JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המחקר מתאר פרוטוקול ליצירת כמויות גדולות (מיקרוגרם-מ"ג) של DNA עבור קמפיינים הקרנת חלבונים מרסיסי גנים סינתטיים ללא שיבוט או שימוש בתאים חיים. התבנית המינימלית מתעכלת באופן אנזימטי ומעגלית ולאחר מכן מוגברת באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל. תגובות חופש התא יכול להתבצע עם המוצר שלא שאושר.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את העיצוב של תבנית DNA מינימלית ואת השלבים להגברה אנזימטית, המאפשרת טיפוס מהיר של חלבונים הניתנים לבדיקה בפחות מ-24 שעות באמצעות חופש הביטוי של התא. לאחר קבלת DNA מספק, שבר הגן הוא PCR מוגבר, לחתוך, מעגלי, ו cryo-בנקאות. כמות קטנה של ה- DNA הבנקאי מדוללת ומוגברת באופן משמעותי (עד 106x) באמצעות הגברה איזותרמית מתגלגלת של מעגל (RCA). RCA יכול להניב כמויות מיקרוגרם של תבנית הביטוי המינימלית מרמות פיקוגרמה של חומר התחלתי (רמות מ"ג אם נעשה שימוש בכל הקטע הסינתטי ההתחלתי). בעבודה זו, כמות התחלתית של 20 pg הביא 4 מיקרוגרם של המוצר הסופי. ניתן להוסיף את מוצר RCA המתקבל (ויתור על התבנית המינימלית) ישירות לתגובה נטולת תאים ללא שלבי טיהור. בשל שיטה זו להיות מבוסס PCR לחלוטין, זה עשוי לאפשר מאמצי סינון תפוקה גבוהה בעתיד בשילוב עם מערכות טיפול נוזלי אוטומטי.

Introduction

ביטוי גנים ללא תאים (CFE) הופיע ככלי רב עוצמה עם יישומים רבים. יישומים כאלה כוללים גילוי מחלות1,2,3,4,5,6, מיקרונוטריאנט וזיהוי מולקולות קטנות7,8,9,10,11,12, biomanufacturing13,14,15,16,17 ,18, חינוך19,20,21, ייצור חלבונים קשים17,22,23,24,25,26,27, והקרנהמשתנה 23,28,29,30,31,32 ,33. זאת בשל האופי הפתוח של מערכות ללא תאים והגמישות שהן מעניקות. מאמרי סקירה גדולים רבים מציעים חינוך היסטורי ונקודות מבט עתידיות על הטכנולוגיה34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

תגובה טיפוסית ללא תאים מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: תמצית תאים, תערובת אנרגיה ותבנית גנטית. תמצית תא פעיל מכיל את כל המכונות הדרושות עבור שעתוק ותרגום (TXTL) וניתן לעבד במגווןדרכים 36. מתווכים גליקוליטיים, אלקטרוליטים, חומצות אמינו וקופות פחמן מתמהיל האנרגיה תומכים בתהליך TXTL. זהו מקור עיקרי של שונות בניסויים ללא תאים45 והוא יכול להיות מוכן במובנים רבים34,46. הכנת התבנית הגנטית ראתה פחות שיפורים מאז שיטות שיבוט מסורתיות לגרום plasmids עם מאפייני ביטוי מעולה. החיסרון בשיטות מסורתיות אלה הוא זמן התפנית וכמות המומחיות הביולוגית הדרושה כדי לבנות ולהפיץ אותם. מאמצי אופטימיזציה אחרונים הביאו זרימות עבודה פשוטות של 24 שעות להכנת תמצית תאים47,48 שניתן לבצע במקביל להכנת תערובתאנרגיה 49,50. עם זאת, שיבוט מסורתי מוסיף ימים מרובים לציר הזמן של עיצוב-טיפוס של CFE(טבלה 1)23. ניתן להשתמש במוצרי PCR מוגברים במהירות מרסיס הגן המסחרי ישירות51, אך זה מגביל את מספר ניסויי האב-טיפוס שכן מיוצר רק מיקרוגרם אחד של DNA, אשר מתאים לכחמש תגובות (כרכים μL מסורתיים). עם שלבים נוספים אלה של סיבובי הגברה איזותרמית, גדול יותר מכמויות מיליגרם של ה- DNA אפשרי (~ 5,000 תגובות עבור 1 מ"ג). זה מגדיל באופן דרמטי את מספר הבדיקות שניתן לבצע בהקרנה בתפוקה גבוהה של חלבונים או רשתות אנזימים קומבינטוריות (הנדסה מטבולית ללא תאים); זה גם מאפשר שימור יעיל של ספריית התבניות הליניארית כדנ"א בריכוז גבוה. יתר על כן, כמות מוגברת של תבנית יהיה צורך אב טיפוס כמויות גדולות יותר של חלבון הדרוש עבור יישומי מדעי החומר (סיבים מבוססי חלבון הידרוג'ל). ניתן להתגבר על מגבלות מסוימות של תבניות ליניאריות באמצעות תמצית מ- BL21 DE3 Star או באמצעות שיטות שהתגלו לאחרונה כדי להגן על תבניות ליניאריות מפני השפלה52,53,54. עם זאת, אין זה מתייחס למלאי מוגבל של DNA המיוצר על ידי ספק להגברת PCR או לנושא המומחיות הביולוגית והציוד הדרוש לשיבוט.

עבודה זו מציגה פרוטוקול שתוכנן במפורש כדי להגדיל את כמות תבנית הביטוי שניתן להשיג מכמויות קטנות של שברי גנים המיוצרים על ידי ספק (בדרך כלל 500-1000 ננוגרם של אבקת ליופילים). השיטה המתוארת אינה דורשת את הכישורים הדרושים לביצוע שיבוט מסורתי ב plasmids או שינוי והתפשטות בתאים חיים. עם קבלת שבר גנים בדואר, משתמש יכול לייצר מספיק תבניות עבור תגובות רבות ללא תאים על ידי שימוש בהגברת מעגל מתגלגל איזותרמי (RCA) (איור 1)23. בעוד שכמות הדנ"א המתקבלת מהספק עשויה להספיק למאמצי סינון מוגבלים, היא מתרוקנת במהירות, ורכישת שברי גנים מחדש גוזלת זמן ויקר. השיטה גם מתאימה במיוחד לגנים רעילים וקשה לשכפול ב- E. coli.

Protocol

1. עיצוב שבר הגן

הערה: שבר הגן צריך להיות כל האלמנטים הגנטיים הדרושים עבור שעתוק / תרגום, כולל מקדם, אתר כריכה ריבוזום (RBS), להתחיל קודון, גן העניין, ומחסל. בעוד המחסל אינו הכרחי עבור תבנית ביטוי ליניארי (LET), זה יהיה חשוב אם המשתמש מחליט להוסיף את הרצף לתוך plasmid. רצפים אלה הוסרו מן pJL1-sfGFP plasmid55 (מתנה מהמעבדה של מייקל ג'ואט), המשתמשת ביחצ"ן T7. בנוסף לאלמנטים גנטיים הכרחיים אלה, הוסיף אתר אנזים מוגבלת שישה זוגות בסיס לפני המקדם (5 'אתר לחתוך) ועוד שישה זוגות בסיס לאחר המחסל (3 'אתר לחתוך), במקרה זה באמצעות HindIII (אנזימי הגבלה אחרים ניתן להשתמש, אבל זה מועיל לתקנן את הרצפים עם אנזים אחד הגבלת נאמנות גבוהה כדי להפחית את המספר הדרוש כדי לשמור בספרייה). אתרי פריימר מתווספים עשרה זוגות בסיס במעלה הזרם של האתר 5 'לחתוך עשרה זוגות בסיס במורד הזרם של האתר 3 'לחתוך, במקרה זה באמצעות רצפי פריימר M13 סטנדרטי (פריימרים הם פריטי מלאי זולים). אתר האנזים ההגבלה והפריימרים המשמשים נמצאים על פי שיקול דעתו של המשתמש. עם זאת, על המשתמש לוודא שהרצפים אינם קיימים בשום מקום אחר בתבנית (לא רוצה ליצור חתכים לא רצויים או אתרים של אתחול הגברה). הרצפים עבור התבניות המשמשות בעבודה זו מפורטים בחומר המשלים. שלבים אלה משמשים לשינוי מתבנית בסיס זו.

  1. לקבוע את הגן הרצוי לבוא לידי ביטוי ולקבל את רצף חומצת האמינו או את הרצף הגנטי אם זה בא לידי ביטוי E. coli.
  2. אם זה רצף חומצת אמינו, לבצע אופטימיזציה קודון עבור E. coli באמצעות אחד מכלים ספק סטנדרטיים רבים56. אם אתה משתמש בתבנית המסופקת בתוספת, ודא שלרצף הממוטב אין אתרי הגבלה HindIII (AAGCTT). במקרה שהוא עושה, להמשיך לייעל את הרצף עד שאין יותר אתר HindIII.
  3. העתק את הרצף והדבק אותו בתבנית שסופקה עבור רצף משלים #1 שבו מצוין גן העניין. אם אתם מביעים את sfGFP, השתמשו ברצף משלים מס' 1 כפי שהוא. אם מבטאים subtilisin, להשתמש רצף משלים #2 כפי שהוא.
  4. הזמינו את התבנית המינימלית ואת הפריימרים הדרושים משירות סינתזת הדנ"א המועדף.

2. הכנסה חוזרת של שבר הגן ואת הפריימרים

הערה: עם קבלת שבר הגן, בצע את פרוטוקולי היצרן לחידוש או השתמש במדריך פשוט זה כדי ליצור מלאי DNA.

  1. צנטריפוגה הצינור (300 x גרם עבור 5 s) כדי לאסוף את כדורי ה- DNA בתחתית.
  2. הוסף מים מזוקקים כפולים (ddH2O) כדי להפוך את הריכוז הסופי של 10 ננוגרם / μL של תבנית DNA.
  3. מערבולת הפתרון על הגדרה בינונית עבור 5-10 s.
  4. ממיסים את כל הכדור על ידי דגירה ב 50 °C (50 °F) במשך 20 דקות.
  5. מערבולת בקצרה שוב
  6. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 s כדי לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור.
  7. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) או להשתמש ב- PCR.
  8. הכן מלאי פריימר 100 מיקרומטר על ידי שימוש חוזר בפריימרים במים ללא גרעין. כדי לקבוע את כמות המים להוסיף, להכפיל את מספר nanomoles של פריימר ליופילי על ידי 10. לדוגמה, אם הצינור מכיל 45 ננומטר של פריימר ליופילי, להוסיף 450 μL של ddH2O ומערבולת הפתרון.
  9. לאחסן את פתרונות מלאי פריימר ב -20 °C (20 °F) או להמשיך לבצע את ההגברה.

3. להגביר את שבר הגן באמצעות PCR

הערה: החלט איזו ערכת PCR מתאימה לגן העניין. גנים קטנים יותר (<1,000 kb) עשויים להיות נוחים יותר לפולימראז טאק זול יותר, בעוד גנים גדולים יותר (≥1,000 kb) עשויים להפיק תועלת מפולימראז אמינות גבוהה כדי להפחית שגיאות. חשוב לציין כי הגברה ראשונית זו של PCR אינה הכרחית אם המשתמש אינו מודאג משימור שבר הגן הראשוני (הוא מספק ניסיונות מרובים להסתמכות ומאפשר מחקרים השוואתיים של מוצר LET לעומת RCA). חשוב גם לציין כי זה PCR מוגבר LET ניתן להשתמש ישירות בתגובות; עם זאת, כפי שהוזכר בהקדמה, זה יאפשר רק מספר מוגבל של תגובות אם צעדי ההגברה הנוספים היו מתעלמים. עיכול וקשירה יכולים להתבצע על שבר הגן resuspended ישירות57 (אם אחד בטוח, הם לא יצטרכו יותר LET לבצע מלאי מעגלי נוסף). במקרה זה, דלג על סעיף 3 והמשיך לסעיף 4. לביצוע PCR, בצע את השלבים הבאים.

  1. השתמש במניות 100 μM החל בשלב 2.8 כדי ליצור פתרונות עבודה של 10 מיקרומטר. פרוטוקולי ערכת PCR רבים דורשים פתרונות 10 מיקרומטר של פריימרים.
  2. תכנת את רוכב האופניים התרמי כדי לנהל את התגובה בהתאם לפרוטוקולים של יצרן הערכה. ערכות שונות דורשות פרמטרים מעט מגוונים של רכיבה על אופניים. עבור הערכה המפורטת בטבלת החומרים, התנאים הם 94 °C (75 °F) עבור 30 s של denaturation הראשונית; 30 מחזורים של 94 °C (70 °F) עבור 30 מעלות צלזיוס של denaturing, 45 °C (55 °F) עבור 30 °C (30 ים) של חישול פריימר, ו 68 °C (60 °F) של הרחבה; עם הארכה סופית ב 68 °C (5 דקות; ולבסוף, אחיזה של 10 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.
    1. הקפד לבחור את זמן ההארכה הנכון (משתנה בהתאם לאורך הגן להיות מוגבר). יש זמן התארכות של 1 דקות עבור כל 1,000 bp.
    2. יש להקפיד על הזנת טמפרטורת הכישול הנכונה עבור הפריימרים. השתמש במחשבון Tm מקוון המשתמש בשני פריימרים כתשומות כדי לקבוע את טמפרטורת חישול הטובה ביותר58. טמפרטורת חישול של 45 °C (70 °F) מספיקה בעת שימוש בפריימרים M13.
    3. בעת קביעת מספר המחזורים, עיין בפרוטוקול היצרן, אך 30 מחזורים לרוב יביאו להגברה מספקת.
  3. אם מבצעים PCR, להפשיר ולמערבולת את dNTPs. השתמש במאגר ה- PCR המסופק בערכה.
  4. בצינור PCR יחיד, שלב את כל רכיבי הערכה לפי ההוראות בפרוטוקול היצרן. כדי להבטיח הגברה מוצלחת, הוסף 1 μL של מלאי DNA resuspended (שלב 2.6).
  5. בעדינות הומוגניזציה התערובת על ידי מערבולת על הגדרה בינונית עבור 5-10 s. לחלופין, pipette מחצית הנפח למעלה ולמטה 10-20 פעמים למערבולת.
  6. בצע את תגובת ה- PCR.
  7. אם פרוטוקול PCR לא כלל שלב קירור סופי, אפשר לתגובה להתקרר במשך 5 דקות ב 10 °C (70 °F) לפני הסרת כדי להניע עיבוי לתחתית הצינור.
  8. נקה את התגובה באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם להוראות הספק.
    1. בצינור 1.5 מ"ל, הוסף חיץ כריכת DNA ודגימת PCR ביחס של 5:1, בהתאמה.
    2. מעבירים את התערובת לעמודת הספין וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת. זרוק את הזרימה דרך.
    3. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף DNA לעמוד ודגור בטמפרטורת החדר במשך 1 דקות.
    4. צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-16,000 x גרם ומחקה את הזרימה.
    5. חזור על שלבים 2.8.3 ו- 2.8.4 ללא שלב הדגירה של דקה אחת.
    6. צנטריפוגה למשך 1-2 דקות נוספות ב-16,000 x ז', כדי להסיר כל מאגר שנותר.
    7. לחמוק DNA ב 46 μL של ddH2O.
  9. לכמת את הדנ"א המטוהר באמצעות ספקטרופוטומטר.
  10. לאחסן את ה- DNA המטוהר ב - -20 °C (50 °F) או להמשיך לשלב הבא.

4. עיכול ומעגליות

הערה: הגברה נוספת ניתן להשיג על ידי סיבוב ה- DNA ואחריו RCA. עכל את הדנ"א כדי להכין את התבנית למעגליות. פעולה זו תסיר את רצפי הפריימר ותיצור קצוות דביקים הן בקצוות של 5' ו- 3' של התבנית. לחבר מחדש את הקצוות האלה באמצעות תגובת קשירה.

  1. בצינור PCR, לשלב 5 μL של המאגר הדרוש, 20 U של HindIII, ו 45 μL של ה- DNA המטוהר משלב 3.8.
  2. בעדינות הומוגני תערובת זו עם פיפטה.
  3. לדגור על התערובת ברכב אופניים תרמי במשך 15 דקות ב 37 °C (50 °F).
  4. החום לאפעיל את הינדי על ידי דגירה במשך 20 דקות ב 80 °C (50 °F).
  5. אפשר לתגובה להתקרר ל 10 °C (50 °F) לפני הסרת כדי לנהוג עיבוי לתחתית הצינור.
  6. הוסף 5 μL של חיץ ligase T4 ו 800 U של T4 ligase ל- DNA שעוכל לאחרונה.
    1. השתמש T7 ligase, אם תרצה.
  7. בעדינות הומוגני תערובת זו עם פיפטה.
  8. לדגור על התערובת במשך 1 שעות ב 25 °C (5 °F) כדי לבצע את תגובת המעגליזציה.
  9. נקה את התגובה באמצעות ערכת ניקוי PCR בהתאם להוראות הספק. השתמש באותו פרוטוקול המפורט בשלב 3.8.
  10. לכמת את הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. הערכים הצפויים הם ~ 20 ng / μL.
  11. יש לאחסן ב- -20 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.

5. הגברה איזותרמית של מעגל מתגלגל

הערה: הגברה מעגל מתגלגל (RCA) ניתן לבצע באמצעות ערכה מסחרית או עם רכיבים שנרכשו בנפרד. ביצוע פרוטוקול היצרן יבטיח הגברה מוצלחת. ערכות מכילות בדרך כלל חיץ מדגם, מאגר תגובה, גדיל עקירת פולימראז, כגון φ29 פולימראז. צינורות תגובה מרובים ניתן לשלב כדי לייצר כמות גדולה של DNA עבור ביטוי חופש התא (4 מיקרוגרם מ 20 pg של חומר התחלתי). הפרוטוקול הבא פועל ביעילות.

  1. בצינור יחיד, שלב 20 μL של מאגר המדגם, 20 μL של מאגר התגובה, 0.8 μL של האנזים, ו 1 μL של תבנית הביטוי המעגלי (CET) משלב 4.9.
    הערה: זה יהיה מסת DNA הכוללת של ~ 20 ננוגרם, אבל RCA יכול לעבוד עם כמויות פיקוגרמה, ובכך לאפשר דילול של CET הגברה אנזימטית קיצונית אם יש צורך משמעותי בחומר בהקרנת תפוקה גבוהה.
  2. הומוגניזציה התערובת עם פיפטה aliquot 10 μL של התערובת לארבעה צינורות נפרדים.
  3. דגירה ב 30 °C (50 °F) עבור 4-18 שעות.
  4. חום לנטרל את האנזים על ידי דגירה ב 65 °C (65 °F) במשך 10 דקות. להפחית את הטמפרטורה ל 12 °C (5 דקות) כדי לעודד עיבוי בתחתית הצינור.
    הערה: הכי קל לשלב את כל שלבי הטמפרטורה בפרוטוקול אוטומטי על רוכב אופניים תרמי.
  5. לדלל את הפתרון המתקבל על ידי הוספת 15 μL של ddH2O לכל צינור.
  6. שלב את כל הצינורות והוסף ישירות לתגובה ללא תאים.
  7. אם תרצה, השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את המוצר ולהתחמק ממנו ב 36 μL של ddH2O כדי לכמת. ודא שריכוז התבנית הוא ~100 ננוגרם/μL.

6. תגובה ללא תאים

הערה: בצע ביטוי חופש תא על-ידי שילוב של מאגר אנרגיה, תמצית ותבנית RCA. תגובה אופיינית ללא תאים באמצעות מאגר האנרגיה PANOx-SP מורכבת מ- ATP של 1.2 מ"מ, 0.85 מ"מ כל אחד מה-GMP, UMP ו-CMP, 30 מ"מ זרחן, 130 מ"מ אשלגן גלוטמט, 10 מ"מ אמוניום גלוטמט, 12 מ"מ מגנזיום גלוטמט, 1.5 מ"מ זרע, 1 mM putrescine, 34 מיקרוגרם/מ"ל של חומצה פולינית, 171 מיקרוגרם/מ"ל של תערובת E. coli tRNA, 2 מ"מ כל אחת מ-20 חומצות אמינו ללא תווית, 0.33 מ"מ NAD, 0.27 מ"מ קואנזים A (CoA), 4 מ"מ אשלגן אוקסלט, 57 מ"מ חיץ HEPES-KOH (pH 7.5), 0.24% נפח תמצית E. coli, וכמויות משתנות של DNA23,49. נפח התגובה יכול להשתנות אבל 15 תגובות μL יכול לחסוך על שימוש ריאגנט והם קטנים מספיק לשימוש 384 מיקרו-לוח שחור49,50.

  1. אם מבטאים חלבון פלואורסצנטי כגון sfGFP, הכינו קורא לוחות לקריאה בהתרגשות/פליטה הרצויה, בטמפרטורה ובתסיסה.
  2. אם משתמשים בצלחת 384-well, aliquot 60 μL של H2O לתוך בארות הגובלות בדוגמה ריקה היטב כדי לשמור על לחות ולהפחית את אפקט הקצה.
  3. הוסף את הרכיבים הנדרשים השונים לתוך צינור עבור כל מדגם. הוסף מספיק כדי לבצע טריפליקאטים. שכפול בתוך הלוח יכול לסייע בזיהוי גורמים לשונות.
    1. מוסיפים את התמצית, את מאגר האנרגיה ואז את הדנ"א.
    2. לדלל את הנפח הרצוי הסופי עם ddH2O.
  4. ערבבו פתרון זה ביסודיות על ידי צנרת מחצית מנפח הפתרון למעלה ולמטה 10-20 פעמים.
  5. מעבירים את תערובת התגובה ב-15 μL aliquots לבארות הרצויות בצלחת המיקרו-תות.
  6. אוטמים את הצלחת בסרט איטום חסר צבע לשמירה על לחות ומניעת אידוי.
  7. מניחים את הצלחת האטומה בקורא הלוחות ומאפשרים לתגובה להסתיים.
    1. אם מבטאים חלבון שאין לו את היכולת להיות במעקב חי, השתמש במנגנון אחר מבוקר טמפרטורה כגון תרמובלוק כדי לדגור על הצלחת.

7. בדיקה תת-סטיליסין

הערה: אם מבטאים את הגן BPN' (SBT(n)) ברצף משלים מס ' 2, פעל לפי פרוטוקול זה כדי לאבחן את הפעילות.

  1. הכן פתרון מלאי 10 מיקרומטר של N-סוקציניל-עלא-אלה-פרו-Phe p-nitroanilide בדימתילפורמיד (DMF).
  2. הגדר קורא צלחת כדי למדוד ספיגה ב 410 ננומטר כל 20 s במשך 10 דקות תוך שמירה על טמפרטורה של 25 °C (70 °F).
  3. בתחתית שטוחה, צלחת 96-well חסר צבע, aliquot 94 μL של ddH2O ו 1 μL של N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide מהשלב 7.1.
  4. הוסף 5 μL של התגובה המוגמרת ללא תאים מהשלב 6.7 וקרא באמצעות קורא לוחות המוגדר לפרוטוקול המתואר בשלב 7.2.

תוצאות

ביטוי של sfGFP מתבניות RCA היה דומה לזה של pJL1 plasmid בעת שימוש רק 0.30 μL של DNA RCA לא מתואם בתגובת 15 μL (איור 2A). למעשה, הכפלה ושלשה של כמות התבנית נראה להציע שום תועלת תמצית BL21 DE3 כוכב, מציע רמות רוויות כבר של התבנית ב 0.30 μL לכל תגובה. לעומת זאת, נראה שיש יתרון בהגדלת כמות תבנית RCA כאשר מוסיפ...

Discussion

גן העניין יכול להיות כל חלבון רצוי, אבל עדיף להתחיל עם חלבון פלואורסצנטי ככתב נוח לקריאה בזמן אמת או נקודת קצה על קורא צלחת היטב עבור מאמצים חדשים של שיטה זו. עבור רצפי חלבון חדשים, להעתיק את רצף חומצת האמינו של החלבון הרצוי ולהדביק אותו לתוך כלי אופטימיזציה קודון הרצוי61,...

Disclosures

נייג'ל ראול מכהן בוועדה המדעית המייעצת של BigHat Biosciences Inc., חברה המשתמשת במערכות ללא תאים לתכנון נוגדנים.

Acknowledgements

המחברים מכירים NIH 1R35GM138265-01 ו- NSF 2029532 לתמיכה חלקית בפרויקט זה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved