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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Lo studio descrive un protocollo per la creazione di grandi quantità (μg-mg) di DNA per campagne di screening proteico da frammenti di geni sintetici senza clonazione o utilizzando cellule viventi. Il modello minimo viene digerito enzimaticamente e circolarizzato e quindi amplificato utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento. Le reazioni di espressione senza cellule potrebbero essere eseguite con il prodotto non purificato.

Abstract

Questo protocollo descrive la progettazione di un modello minimo di DNA e le fasi per l'amplificazione enzimatica, consentendo la prototipazione rapida di proteine testabili in meno di 24 ore utilizzando l'espressione senza cellule. Dopo aver ricevuto il DNA da un fornitore, il frammento di gene viene amplificato dalla PCR, tagliato, circolarizzato e crio-banked. Una piccola quantità di DNA depositato viene quindi diluita e amplificata in modo significativo (fino a 106x) utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento (RCA). RCA può produrre quantità di microgrammi del modello di espressione minima dai livelli di picogramma del materiale di partenza (livelli di mg se viene utilizzato tutto il frammento sintetico iniziale). In questo lavoro, una quantità iniziale di 20 pg ha portato a 4 μg del prodotto finale. Il prodotto RCA risultante (concatemero del modello minimo) può essere aggiunto direttamente a una reazione priva di cellule senza fasi di purificazione. Poiché questo metodo è interamente basato sulla PCR, potrebbe consentire futuri sforzi di screening ad alta produttività se abbinato a sistemi automatizzati di gestione dei liquidi.

Introduzione

L'espressione genica senza cellule (CFE) è emersa come un potente strumento con molte applicazioni. Tali applicazioni includono il rilevamento di malattie1,2,3,4,5,6,il rilevamento di micronutrienti e piccole molecole7,8,9,10,11,12,bioproduzione13,14,15,16,17 ,18, istruzione19,20,21, produzione di proteine difficili17,22,23,24,25,26,27e screening variante23,28,29,30,31,32 ,33. Ciò è dovuto alla natura aperta dei sistemi privi di cellule e alla flessibilità che conferiscono. Molti articoli di grande recensione offrono educazione storica e prospettive future sulla tecnologia34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Una tipica reazione senza cellule è costituita da tre componenti principali: estratto cellulare, mix energetico e modello genetico. L'estratto di cellule attive contiene tutti i macchinari necessari per la trascrizione e la traduzione (TXTL) e può essere elaborato in vari modi36. Intermedi glicolitici, elettroliti, amminoacidi e cofattori nel mix energetico supportano il processo TXTL. È una delle principali fonti di variabilità negli esperimenti senza cellule45 e può essere preparato in molti modi34,46. La preparazione del modello genetico ha visto meno miglioramenti poiché i metodi di clonazione tradizionali si traducono in plasmidi con eccellenti caratteristiche di espressione. Il rovescio della medaglia di questi metodi tradizionali è il tempo di consegna e la quantità di competenze biologiche necessarie per costruirli e propagarli. I recenti sforzi di ottimizzazione hanno portato a semplici flussi di lavoro 24 ore su 24 per la preparazione dell'estratto cellulare47,48 che possono essere eseguiti in parallelo con la preparazione del mix energetico49,50. Tuttavia, la clonazione tradizionale aggiunge più giorni alla timeline di prototipazione CFE (Tabella 1)23. I prodotti PCR rapidamente amplificati dal frammento di gene commerciale possono essere utilizzati direttamente51, ma questo limita il numero di esperimenti di prototipazione in quanto viene prodotto solo 1 μg di DNA, che corrisponde a circa cinque reazioni (volumi tradizionali di 15 μL). Con questi ulteriori passaggi di circolarizzazione e amplificazione isotermica, è possibile quantità superiori a milligrammi di DNA (~ 5.000 reazioni per 1 mg). Ciò aumenta notevolmente il numero di test che possono essere effettuati nello screening ad alto rendimento di proteine o reti enzimatiche combinatorie (ingegneria metabolica senza cellule); consente inoltre un'efficace conservazione della libreria di modelli lineari come DNA ad alta concentrazione. Inoltre, sarebbe necessaria una maggiore quantità di template per prototipare maggiori quantità di proteine necessarie per le applicazioni di scienza dei materiali (fibre e idrogel a base di proteine). Alcune limitazioni dei modelli lineari possono essere superate utilizzando un estratto da BL21 DE3 Star o utilizzando metodi scoperti di recente per proteggere i modelli lineari dal degrado52,53,54. Tuttavia, ciò non riguarda l'avere scorte limitate di DNA prodotto dal fornitore per l'amplificazione della PCR o la questione delle competenze biologiche e delle attrezzature necessarie per la clonazione.

Questo lavoro presenta un protocollo esplicitamente progettato per aumentare la quantità di modello di espressione che può essere ottenuto da piccole quantità di frammenti di geni prodotti dal fornitore (in genere 500-1000 ng di polvere liofilizzata). Il metodo descritto non richiede le competenze necessarie per eseguire la clonazione tradizionale in plasmidi o la trasformazione e la propagazione in cellule viventi. Dopo aver ricevuto un frammento di gene per posta, un utente può produrre abbastanza modelli per molte reazioni prive di cellule utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento (RCA) (Figura 1)23. Mentre la quantità di DNA ricevuta dal fornitore può essere sufficiente per sforzi di screening limitati, si esaurisce rapidamente e il riacquisto di frammenti di geni richiede tempo e denaro. Il metodo è anche particolarmente adatto per i geni che sono tossici e difficili da clonare in E. coli.

Protocollo

1. Progettazione del frammento di gene

NOTA: Il frammento genico deve avere tutti gli elementi genetici necessari per la trascrizione/traduzione, tra cui il promotore, il sito di legame del ribosoma (RBS), il codone di partenza, il gene di interesse e il terminatore. Mentre il terminatore non è necessario per un modello di espressione lineare (LET), sarà importante se l'utente decide di inserire la sequenza in un plasmide. Queste sequenze sono state sollevate dal plasmide55 pJL1-sfGFP (dono del laboratorio di Michael Jewett), che utilizza un promotore T7. Oltre a questi elementi genetici necessari, viene aggiunto un sito di taglio enzimatico di restrizione sei coppie di basi prima del promotore (sito di taglio 5') e altre sei coppie di basi dopo il terminatore (sito di taglio 3'), in questo caso usando HindIII (altri enzimi di restrizione possono essere utilizzati, ma è utile standardizzare le sequenze con un enzima di restrizione ad alta fedeltà per ridurre il numero necessario per mantenere nella libreria). Ai siti di primer vengono aggiunte dieci coppie di basi a monte del sito di taglio da 5' e dieci coppie di basi a valle del sito di taglio da 3', in questo caso utilizzando sequenze di primer M13 standardizzate (i primer sono articoli di riserva economici). Il sito enzimatico di restrizione e i primer utilizzati sono a discrezione dell'utente. Tuttavia, l'utente deve assicurarsi che le sequenze non siano presenti in nessun'altra parte del modello (non vogliono creare tagli indesiderati o siti di avvio dell'amplificazione). Le sequenze per i modelli utilizzati in questo lavoro sono dettagliate nel materiale supplementare. Questi passaggi vengono utilizzati per modificare da questo modello di base.

  1. Determinare il gene desiderato da esprimere e ottenere la sequenza aminoacidica o la sequenza genetica se è stata espressa in E. coli.
  2. Se si tratta di una sequenza di amminoacidi, eseguire l'ottimizzazione del codone per E. coli utilizzando uno dei tanti strumenti standard del fornitore56. Se si utilizza il modello fornito nel supplemento, assicurarsi che la sequenza ottimizzata non abbia siti di restrizione HindIII (AAGCTT). Nel caso in cui lo faccia, continuare a ottimizzare la sequenza fino a quando non c'è più un sito HindIII.
  3. Copia la sequenza e incollala nel modello fornito per la sequenza supplementare #1 in cui è indicato il gene di interesse. Se si esprime sfGFP, utilizzare la sequenza supplementare #1 così com'è. Se si esprime subtilisina, utilizzare la sequenza supplementare #2 così com'è.
  4. Ordina il modello minimo e i primer necessari dal servizio di sintesi del DNA preferito.

2. Risusegnare il frammento di gene e i primer

NOTA: Al ricevimento del frammento genetico, seguire i protocolli del produttore per la risospensione o utilizzare questa semplice guida per creare un ceppo di DNA.

  1. Centrifugare il tubo (300 x g per 5 s) per raccogliere il pellet di DNA sul fondo.
  2. Aggiungere acqua doppia distillata (ddH2O) per ottenere una concentrazione finale di 10 ng/μL di modello di DNA.
  3. Vortice la soluzione su un'impostazione media per 5-10 s.
  4. Sciogliere l'intero pellet incubando a 50 °C per 20 min.
  5. Brevemente vortice di nuovo
  6. Centrifugare a 300 x g per 5 s per raccogliere la soluzione sul fondo del tubo.
  7. Conservare a -20 °C o utilizzare in PCR.
  8. Preparare un primer da 100 μM riutilizzando i primer in acqua priva di nucleasi. Per determinare la quantità di acqua da aggiungere, moltiplicare il numero di nanomoli di primer liofilizzato per 10. Ad esempio, se il tubo contiene 45 nM di primer liofilizzato, aggiungere 450 μL di ddH2O e vorticare la soluzione.
  9. Conservare le soluzioni di primer a -20 °C o continuare a eseguire l'amplificazione.

3. Amplificazione del frammento genico tramite PCR

NOTA: Decidere quale kit PCR è giusto per il gene di interesse. I geni più piccoli (<1.000 kb) possono essere più suscettibili a una Taq polimerasi più economica, mentre i geni più grandi (≥1.000 kb) possono beneficiare della polimerasi ad alta fedeltà per ridurre gli errori. È importante notare che questa amplificazione PCR iniziale non è necessaria se l'utente non si preoccupa di preservare il frammento genico iniziale (fornisce più tentativi di circolarizzazione e consente studi comparativi del prodotto LET vs. RCA). È anche importante notare che questa LET amplificata pcr può essere utilizzata direttamente nelle reazioni; tuttavia, come menzionato nell'introduzione, consentirebbe solo un numero limitato di reazioni se le ulteriori fasi di amplificazione fossero ignorate. La digestione e la legatura possono essere eseguite direttamente sul frammento di gene risospeso57 (se si è certi, non avranno bisogno di più LET per eseguire ulteriori stock di circolarizzazione). In questo caso, saltare il paragrafo 3 e continuare con il paragrafo 4. Per eseguire la PCR, attenersi alla seguente procedura.

  1. Utilizzare le scorte da 100 μM del passaggio 2.8 per creare soluzioni di lavoro da 10 μM. Molti protocolli di kit PCR richiedono soluzioni di primer da 10 μM.
  2. Programmare il termociclatore per condurre la reazione secondo i protocolli del produttore del kit. Kit diversi richiedono parametri ciclistici leggermente diversi. Per il kit elencato nella Tabella dei Materiali,le condizioni sono 94 °C per 30 s di denaturazione iniziale; 30 cicli di 94 °C per 30 s di denaturazione, 45 °C per 30 s di ricottura di primer e 68 °C per 60 s di estensione; con un'estensione finale a 68 °C per 5 min; e infine, una presa indefinita di 10 °C.
    1. Assicurarsi di selezionare il tempo di allungamento corretto (variabile a seconda della lunghezza del gene da amplificare). Avere un tempo di allungamento di 1 min per ogni 1.000 bp.
    2. Assicurarsi di inserire la temperatura di ricottura corretta per i primer. Utilizzare un calcolatore Tm online che utilizza entrambi i primer come input per determinare la migliore temperatura di ricottura58. Una temperatura di ricottura di 45 °C è sufficiente quando si utilizzano primer M13.
    3. Quando si determina il numero di cicli, fare riferimento al protocollo del produttore, ma 30 cicli si tradurranno più spesso in un'amplificazione sufficiente.
  3. Se si esegue la PCR, scongelare e vorticare i dNTP. Utilizzare il buffer PCR fornito nel kit.
  4. In un unico tubo PCR, combinare tutti i componenti del kit come indicato nel protocollo del produttore. Per garantire un'amplificazione di successo, aggiungere 1 μL di DNA risospeso (fase 2.6).
  5. Omogeneizzare delicatamente la miscela ruotando su presa media per 5-10 s. In alternativa, pipettare metà del volume su e giù 10-20 volte a vortice.
  6. Eseguire la reazione PCR.
  7. Se il protocollo PCR non includeva una fase di raffreddamento finale, lasciare raffreddare la reazione per 5 minuti a 10 °C prima di rimuovere per guidare la condensa sul fondo del tubo.
  8. Purificare la reazione utilizzando un kit di pulizia PCR seguendo le istruzioni del fornitore.
    1. In un tubo da 1,5 ml, aggiungere il tampone legante il DNA e il campione PCR con un rapporto di 5:1, rispettivamente.
    2. Trasferire questa miscela nella colonna di centrifuga e centrifugare a 16.000 x g per 1 minuto. Scartare il flusso attraverso.
    3. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio del DNA alla colonna e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
    4. Centrifugare per 1 minuto a 16.000 x g ed eliminare il flusso attraverso.
    5. Ripetere i passaggi 2.8.3 e 2.8.4 senza la fase di incubazione di 1 min.
    6. Centrifugare per ulteriori 1-2 minuti a 16.000 x g per rimuovere l'eventuale buffer rimanente.
    7. Eluire il DNA in 46 μL di ddH2O.
  9. Quantificare il DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro.
  10. Conservare il DNA purificato a -20 °C o procedere al passaggio successivo.

4. Digestione e circolarizzazione

NOTA: Un'ulteriore amplificazione può essere ottenuta circolarizzando il DNA seguito da RCA. Digerire il DNA per preparare il modello per la circolarizzazione. Questo rimuoverà le sequenze di primer e creerà estremità appiccicose sia alle estremità 5' che a quelle 3' del modello. Riattaccare queste estremità tramite reazione di legatura.

  1. In un tubo PCR, combinare 5 μL del tampone necessario, 20 U di HindIII e 45 μL del DNA purificato dal passo 3.8.
  2. Omogeneizzare delicatamente questa miscela con una pipetta.
  3. Incubare la miscela in un termociclatore per 15 minuti a 37 °C.
  4. Il calore inattiva HindIII incubando per 20 minuti a 80 °C.
  5. Lasciare raffreddare la reazione a 10 °C prima di rimuovere per guidare la condensa sul fondo del tubo.
  6. Aggiungere 5 μL di tampone T4 ligasi e 800 U di T4 ligasi al DNA appena digerito.
    1. Utilizzare T7 ligasi, se lo si desidera.
  7. Omogeneizzare delicatamente questa miscela con una pipetta.
  8. Incubare la miscela per 1 ora a 25 °C per eseguire la reazione di circolarizzazione.
  9. Purificare la reazione utilizzando un kit di pulizia PCR seguendo le istruzioni del fornitore. Utilizzare lo stesso protocollo descritto nel passaggio 3.8.
  10. Quantificare il DNA utilizzando uno spettrofotometro. I valori attesi sono ~20 ng/μL.
  11. Conservare a -20 °C o procedere al passaggio successivo.

5. Amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento

NOTA: L'amplificazione rolling circle (RCA) può essere eseguita utilizzando un kit commerciale o con componenti acquistati singolarmente. Seguire il protocollo del produttore garantirà un'amplificazione di successo. I kit contengono in genere un tampone campione, un tampone di reazione e una polimerasi che sposta il filamento, come la φ29 polimerasi. Tubi di reazione multipli possono essere combinati per produrre una grande quantità di DNA per l'espressione libera da cellule (4 μg da 20 pg di materiale di partenza). Il seguente protocollo funziona in modo efficiente.

  1. In un singolo tubo, combinare 20 μL del tampone campione, 20 μL del tampone di reazione, 0,8 μL dell'enzima e 1 μL del modello di espressione circolare (CET) dal passaggio 4.9.
    NOTA: Questo avrà una massa totale del DNA di ~ 20 ng, ma RCA può funzionare con quantità di picogramma, consentendo così la diluizione del CET e l'amplificazione enzimatica estrema se c'è una significativa necessità di materiale nello screening ad alta produttività.
  2. Omogeneizzare la miscela con una pipetta e aliquote 10 μL della miscela in quattro tubi separati.
  3. Incubare a 30 °C per 4-18 ore.
  4. Il calore inattiva l'enzima incubando a 65 °C per 10 min. Ridurre la temperatura a 12 °C per 5 minuti per favorire la condensa sul fondo del tubo.
    NOTA: è più facile combinare tutti i passaggi di temperatura in un protocollo automatizzato su un termociclatore.
  5. Diluire la soluzione risultante aggiungendo 15 μL di ddH2O a ciascun tubo.
  6. Combinare tutti i tubi e aggiungere direttamente a una reazione senza cellule.
  7. Se lo si desidera, utilizzare un kit di pulizia PCR per purificare il prodotto ed eluirlo in 36 μL di ddH2O per quantificare. Assicurarsi che la concentrazione del modello sia ~100 ng/μL.

6. Reazione senza cellule

NOTA: eseguire l'espressione senza celle combinando buffer di energia, estrazione e modello RCA. Una tipica reazione priva di cellule che utilizza il tampone energetico PANOx-SP è costituita da 1,2 mM di ATP, 0,85 mM ciascuno di GMP, UMP e CMP, 30 mM di fosfoenolpiruvato, 130 mM di glutammato di potassio, 10 mM di glutammato di ammonio, 12 mM di glutammato di magnesio, 1,5 mM di spermidina, 1 mM di putrescina, 34 μg/mL di acido folinico, 171 μg/mL di miscela di E. coli tRNA, 2 mM ciascuno di 20 aminoacidi non etichettati, 0,33 mM NAD, 0,27 mM Di Coenzima A (CoA), 4 mM ossalato di potassio, tampone HEPES-KOH da 57 mM (pH 7,5), volume dello 0,24% dell'estratto di E. coli e quantità variabili di DNA23,49. Il volume di reazione può variare, ma le reazioni da 15 μL possono risparmiare sull'uso del reagente e sono abbastanza piccole per l'uso in una micropiastra49,50a parete nera 384 .

  1. Se si esprime una proteina fluorescente come sfGFP, preparare un lettore di piastre per leggere all'eccitazione / emissione, alla temperatura e all'agitazione desiderate.
  2. Se si utilizza una piastra a 384 pozzetti, aliquota 60 μL di H2O nei pozzetti confinanti con un pozzo campione vuoto per mantenere l'umidità e ridurre l'effetto bordo.
  3. Aggiungere i vari componenti richiesti in un tubo per ogni campione. Aggiungi abbastanza per eseguire triplicati. Le repliche all'interno della piastra possono aiutare a identificare le cause della variabilità.
    1. Aggiungere l'estratto, il tampone energetico e poi il DNA.
    2. Diluire fino al volume finale desiderato con ddH2O.
  4. Mescolare accuratamente questa soluzione pipettando metà del volume della soluzione su e giù 10-20 volte.
  5. Trasferire la miscela di reazione in aliquote da 15 μL nei pozzetti desiderati nella piastra del microtitolazione.
  6. Sigillare la piastra con un film sigillante incolore per mantenere l'umidità e prevenire l'evaporazione.
  7. Posizionare la piastra sigillata nel lettore di piastre e consentire il completamento della reazione.
    1. Se si esprime una proteina che non ha la capacità di essere monitorata dal vivo, utilizzare un altro apparato a temperatura controllata come un termoblocco per incubare la piastra.

7. Saggio della subtilisina

NOTA: Se si esprime il gene della subtilisina BPN' (SBT(n)) nella sequenza supplementare #2,seguire questo protocollo per analizzare l'attività.

  1. Preparare una soluzione madre da 10 μM di N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide in dimetilformammide (DMF).
  2. Impostare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 410 nm ogni 20 s per 10 minuti mantenendo una temperatura di 25 °C.
  3. In una piastra a fondo piatto, incolore a 96 pozzetti, aliquota 94 μL di ddH2O e 1 μL di N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide dal punto 7.1.
  4. Aggiungere 5 μL della reazione finita senza cellule dal passaggio 6.7 e leggere utilizzando un lettore di piastre impostato sul protocollo descritto nel passaggio 7.2.

Risultati

L'espressione di sfGFP da modelli RCA era paragonabile a quella del plasmide pJL1 quando si utilizzavano solo 0,30 μL di DNA RCA non purificato in una reazione da 15 μL (Figura 2A). In effetti, raddoppiare e triplicare la quantità di modello sembra non offrire alcun beneficio nell'estratto di BL21 DE3 Star, suggerendo livelli già saturi del modello a 0,30 μL per reazione. Al contrario, sembra esserci un vantaggio nell'aumentare la quantità di modello RCA quando viene aggiunto all'estra...

Discussione

Il gene di interesse può essere qualsiasi proteina desiderata, ma è meglio iniziare con una proteina fluorescente come un comodo reporter per la lettura in tempo reale o del punto finale su un lettore di piatti di pozzo per i nuovi adottanti di questo metodo. Per nuove sequenze proteiche, copiare la sequenza di aminoacidi della proteina desiderata e incollarla nello strumento di ottimizzazione del codone desiderato61,62. Di solito ci sono molti organismi e cepp...

Divulgazioni

Nigel Reuel fa parte del comitato consultivo scientifico di BigHat Biosciences Inc., una società che utilizza sistemi senza cellule per la progettazione di anticorpi.

Riconoscimenti

Gli autori riconoscono NIH 1R35GM138265-01 e NSF 2029532 per il supporto parziale di questo progetto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

Riferimenti

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