام مجموعة أدوات تجارية أو مع مكونات تم شراؤها بشكل فردي. بعد بروتوكول الشركة المصنعة سيضمن التضخيم الناجح. مجموعات تحتوي عادة على عينة عازلة، رد فعل العازلة، وخيطا إزاحة البوليميراز، مثل φ29 بوليمراز. يمكن الجمع بين أنابيب التفاعل المتعددة لإنتاج كمية كبيرة من الحمض النووي للتعبير الخالي من الخلايا (4 ميكروغرام من 20 pg من مواد البدء). يعمل البروتوكول التالي بكفاءة.

  1. في أنبوب واحد، اجمع 20 ميكرولتر من مخزن العينة المؤقت، و20 ميكرولتر من حاجز التفاعل، و0.8 ميكرولتر من الإنزيم، و1 ميكرولتر من قالب التعبير الدائري (CET) من الخطوة 4.9.
    ملاحظة: سيكون لهذا كتلة الحمض النووي الإجمالي ~ 20 نانوغرام، ولكن RCA يمكن أن تعمل مع كميات بيكوغرام، مما يسمح لتخفيف CET والتضخيم الأنزيمي المدقع إذا كان هناك حاجة كبيرة للمواد في فحص الإنتاجية العالية.
  2. تجانس الخليط مع ماصة وaliquot 10 ميكرولتر من الخليط في أربعة أنابيب منفصلة.
  3. حضانة في 30 درجة مئوية لمدة 4-18 ساعة.
  4. الحرارة تعطيل الانزيم عن طريق احتضان في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. خفض درجة الحرارة إلى 12 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشجيع التكثيف في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: من الأسهل الجمع بين جميع خطوات درجة الحرارة في بروتوكول تلقائي على دورة حرارية.
  5. تمييع الحل الناتج عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من ddH2O إلى كل أنبوب.
  6. الجمع بين جميع الأنابيب وإضافة مباشرة إلى رد فعل خالية من الخلايا.
  7. إذا رغبت في ذلك، استخدم مجموعة تنظيف PCR لتنقية المنتج وelute في 36 ميكرولتر من ddH2O لتحديد كميا. تأكد من أن تركيز القالب هو ~ 100 نانوغرام / ميكرولتر.

6. رد فعل خال من الخلايا

ملاحظة: تنفيذ التعبير الخالي من الخلايا عن طريق دمج الطاقة المخزن المؤقت واستخراج قالب RCA. يتكون التفاعل النموذجي الخالي من الخلايا باستخدام المخزن المؤقت للطاقة PANOx-SP من 1.2 مللي متر ATP، 0.85 مللي متر لكل من GMP، UMP، وCMP، 30 mM فوسفوينولبيروفات، 130 مللي متر الغلوتامات البوتاسيوم، 10 مللي متر الأمونيوم الغلوتامات، 12 مل الغلوتامات المغنيسيوم، 1.5 mM الحيوانات المنوية، 1 mM putrescine، 34 ميكروغرام / مل من حمض الفولينيك، 171 ميكروغرام / مل من خليط E. coli tRNA، 2 م م كل من 20 الأحماض الأمينية غير المسمي، 0.33 mM NAD، 0.27 mM انزيم A (CoA)، 4 mM أوكسالات البوتاسيوم، 57 mM HEPES-KOH العازلة (pH 7.5)، 0.24٪ حجم استخراج الإشريكية القولونية، وكميات متغيرة من الحمض النووي23،49. حجم رد الفعل يمكن أن تختلف ولكن 15 μL ردود الفعل يمكن أن ينقذ على استخدام الكاشف وصغيرة بما يكفي للاستخدام في 384 لوحة صغيرة سوداء الجدران49,50.

  1. إذا كان التعبير عن بروتين الفلورسنت مثل sfGFP، وإعداد قارئ لوحة لقراءة في الإثارة المطلوبة / الانبعاثات، ودرجة الحرارة، والهياج.
  2. إذا كنت تستخدم لوحة 384 بئرا، عليكوت 60 ميكرولتر من H 2 O فيالآبارالمتاخمة لعينة فارغة جيدا للحفاظ على الرطوبة والحد من تأثير الحافة.
  3. إضافة المكونات المطلوبة المختلفة في أنبوب لكل عينة. إضافة ما يكفي لأداء ثلاثية. يمكن أن تساعد النسخ المتماثلة داخل اللوحة في تحديد أسباب التباين.
    1. إضافة استخراج، ومخازن الطاقة المؤقتة ومن ثم الحمض النووي.
    2. تمييع إلى الحجم النهائي المطلوب مع DDH2O.
  4. امزج هذا الحل جيدا عن طريق إخراج نصف حجم الحل لأعلى ول لأسفل 10-20 مرة.
  5. نقل خليط التفاعل في 15 μL aliquots إلى الآبار المطلوبة في لوحة microtiter.
  6. ختم لوحة مع فيلم ختم عديم اللون للحفاظ على الرطوبة ومنع التبخر.
  7. ضع اللوحة المغلقة في قارئ اللوحة واترك رد الفعل يكتمل.
    1. إذا كان التعبير عن البروتين الذي لا يملك القدرة على رصد العيش، واستخدام جهاز آخر درجة الحرارة التي تسيطر عليها مثل thermoblock لاحتضان لوحة.

7. فحص سوبتيليسين

ملاحظة: إذا كان التعبير عن الجين subtilisin BPN '(SBT(n)) في التسلسل التكميلي # 2، اتبع هذا البروتوكول إلى المقايسة النشاط.

  1. إعداد حل الأسهم 10 ميكرومتر من N-succinyl-Ala-علاء-برو-في ف-نيترانيلايد في ثنائي ميثيلفورماميد (DMF).
  2. تعيين قارئ لوحة لقياس الامتصاص في 410 نانومتر كل 20 ق لمدة 10 دقيقة مع الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية.
  3. في أسفل مسطح، عديم اللون 96-لوحة جيدا، aliquot 94 ميكرولتر من ddH2O و 1 ميكرولتر من N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide من الخطوة 7.1.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من رد الفعل الخالي من الخلية النهائي من الخطوة 6.7 وقراءة باستخدام قارئ لوحة تعيين إلى البروتوكول الموضح في الخطوة 7.2.

النتائج

التعبير عن sfGFP من قوالب RCA كان مماثلا لتلك التي من pJL1 plasmid عند استخدام فقط 0.30 ميكرولتر من الحمض النووي RCA غير مبور في رد فعل 15 ميكرولتر (الشكل 2A). في الواقع، مضاعفة ومضاعفة كمية القالب يبدو أن لا تقدم أي فائدة في استخراج نجمة DE3 BL21، مما يشير إلى مستويات مشبعة بالفعل من القالب في 0...

Discussion

الجين من الفائدة يمكن أن يكون أي البروتين المطلوب، ولكن من الأفضل أن تبدأ مع بروتين الفلورسنت كمراسل مريحة للقراءة في الوقت الحقيقي أو نهاية نقطة على قارئ لوحة جيدا لمتبنين جدد لهذه الطريقة. لتسلسل البروتين الجديد، نسخ تسلسل الأحماض الأمينية من البروتين المطلوب ولصقه في أداة التحسين كود?...

Disclosures

يعمل نايجل رويل في المجلس الاستشاري العلمي لشركة BigHat Biosciences Inc. ، وهي شركة تستخدم أنظمة خالية من الخلايا لتصميم الأجسام المضادة.

Acknowledgements

يقر المؤلفان بأن NIH 1R35GM138265-01 وNSF 2029532 للحصول على دعم جزئي لهذا المشروع.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved