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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’étude décrit un protocole pour créer de grandes quantités (μg-mg) d’ADN pour des campagnes de dépistage de protéines à partir de fragments de gènes synthétiques sans clonage ni utilisation de cellules vivantes. Le gabarit minimal est digéré et circularisé de manière enzymatique, puis amplifié à l’aide d’une amplification de cercle roulant isotherme. Des réactions d’expression sans cellules pourraient être effectuées avec le produit non purifié.

Résumé

Ce protocole décrit la conception d’un modèle d’ADN minimal et les étapes de l’amplification enzymatique, permettant le prototypage rapide de protéines testables en moins de 24 heures en utilisant l’expression sans cellule. Après avoir reçu de l’ADN d’un fournisseur, le fragment de gène est amplifié par PCR, coupé, circularisé et cryo-banc. Une petite quantité d’ADN mis en banque est ensuite diluée et amplifiée de manière significative (jusqu’à 106x) à l’aide de l’amplification isotherme du cercle roulant (RCA). RCA peut produire des quantités de microgrammes du modèle d’expression minimale à partir des niveaux de picogramme du matériau de départ (niveaux de mg si tous les fragments synthétiques de départ sont utilisés). Dans ce travail, une quantité de départ de 20 pg a donné 4 μg du produit final. Le produit RCA résultant (concatémère du gabarit minimal) peut être ajouté directement à une réaction sans cellule sans étapes de purification. Étant donné que cette méthode est entièrement basée sur la PCR, elle peut permettre de futurs efforts de criblage à haut débit lorsqu’elle est associée à des systèmes automatisés de manipulation des liquides.

Introduction

L’expression génique sans cellules (CFE) est devenue un outil puissant avec de nombreuses applications. Ces applications comprennent la détectionde maladies 1,2,3,4,5,6, la détection de micronutriments et de petites molécules7,8,9,10,11,12, biofabrication13,14,15,16,17 ,18, éducation19,20,21, fabrication de protéines difficiles17,22,23,24,25,26,27, et dépistage devariantes 23,28,29,30,31,32 ,33. Cela est dû à la nature ouverte des systèmes sans cellules et à la flexibilité qu’ils confèrent. De nombreux grands articles de synthèse offrent une éducation historique et des perspectives d’avenir sur la technologie34,35,36,37 , 38,39,40,41,42,43,44.

Une réaction typique sans cellule se compose de trois composants principaux: l’extrait cellulaire, le mélange énergétique et le modèle génétique. L’extrait de cellule active contient toutes les machines nécessaires à la transcription et à la traduction (TXTL) et peut être traité de différentes manières36. Les intermédiaires glycolytiques, les électrolytes, les acides aminés et les cofacteurs du mix énergétique soutiennent le processus TXTL. C’est une source majeure de variabilité dans les expériences sans cellules45 et peut être préparé de nombreuses façons34,46. La préparation du gabarit génétique a connu moins d’améliorations depuis que les méthodes de clonage traditionnelles aboutissent à des plasmides présentant d’excellentes caractéristiques d’expression. L’inconvénient de ces méthodes traditionnelles est le délai d’exécution et la quantité d’expertise biologique nécessaires pour les construire et les propager. Les efforts d’optimisation récents ont abouti à des flux de travail simples de 24 heures pour la préparation de l’extrait cellulaire47,48 qui peuvent être effectués en parallèle avec la préparation du mélange énergétique49,50. Cependant, le clonage traditionnel ajoute plusieurs jours à la chronologie de prototypage CFE (Tableau 1)23. Les produits pcR rapidement amplifiés à partir du fragment de gène commercial peuvent être utilisés directement51, mais cela limite le nombre d’expériences de prototypage car seulement 1 μg d’ADN est produit, ce qui correspond à environ cinq réactions (volumes traditionnels de 15 μL). Avec ces étapes supplémentaires de circularisation et d’amplification isotherme, des quantités supérieures à des milligrammes d’ADN sont possibles (~5 000 réactions pour 1 mg). Cela augmente considérablement le nombre de tests pouvant être effectués dans le criblage à haut débit de protéines ou de réseaux d’enzymes combinatoires (ingénierie métabolique sans cellule); il permet également de préserver efficacement la bibliothèque de modèles linéaires en tant qu’ADN à haute concentration. En outre, une quantité accrue de gabarit serait nécessaire pour prototyper de plus grandes quantités de protéines nécessaires aux applications de la science des matériaux (fibres à base de protéines et hydrogels). Certaines limitations des modèles linéaires peuvent être surmontées en utilisant un extrait de BL21 DE3 Star ou en utilisant des méthodes récemment découvertes pour protéger les modèles linéaires de la dégradation52,53,54. Cependant, cela ne traite pas des stocks limités d’ADN produit par les fournisseurs pour l’amplification par PCR ou de la question de l’expertise biologique et de l’équipement nécessaires au clonage.

Ce travail présente un protocole explicitement conçu pour augmenter la quantité de modèle d’expression qui peut être obtenue à partir de petites quantités de fragments de gènes produits par le fournisseur (généralement 500-1000 ng de poudre lyophilisée). La méthode décrite ne nécessite pas les compétences nécessaires pour effectuer le clonage traditionnel dans les plasmides ou la transformation et la propagation dans les cellules vivantes. En recevant un fragment de gène par la poste, un utilisateur peut produire suffisamment de modèles pour de nombreuses réactions sans cellules en utilisant l’amplification isotherme en cercle roulant (RCA) (Figure 1)23. Bien que la quantité d’ADN reçue du fournisseur puisse être suffisante pour des efforts de dépistage limités, elle est rapidement épuisée et le rachat de fragments de gènes prend du temps et coûte cher. La méthode est également particulièrement bien adaptée aux gènes toxiques et difficiles à cloner chez E. coli.

Protocole

1. Conception du fragment de gène

REMARQUE: Le fragment de gène doit avoir tous les éléments génétiques nécessaires à la transcription / traduction, y compris le promoteur, le site de liaison des ribosomes (RBS), le codon de départ, le gène d’intérêt et le terminateur. Bien que le terminateur ne soit pas nécessaire pour un modèle d’expression linéaire (LET), il sera important que l’utilisateur décide d’insérer la séquence dans un plasmide. Ces séquences ont été extraites du plasmide pJL1-sfGFP55 (don du laboratoire de Michael Jewett), qui utilise un promoteur T7. En plus de ces éléments génétiques nécessaires, un site de coupe d’enzyme de restriction est ajouté six paires de bases avant le promoteur (site de coupe de 5') et six autres paires de bases après le terminateur (site de coupe de 3'), dans ce cas en utilisant HindIII (d’autres enzymes de restriction peuvent être utilisées, mais il est utile de normaliser les séquences avec une enzyme de restriction haute fidélité pour réduire le nombre nécessaire à conserver dans la bibliothèque). Les sites d’amorce sont ajoutés dix paires de bases en amont du site de coupe de 5' et dix paires de bases en aval du site de coupe de 3', dans ce cas en utilisant des séquences d’amorce M13 standardisées (les amorces sont des articles de stock peu coûteux). Le site d’enzyme de restriction et les amorces utilisées sont à la discrétion de l’utilisateur. Cependant, l’utilisateur doit s’assurer que les séquences ne sont présentes nulle part ailleurs dans le modèle (ne veut pas créer de coupes indésirables ou de sites d’initiation d’amplification). Les séquences des modèles utilisés dans ce travail sont détaillées dans le matériel supplémentaire. Ces étapes sont utilisées pour modifier à partir de ce modèle de base.

  1. Déterminer le gène souhaité à exprimer et obtenir la séquence d’acides aminés ou la séquence génétique s’il a été exprimé chez E. coli.
  2. S’il s’agit d’une séquence d’acides aminés, effectuez l’optimisation du codon pour E. coli à l’aide de l’un des nombreux outils standard du fournisseur56. Si vous utilisez le modèle fourni dans le supplément, assurez-vous que la séquence optimisée n’a pas de sites de restriction HindIII (AAGCTT). Dans le cas où c’est le cas, continuez à optimiser la séquence jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de site HindIII.
  3. Copiez la séquence et collez-la dans le modèle fourni pour la séquence supplémentaire #1 où le gène d’intérêt est indiqué. Si vous exprimez sfGFP, utilisez la séquence supplémentaire #1 telle quelle. Si vous exprimez la subtilisine, utilisez la séquence supplémentaire #2 telle quelle.
  4. Commandez le modèle minimal et les amorces nécessaires auprès du service de synthèse d’ADN préféré.

2. Réanimer le fragment de gène et les amorces

REMARQUE: À la réception du fragment de gène, suivez les protocoles du fabricant pour la remise en suspension ou utilisez ce guide simple pour créer un stock d’ADN.

  1. Centrifugez le tube (300 x g pendant 5 s) pour prélever la pastille d’ADN au fond.
  2. Ajouter de l’eau double distillée (ddH2O) pour obtenir une concentration finale de 10 ng/μL de gabarit d’ADN.
  3. Vortex la solution sur un réglage moyen pendant 5-10 s.
  4. Dissoudre la pastille entière en incubant à 50 °C pendant 20 min.
  5. Brièvement vortex à nouveau
  6. Centrifuger à 300 x g pendant 5 s pour recueillir la solution au fond du tube.
  7. Conserver à -20 °C ou utiliser en PCR.
  8. Préparer un apprêt de 100 μM en remettant les amorces dans de l’eau sans nucléase. Pour déterminer la quantité d’eau à ajouter, multipliez le nombre de nanomoles d’apprêt lyophilisé par 10. Par exemple, si le tube contient 45 nM d’apprêt lyophilisé, ajoutez 450 μL de ddH2O et vortexez la solution.
  9. Conservez les solutions mères d’apprêt à -20 °C ou continuez à effectuer l’amplification.

3. Amplifier le fragment de gène par PCR

REMARQUE: Décidez quel kit de PCR convient au gène d’intérêt. Les gènes plus petits (<1 000 kb) peuvent être plus propices à une Taq polymérase moins chère, tandis que les gènes plus gros (≥1 000 kb) peuvent bénéficier d’une polymérase haute fidélité pour réduire les erreurs. Il est important de noter que cette amplification initiale par PCR n’est pas nécessaire si l’utilisateur n’est pas préoccupé par la préservation du fragment de gène initial (elle fournit de multiples tentatives de circularisation et permet des études comparatives du produit LET vs RCA). Il est également important de noter que ce LET amplifié par PCR peut être utilisé directement dans les réactions; toutefois, comme indiqué dans l’introduction, elle ne permettrait qu’un nombre limité de réactions si les étapes d’amplification supplémentaires n’étaient pas prises en compte. La digestion et la ligature peuvent être effectuées sur le fragment de gène remis en suspension directement57 (si l’on est certain, ils n’auront pas besoin de plus de LET pour effectuer des stocks de circularisation supplémentaires). Si tel est le cas, sautez l’article 3 et passez à l’article 4. Pour effectuer la PCR, procédez comme suit.

  1. Utilisez les stocks de 100 μM de l’étape 2.8 pour créer des solutions de travail de 10 μM. De nombreux protocoles de kit PCR nécessitent des solutions d’amorces de 10 μM.
  2. Programmez le cycleur thermique pour qu’il effectue la réaction conformément aux protocoles du fabricant du kit. Différents kits nécessitent des paramètres de cyclisme légèrement variés. Pour le kit listé dans le Tableau des Matériaux, les conditions sont de 94 °C pour 30 s de dénaturation initiale ; 30 cycles de 94 °C pour 30 s de dénaturation, 45 °C pour 30 s de recuit d’apprêt et 68 °C pour 60 s d’extension; avec une extension finale à 68 °C pendant 5 min; et enfin, une retenue indéfinie de 10 °C.
    1. Assurez-vous de sélectionner le temps d’allongement correct (variable en fonction de la longueur du gène à amplifier). Avoir un temps d’allongement de 1 min pour chaque 1 000 pb.
    2. Assurez-vous d’entrer la bonne température de recuit pour les apprêts. Utilisez un calculateur Tm en ligne qui utilise les deux amorces comme entrées pour déterminer la meilleure température de recuit58. Une température de recuit de 45 °C est suffisante lors de l’utilisation d’apprêts M13.
    3. Pour déterminer le nombre de cycles, reportez-vous au protocole du fabricant, mais 30 cycles entraîneront le plus souvent une amplification suffisante.
  3. Si vous effectuez une PCR, décongelez et vortexez les dNTP. Utilisez le tampon PCR fourni dans le kit.
  4. Dans un seul tube PCR, combinez tous les composants du kit comme indiqué dans le protocole du fabricant. Pour assurer une amplification réussie, ajoutez 1 μL de stock d’ADN remis en suspension (étape 2.6).
  5. Homogénéiser doucement le mélange en vortexant sur le réglage moyen pendant 5-10 s. Alternativement, pipettez la moitié du volume vers le haut et vers le bas 10-20 fois pour vortex.
  6. Effectuez la réaction PCR.
  7. Si le protocole PCR n’incluait pas d’étape de refroidissement finale, laissez la réaction refroidir pendant 5 min à 10 °C avant de la retirer pour entraîner la condensation au fond du tube.
  8. Purifiez la réaction à l’aide d’un kit de nettoyage PCR en suivant les instructions du fournisseur.
    1. Dans un tube de 1,5 mL, ajoutez un tampon de liaison à l’ADN et un échantillon de PCR dans un rapport de 5:1, respectivement.
    2. Transférer ce mélange dans la colonne de spin et centrifuger à 16 000 x g pendant 1 min. Jetez le flux.
    3. Ajouter 200 μL de tampon de lavage d’ADN à la colonne et incuber à température ambiante pendant 1 min.
    4. Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g et jeter le débit.
    5. Répétez les étapes 2.8.3 et 2.8.4 sans l’étape d’incubation de 1 min.
    6. Centrifuger pendant 1 à 2 minutes supplémentaires à 16 000 x g pour éliminer tout tampon restant.
    7. Éluez l’ADN dans 46 μL de ddH2O.
  9. Quantifiez l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
  10. Conservez l’ADN purifié à -20 °C ou passez à l’étape suivante.

4. Digestion et circularisation

REMARQUE: Une amplification supplémentaire peut être obtenue en circularisant l’ADN suivi de RCA. Digérez l’ADN pour préparer le modèle à la circularisation. Cela supprimera les séquences d’amorce et créera des extrémités collantes aux extrémités 5' et 3' du modèle. Rattrapez ces extrémités par réaction de ligature.

  1. Dans un tube PCR, combiner 5 μL du tampon nécessaire, 20 U de HindIII et 45 μL de l’ADN purifié de l’étape 3.8.
  2. Homogénéiser doucement ce mélange avec une pipette.
  3. Incuber le mélange dans un cycleur thermique pendant 15 min à 37 °C.
  4. La chaleur inactive HindIII en incubant pendant 20 min à 80 °C.
  5. Laissez la réaction refroidir à 10 °C avant de la retirer pour entraîner la condensation au fond du tube.
  6. Ajouter 5 μL de tampon T4 ligase et 800 U de T4 ligase à l’ADN nouvellement digéré.
    1. Utilisez T7 ligase, si vous le souhaitez.
  7. Homogénéiser doucement ce mélange avec une pipette.
  8. Incuber le mélange pendant 1 h à 25 °C pour effectuer la réaction de circularisation.
  9. Purifiez la réaction à l’aide d’un kit de nettoyage PCR en suivant les instructions du fournisseur. Utilisez le même protocole que celui détaillé à l’étape 3.8.
  10. Quantifiez l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Les valeurs attendues sont d’environ 20 ng/μL.
  11. Conserver à -20 °C ou passer à l’étape suivante.

5. Amplification isotherme du cercle de roulement

REMARQUE: L’amplification du cercle roulant (RCA) peut être effectuée à l’aide d’un kit commercial ou avec des composants achetés individuellement. Suivre le protocole du fabricant assurera une amplification réussie. Les kits contiennent généralement un tampon d’échantillon, un tampon de réaction et une polymérase déplaçant le brin, telle que la polymérase φ29. Plusieurs tubes de réaction peuvent être combinés pour produire une grande quantité d’ADN pour l’expression sans cellule (4 μg à partir de 20 pg de matière première). Le protocole suivant fonctionne efficacement.

  1. Dans un seul tube, combiner 20 μL du tampon de l’échantillon, 20 μL du tampon de réaction, 0,8 μL de l’enzyme et 1 μL du gabarit d’expression circulaire (CET) de l’étape 4.9.
    REMARQUE: Cela aura une masse totale d’ADN d’environ 20 ng, mais RCA peut fonctionner avec des quantités de picogrammes, permettant ainsi la dilution du CET et une amplification enzymatique extrême s’il y a un besoin important de matériel dans le criblage à haut débit.
  2. Homogénéiser le mélange avec une pipette et aliquoter 10 μL du mélange en quatre tubes séparés.
  3. Incuber à 30 °C pendant 4-18 h.
  4. La chaleur inactive l’enzyme en incubant à 65 °C pendant 10 min. Réduire la température à 12 °C pendant 5 min pour favoriser la condensation au fond du tube.
    REMARQUE: Il est plus facile de combiner toutes les étapes de température dans un protocole automatisé sur un cycleur thermique.
  5. Diluer la solution obtenue en ajoutant 15 μL de ddH2O à chaque tube.
  6. Combinez tous les tubes et ajoutez-les directement à une réaction sans cellule.
  7. Si vous le souhaitez, utilisez un kit de nettoyage PCR pour purifier le produit et l’éluer dans 36 μL de ddH2O à quantifier. Assurez-vous que la concentration du gabarit est d’environ 100 ng/μL.

6. Réaction sans cellule

REMARQUE : Effectuez une expression sans cellule en combinant le tampon d’énergie, l’extrait et le modèle RCA. Une réaction typique sans cellule utilisant le tampon énergétique PANOx-SP se compose de 1,2 mM d’ATP, 0,85 mM chacun de GMP, UMP et CMP, 30 mM de phosphoénolpyruvate, 130 mM de glutamate de potassium, 10 mM de glutamate d’ammonium, 12 mM de glutamate de magnésium, 1,5 mM de spermidine, 1 mM de putrescine, 34 μg/mL d’acide folinique, 171 μg/mL de mélange d’ARNt E. coli, 2 mM chacun de 20 acides aminés non marqués, 0,33 mM de NAD, 0,27 mM de coenzyme A (CoA), 4 mM d’oxalate de potassium, 57 mM de tampon HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24 % du volume de l’extrait d’E. coli et des quantités variables d’ADN23,49. Le volume de réaction peut varier, mais les réactions de 15 μL peuvent économiser sur l’utilisation de réactifs et sont suffisamment petites pour être utilisées dans une microplaque à paroi noire384 49,50.

  1. Si vous exprimez une protéine fluorescente telle que sfGFP, préparez un lecteur de plaques pour lire à l’excitation / émission, à la température et à l’agitation souhaitées.
  2. Si vous utilisez une plaque de 384 puits, aliquotez 60 μL deH2O dans les puits bordant un puits d’échantillon vide pour maintenir l’humidité et réduire l’effet de bord.
  3. Ajoutez les différents composants requis dans un tube pour chaque échantillon. Ajoutez-en assez pour effectuer des triplés. Les réplications dans la plaque peuvent aider à identifier les causes de la variabilité.
    1. Ajoutez l’extrait, le tampon d’énergie puis l’ADN.
    2. Diluer jusqu’au volume final souhaité avec ddH2O.
  4. Mélangez soigneusement cette solution en pipetant la moitié du volume de la solution vers le haut et vers le bas 10 à 20 fois.
  5. Transférer le mélange réactionnel dans des aliquotes de 15 μL dans les puits souhaités dans la plaque de microtitrage.
  6. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité incolore pour maintenir l’humidité et empêcher l’évaporation.
  7. Placez la plaque scellée dans le lecteur de plaque et laissez la réaction se terminer.
    1. Si vous exprimez une protéine qui n’a pas la capacité d’être surveillée en direct, utilisez un autre appareil à température contrôlée tel qu’un thermobloc pour incuber la plaque.

7. Dosage de la subtilisine

REMARQUE: Si vous exprimez le gène BPN' (SBT(n)) de la subtilisine dans la séquence supplémentaire #2,suivez ce protocole pour tester l’activité.

  1. Préparer une solution mère de 10 μM de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide dans du diméthylformamide (DMF).
  2. Réglez un lecteur de plaques pour mesurer l’absorbance à 410 nm toutes les 20 s pendant 10 minutes tout en maintenant une température de 25 °C.
  3. Dans une plaque de 96 puits incolore à fond plat, aliquote 94 μL de ddH2O et 1 μL de N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide à partir de l’étape 7.1.
  4. Ajouter 5 μL de la réaction sans cellule finie de l’étape 6.7 et lire à l’aide d’un lecteur de plaques défini selon le protocole décrit à l’étape 7.2.

Résultats

L’expression de sfGFP à partir de gabarits RCA était comparable à celle du plasmide pJL1 lorsqu’on n’utilisait que 0,30 μL d’ADN RCA non purifié dans une réaction de 15 μL(Figure 2A). En fait, doubler et tripler la quantité de gabarit ne semble offrir aucun avantage dans l’extrait d’étoile BL21 DE3, suggérant des niveaux déjà saturés du gabarit à 0,30 μL par réaction. Inversement, il semble y avoir un avantage à augmenter la quantité de gabarit RCA lorsqu’il e...

Discussion

Le gène d’intérêt peut être n’importe quelle protéine désirée, mais il est préférable de commencer avec une protéine fluorescente comme rapporteur pratique pour la lecture en temps réel ou le point final sur un lecteur de plaque de puits pour les nouveaux adoptants de cette méthode. Pour les nouvelles séquences de protéines, copiez la séquence d’acides aminés de la protéine souhaitée et collez-la dans l’outil d’optimisation du codon souhaité61,

Déclarations de divulgation

Nigel Reuel siège au conseil consultatif scientifique de BigHat Biosciences Inc., une société qui utilise des systèmes sans cellules pour la conception d’anticorps.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent NIH 1R35GM138265-01 et NSF 2029532 pour leur soutien partiel à ce projet.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

Références

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