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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.

Resumen

Este protocolo describe el diseño de una plantilla de ADN mínima y los pasos para la amplificación enzimática, lo que permite la creación rápida de prototipos de proteínas ensayables en menos de 24 h utilizando la expresión libre de células. Después de recibir ADN de un proveedor, el fragmento de gen es amplificado por PCR, cortado, circularizado y crio-almacenado. Una pequeña cantidad del ADN almacenado se diluye y amplifica significativamente (hasta 106x) utilizando la amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA). RCA puede producir cantidades de microgramos de la plantilla de expresión mínima a partir de niveles de picogramos de material de partida (niveles de mg si se utiliza todo el fragmento sintético inicial). En este trabajo, una cantidad inicial de 20 pg resultó en 4 μg del producto final. El producto RCA resultante (concatemer de la plantilla mínima) se puede agregar directamente a una reacción libre de células sin pasos de purificación. Debido a que este método está completamente basado en PCR, puede permitir futuros esfuerzos de detección de alto rendimiento cuando se combina con sistemas automatizados de manejo de líquidos.

Introducción

La expresión génica libre de células (CFE) ha surgido como una herramienta poderosa con muchas aplicaciones. Tales aplicaciones incluyen detección de enfermedades1,2,3,4,5,6, detección de micronutrientes y moléculas pequeñas7,8,9,10, 11,12, biofabricación13,14,15,16,17 ,18, educación19,20,21, fabricación de proteínasdifíciles 17,22,23,24,25,26,27, y detección devariantes 23,28,29,30,31,32 ,33. Esto se debe a la naturaleza abierta de los sistemas libres de células y la flexibilidad que confieren. Muchos grandes artículos de revisión ofrecen educación histórica y perspectivas futuras sobre la tecnología34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44.

Una reacción típica libre de células consta de tres componentes principales: extracto celular, mezcla de energía y plantilla genética. El extracto de célula activa contiene toda la maquinaria necesaria para la transcripción y traducción (TXTL) y se puede procesar de diversas maneras36. Los intermedios glicolíticos, electrolitos, aminoácidos y cofactores en la combinación de energía apoyan el proceso TXTL. Es una fuente importante de variabilidad en experimentos libres de células45 y se puede preparar de muchas maneras34,46. La preparación de la plantilla genética ha visto menos mejoras ya que los métodos tradicionales de clonación dan como resultado plásmidos con excelentes características de expresión. La desventaja de estos métodos tradicionales es el tiempo de respuesta y la cantidad de experiencia biológica necesaria para construirlos y propagarlos. Los esfuerzos de optimización recientes han dado como resultado flujos de trabajo simples de 24 horas para la preparación de extractoscelulares 47,48 que se pueden realizar en paralelo con la preparación de la mezcla energética49,50. Sin embargo, la clonación tradicional agrega varios días a la línea de tiempo de creación de prototipos de CFE (Tabla 1)23. Los productos de PCR rápidamente amplificados a partir del fragmento de gen comercial se pueden usar directamente51, pero esto limita el número de experimentos de prototipado ya que solo se produce 1 μg de ADN, lo que corresponde a aproximadamente cinco reacciones (volúmenes tradicionales de 15 μL). Con estos pasos adicionales de circularización y amplificación isotérmica, es posible cantidades superiores a miligramos del ADN (~ 5,000 reacciones por 1 mg). Esto aumenta drásticamente el número de pruebas que se pueden realizar en el cribado de alto rendimiento de proteínas o redes enzimáticas combinatorias (ingeniería metabólica libre de células); también permite la preservación efectiva de la biblioteca de plantillas lineales como ADN de alta concentración. Además, se necesitaría una mayor cantidad de plantilla para crear prototipos de grandes cantidades de proteínas necesarias para aplicaciones de ciencia de materiales (fibras e hidrogeles a base de proteínas). Algunas limitaciones de las plantillas lineales se pueden superar mediante el uso de un extracto de BL21 DE3 Star o el uso de métodos recientemente descubiertos para proteger las plantillas lineales de la degradación52,53,54. Sin embargo, esto no aborda el hecho de tener existencias limitadas de ADN producido por el proveedor para la amplificación por PCR o la cuestión de la experiencia biológica y el equipo necesario para la clonación.

Este trabajo presenta un protocolo diseñado explícitamente para aumentar la cantidad de plantilla de expresión que se puede obtener de pequeñas cantidades de fragmentos de genes producidos por el proveedor (típicamente 500-1000 ng de polvo liofilizado). El método descrito no requiere las habilidades necesarias para realizar la clonación tradicional en plásmidos o la transformación y propagación en células vivas. Al recibir un fragmento de gen por correo, un usuario puede producir suficientes plantillas para muchas reacciones libres de células mediante el empleo de amplificación isotérmica del círculo rodante (RCA) (Figura 1)23. Si bien la cantidad de ADN recibida del proveedor puede ser suficiente para los esfuerzos de detección limitados, se agota rápidamente y la recompra de fragmentos de genes lleva mucho tiempo y es costosa. El método también es especialmente adecuado para genes que son tóxicos y difíciles de clonar en E. coli.

Protocolo

1. Diseño del fragmento de gen

NOTA: El fragmento de gen debe tener todos los elementos genéticos necesarios para la transcripción / traducción, incluido el promotor, el sitio de unión al ribosoma (RBS), el codón de inicio, el gen de interés y el terminador. Si bien el terminador no es necesario para una plantilla de expresión lineal (LET), será importante si el usuario decide insertar la secuencia en un plásmido. Estas secuencias fueron extraídas del plásmido pJL1-sfGFP55 (regalo del laboratorio de Michael Jewett), que utiliza un promotor T7. Además de estos elementos genéticos necesarios, se agrega un sitio de corte de enzima de restricción de seis pares de bases antes del promotor (sitio de corte de 5 ') y otros seis pares de bases después del terminador (sitio de corte de 3 '), en este caso utilizando HindIII (se pueden usar otras enzimas de restricción, pero es útil estandarizar las secuencias con una enzima de restricción de alta fidelidad para reducir el número necesario para mantener en la biblioteca). Los sitios de imprimación se agregan diez pares de bases aguas arriba del sitio de corte de 5 'y diez pares de bases aguas abajo del sitio de corte de 3 ', en este caso utilizando secuencias de imprimación M13 estandarizadas (las imprimaciones son artículos de stock de bajo costo). El sitio de la enzima de restricción y los cebadores utilizados quedan a discreción del usuario. Sin embargo, el usuario debe asegurarse de que las secuencias no estén presentes en ningún otro lugar de la plantilla (no desea crear cortes no deseados o sitios de inicio de amplificación). Las secuencias para las plantillas utilizadas en este trabajo se detallan en el material complementario. Estos pasos se utilizan para modificar desde esta plantilla base.

  1. Determinar el gen deseado a expresar y obtener la secuencia de aminoácidos o la secuencia genética si se ha expresado en E. coli.
  2. Si se trata de una secuencia de aminoácidos, realice la optimización de codones para E. coli utilizando una de las muchas herramientas estándar del proveedor56. Si utiliza la plantilla proporcionada en el suplemento, asegúrese de que la secuencia optimizada no tenga sitios de restricción HindIII (AAGCTT). En el caso de que lo haga, continúe optimizando la secuencia hasta que ya no haya un sitio HindIII.
  3. Copie la secuencia y péguela en la plantilla proporcionada para la Secuencia suplementaria # 1 donde se indica el gen de interés. Si expresa sfGFP, use la Secuencia suplementaria # 1 tal como está. Si expresa subtilisina, use la Secuencia Suplementaria #2 tal cual.
  4. Solicite la plantilla mínima y los cebadores necesarios del servicio de síntesis de ADN preferido.

2. Resuspender el fragmento de gen y los cebadores

NOTA: Al recibir el fragmento de gen, siga los protocolos del fabricante para la resuspensión o use esta guía simple para crear un stock de ADN.

  1. Centrifuga el tubo (300 x g durante 5 s) para recoger el pellet de ADN en la parte inferior.
  2. Añadir agua destilada doble (ddH2O) para hacer una concentración final de 10 ng/μL de plantilla de ADN.
  3. Vórtice la solución en un ajuste medio durante 5-10 s.
  4. Disolver todo el pellet incubando a 50 °C durante 20 min.
  5. Brevemente vórtice de nuevo
  6. Centrifugar a 300 x g durante 5 s para recoger la solución en la parte inferior del tubo.
  7. Conservar a -20 °C o utilizar en PCR.
  8. Prepare un material de imprimación de 100 μM resuspiendo los cebadores en agua libre de nucleasas. Para determinar la cantidad de agua a agregar, multiplique el número de nanomoles de imprimación liofilizada por 10. Por ejemplo, si el tubo contiene 45 nM de imprimación liofilizada, agregue 450 μL de ddH2O y vórtice la solución.
  9. Almacene las soluciones de imprimación a -20 °C o continúe realizando la amplificación.

3. Amplificación del fragmento de gen a través de PCR

NOTA: Decida qué kit de PCR es el adecuado para el gen de interés. Los genes más pequeños (<1.000 kb) pueden ser más susceptibles a una polimerasa Taq más barata, mientras que los genes más grandes (≥1.000 kb) pueden beneficiarse de la polimerasa de alta fidelidad para reducir los errores. Es importante tener en cuenta que esta amplificación inicial de PCR no es necesaria si el usuario no está preocupado por preservar el fragmento de gen inicial (proporciona múltiples intentos de circularización y permite estudios comparativos del producto LET vs. RCA). También es importante tener en cuenta que este LET amplificado por PCR se puede utilizar directamente en reacciones; sin embargo, como se mencionó en la introducción, sólo permitiría un número limitado de reacciones si no se tuvieran en cuenta las nuevas medidas de amplificación. La digestión y la ligadura se pueden realizar en el fragmento de gen resuspendido directamente57 (si uno está seguro, no necesitarán más LET para realizar existencias de circularización adicionales). Si este es el caso, omita la sección 3 y continúe con la sección 4. Para realizar PCR, siga estos pasos.

  1. Utilice las existencias de 100 μM del paso 2.8 para crear soluciones de trabajo de 10 μM. Muchos protocolos de kits de PCR requieren soluciones de imprimaciones de 10 μM.
  2. Programe el termociclador para que conduzca la reacción de acuerdo con los protocolos del fabricante del kit. Los diferentes kits requieren parámetros de ciclismo ligeramente variados. Para el kit enumerado en la Tabla de Materiales,las condiciones son de 94 °C para 30 s de desnaturalización inicial; 30 ciclos de 94 °C para 30 s de desnaturalización, 45 °C para 30 s de recocido por imprimación y 68 °C para 60 s de extensión; con una extensión final a 68 °C durante 5 min; y, por último, una retención indefinida de 10 °C.
    1. Asegúrese de seleccionar el tiempo de elongación correcto (variable dependiendo de la longitud del gen a amplificar). Tener un tiempo de elongación de 1 min por cada 1.000 pb.
    2. Asegúrese de introducir la temperatura de recocido correcta para los cebadores. Utilice una calculadora Tm en línea que utiliza ambos cebadores como entradas para determinar la mejor temperatura de recocido58. Una temperatura de recocido de 45 °C es suficiente cuando se utilizan imprimaciones M13.
    3. Al determinar el número de ciclos, consulte el protocolo del fabricante, pero 30 ciclos con mayor frecuencia resultarán en una amplificación suficiente.
  3. Si se realizan PCR, descongelar y vórtice los dNTP. Utilice el búfer de PCR proporcionado en el kit.
  4. En un solo tubo de PCR, combine todos los componentes del kit según las indicaciones del protocolo del fabricante. Para garantizar una amplificación exitosa, agregue 1 μL de material de ADN resuspendido (paso 2.6).
  5. Homogeneice suavemente la mezcla mediante vórtice en ajuste medio durante 5-10 s. Alternativamente, pipetee la mitad del volumen hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces hasta el vórtice.
  6. Realizar la reacción pcrista.
  7. Si el protocolo de PCR no incluyó un paso de enfriamiento final, permita que la reacción se enfríe durante 5 minutos a 10 ° C antes de retirarla para conducir la condensación al fondo del tubo.
  8. Purifique la reacción utilizando un kit de limpieza de PCR siguiendo las instrucciones del proveedor.
    1. En un tubo de 1,5 ml, agregue el tampón de unión al ADN y la muestra de PCR en una proporción de 5: 1, respectivamente.
    2. Transfiera esta mezcla a la columna de centrifugado y centrífuga a 16.000 x g durante 1 min. Descarta el flujo.
    3. Agregue 200 μL de tampón de lavado de ADN a la columna e incube a temperatura ambiente durante 1 min.
    4. Centrifugar durante 1 min a 16.000 x g y desechar el flujo.
    5. Repita los pasos 2.8.3 y 2.8.4 sin la etapa de incubación de 1 minuto.
    6. Centrifugar durante 1-2 minutos adicionales a 16.000 x g para eliminar cualquier búfer restante.
    7. Elute el ADN en 46 μL de ddH2O.
  9. Cuantificar el ADN purificado utilizando un espectrofotómetro.
  10. Almacene el ADN purificado a -20 °C o continúe con el siguiente paso.

4. Digestión y circularización

NOTA: Se puede lograr una mayor amplificación mediante la circularización del ADN seguido de RCA. Digiere el ADN para preparar la plantilla para la circularización. Esto eliminará las secuencias de imprimación y creará extremos pegajosos en los extremos 5' y 3' de la plantilla. Vuelva a unir estos extremos a través de la reacción de ligadura.

  1. En un tubo de PCR, combine 5 μL del tampón necesario, 20 U de HindIII y 45 μL del ADN purificado del paso 3.8.
  2. Homogeneiza suavemente esta mezcla con una pipeta.
  3. Incubar la mezcla en un termociclador durante 15 min a 37 °C.
  4. Inactivar con calor HindIII incubando durante 20 min a 80 °C.
  5. Deje que la reacción se enfríe a 10 °C antes de retirarla para llevar la condensación a la parte inferior del tubo.
  6. Agregue 5 μL de tampón de ligasa T4 y 800 U de ligasa T4 al ADN recién digerido.
    1. Use la ligasa T7, si lo desea.
  7. Homogeneiza suavemente esta mezcla con una pipeta.
  8. Incubar la mezcla durante 1 h a 25 °C para realizar la reacción de circularización.
  9. Purifique la reacción utilizando un kit de limpieza de PCR siguiendo las instrucciones del proveedor. Utilice el mismo protocolo detallado en el paso 3.8.
  10. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro. Los valores esperados son ~20 ng/μL.
  11. Conservar a -20 °C o continuar con el siguiente paso.

5. Amplificación del círculo de rodadura isotérmica

NOTA: La amplificación de círculo rodante (RCA) se puede realizar utilizando un kit comercial o con componentes comprados individualmente. Seguir el protocolo del fabricante asegurará una amplificación exitosa. Los kits generalmente contienen un tampón de muestra, un tampón de reacción y una polimerasa que desplaza la hebra, como la polimerasa φ29. Se pueden combinar tubos de reacción múltiple para producir una gran cantidad de ADN para la expresión libre de células (4 μg de 20 pg de material de partida). El siguiente protocolo funciona de manera eficiente.

  1. En un solo tubo, combine 20 μL del tampón de muestra, 20 μL del tampón de reacción, 0,8 μL de la enzima y 1 μL de la plantilla de expresión circular (CET) del paso 4.9.
    NOTA: Esto tendrá una masa total de ADN de ~ 20 ng, pero RCA puede trabajar con cantidades de picogramos, lo que permite la dilución del CET y la amplificación enzimática extrema si hay una necesidad significativa de material en el cribado de alto rendimiento.
  2. Homogeneizar la mezcla con una pipeta y alícuota de 10 μL de la mezcla en cuatro tubos separados.
  3. Incubar a 30 °C durante 4-18 h.
  4. El calor inactiva la enzima incubando a 65 °C durante 10 min. Reduzca la temperatura a 12 °C durante 5 minutos para fomentar la condensación en la parte inferior del tubo.
    NOTA: Es más fácil combinar todos los pasos de temperatura en un protocolo automatizado en un termociclador.
  5. Diluya la solución resultante añadiendo 15 μL de ddH2O a cada tubo.
  6. Combine todos los tubos y agréguelos directamente a una reacción libre de células.
  7. Si lo desea, utilice un kit de limpieza por PCR para purificar el producto y eluirlo en 36 μL de ddH2O para cuantificar. Asegúrese de que la concentración de la plantilla sea ~100 ng/μL.

6. Reacción libre de células

Nota : realice la expresión libre de celdas mediante la combinación de búfer de energía, extracción y plantilla RCA. Una reacción típica libre de células utilizando el tampón de energía PANOx-SP consiste en 1.2 mM ATP, 0.85 mM cada uno de GMP, UMP y CMP, 30 mM fosfoenolpiruvato, 130 mM de glutamato de potasio, 10 mM de glutamato de amonio, 12 mM de glutamato de magnesio, 1.5 mM de espermidina, 1 mM de putrescina, 34 μg/mL de ácido folínico, 171 μg/mL de mezcla de ARNt de E. coli, 2 mM cada uno de 20 aminoácidos sin etiquetar, 0,33 mM NAD, 0,27 mM de coenzima A (CoA), 4 mM oxalato de potasio, 57 mM tampón HEPES-KOH (pH 7,5), 0,24% de volumen del extracto de E. coli, y cantidades variables de ADN23,49. El volumen de reacción puede variar, pero las reacciones de 15 μL pueden ahorrar en el uso de reactivos y son lo suficientemente pequeñas para su uso en una microplaca de paredes negras384 49,50.

  1. Si expresa una proteína fluorescente como sfGFP, prepare un lector de placas para leer a la excitación/emisión, temperatura y agitación deseadas.
  2. Si se utiliza una placa de 384 pocillos, alícuota 60 μL de H2O en los pozos que bordean un pozo de muestra vacío para mantener la humedad y reducir el efecto de borde.
  3. Agregue los diversos componentes necesarios en un tubo para cada muestra. Agregue lo suficiente para realizar triplicados. Las réplicas dentro de la placa pueden ayudar a identificar las causas de la variabilidad.
    1. Agregue el extracto, el amortiguador de energía y luego el ADN.
    2. Diluir hasta el volumen final deseado con ddH2O.
  4. Mezcle esta solución a fondo canalizando la mitad del volumen de la solución hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces.
  5. Transfiera la mezcla de reacción en alícuotas de 15 μL a los pocillos deseados en la placa de microtitulación.
  6. Selle la placa con una película de sellado incolora para mantener la humedad y evitar la evaporación.
  7. Coloque la placa sellada en el lector de placas y permita que se complete la reacción.
    1. Si expresa una proteína que no tiene la capacidad de ser monitoreada en vivo, use otro aparato de temperatura controlada, como un termobloqueo, para incubar la placa.

7. Ensayo de subtilisina

NOTA: Si expresa el gen bpN' de subtilisina (SBT(n)) en la Secuencia Suplementaria #2,siga este protocolo para evaluar la actividad.

  1. Preparar una solución madre de 10 μM de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilida en dimetilformamida (DMF).
  2. Ajuste un lector de placas para medir la absorbancia a 410 nm cada 20 s durante 10 minutos manteniendo una temperatura de 25 °C.
  3. En un fondo plano, placa incolora de 96 pocillos, alícuota 94 μL de ddH2O y 1 μL de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilida del paso 7.1.
  4. Agregue 5 μL de la reacción libre de células terminada del paso 6.7 y lea utilizando un lector de placas establecido en el protocolo descrito en el paso 7.2.

Resultados

La expresión de sfGFP a partir de plantillas RCA fue comparable a la del plásmido pJL1 cuando se utilizaron solo 0,30 μL de ADN RCA no purificado en una reacción de 15 μL(Figura 2A). De hecho, duplicar y triplicar la cantidad de plantilla parece no ofrecer ningún beneficio en el extracto bl21 DE3 Star, lo que sugiere niveles ya saturados de la plantilla a 0,30 μL por reacción. Por el contrario, parece haber un beneficio en el aumento de la cantidad de plantilla RCA cuando se agrega a...

Discusión

El gen de interés puede ser cualquier proteína deseada, pero es mejor comenzar con una proteína fluorescente como un reportero conveniente para la lectura en tiempo real o de punto final en un lector de placas de pozo para los nuevos adoptantes de este método. Para nuevas secuencias de proteínas, copie la secuencia de aminoácidos de la proteína deseada y péguela en la herramienta de optimización de codones deseada61,62. Por lo general, hay muchos organis...

Divulgaciones

Nigel Reuel es miembro del consejo asesor científico de BigHat Biosciences Inc., una compañía que utiliza sistemas libres de células para el diseño de anticuerpos.

Agradecimientos

Los autores reconocen a NIH 1R35GM138265-01 y NSF 2029532 por el apoyo parcial de este proyecto.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AlalineFormediumDOC0102
Ammonium glutamateMP BiomedicalsMP21805951
ArginineFormediumDOC0106
AsparagineFormediumDOC0114
Aspartic AcidFormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen Sealing FilmCorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
Coenzyme ASigmaC3144
CutSmart BufferNEBB7204SProvided with HindIII
CysteineFormediumDOC0122
DNA Clean and Concentrator KitZymo ResearchD4004Used for purifying DNA
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
Gene FragmentIDT
Glutamic AcidFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
HistidineFormediumDOC0142
IsoleucineFormediumDOC0150
LeucineFormediumDOC0154
LysineFormediumDOC0158
Magnesium glutamateSigma49605
MethionineFormediumDOC0166
Microtiter Plate (384 well)Greiner781906
Microtiter Plate (96 well)Greiner655809
Multimode Plate ReaderBioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480
PCR TubeVWR20170-012
PhenylalanineFormediumDOC0170
PhosphoenolpyruvateSigma (Roche)10108294
Potassium glutamateSigmaG1501
Potassium oxalateFisher ScientificP273
ProlineFormediumDOC0174
PutrescineSigmaP5780
SerineFormediumDOC0178
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseNEBM0202S
T4 DNA Ligase Reaction BufferNEBB0202SProvided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification KitCytiva25640010Used for RCA
Thermal CyclerBioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormediumDOC0186
TyrosineFormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
ValineFormediumDOC0194

Referencias

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