JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتطلب المجهر أحادي الجسيمات cryo-electron حزمة برامج مناسبة وخطوط أنابيب سهلة الاستخدام للحصول على البيانات التلقائية عالية الإنتاجية. هنا، نقدم تطبيق حزمة برامج اقتناء الصور المؤتمتة بالكامل، Latitude-S، وخط أنابيب عملي لجمع البيانات من الجزيئات الحيوية المهتزة في ظل ظروف جرعة منخفضة.

Abstract

في السنوات القليلة الماضية، مهدت التطورات التكنولوجية والمنهجية في المجهر أحادي الجسيمات للإلكترونات المبردة (cryo-EM) طريقا جديدا لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الكبيرة البيولوجية. على الرغم من التقدم الملحوظ في cryo-EM ، لا يزال هناك مجال للتحسين في جوانب مختلفة من سير عمل تحليل الجسيمات الواحدة. يتطلب تحليل الجسيمات المفردة حزمة برامج مناسبة للحصول التلقائي على البيانات عالية الإنتاجية. تم تطوير العديد من حزم برامج الحصول التلقائي على البيانات للتصوير التلقائي للجسيمات المفردة cryo-EM في السنوات الثماني الماضية. تقدم هذه الورقة تطبيقا لخط أنابيب مؤتمت بالكامل للحصول على صورة للجزيئات الحيوية المهتزة في ظروف الجرعة المنخفضة.

وهو يوضح حزمة من البرامج ، والتي يمكن جمع البيانات cryo - EM تماما ، تلقائيا ، وعلى وجه التحديد. بالإضافة إلى ذلك، يتم التحكم بسهولة المعلمات المجهرية المختلفة من قبل هذه الحزمة من البرامج. يوضح هذا البروتوكول إمكانات حزمة البرامج هذه في التصوير الآلي للبروتين عالي الارتفاع 2 (SARS-CoV-2) من متلازمة الالتهاب الرئوي الحاد الحاد (SARS-CoV-2) مع مجهر إلكتروني كريو 200 كيلو فولت مجهز بكاشف إلكترون مباشر (DED). تم الحصول على حوالي 3000 صورة فيلم cryo-EM في جلسة واحدة (48 ساعة) من جمع البيانات ، مما أسفر عن بنية تحليل ذري للبروتين المرتفع من السارس-CoV-2. وعلاوة على ذلك، تشير هذه الدراسة الهيكلية إلى أن البروتين ارتفاع يعتمد اثنين من الامتثالات الرئيسية، 1-RBD (مجال ملزم المستقبلات) مفتوحة وجميع RBD أسفل الامتثال مغلقة.

Introduction

أصبح cryo-EM أحادي الجسيمات تقنية بيولوجية هيكلية سائدة لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الجزيئية البيولوجية1. تعتمد إعادة بناء الجسيمات المفردة على الحصول على عدد كبير من الصور الدقيقة للعينات المهتزة لاستخراج صور الجسيمات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) ، والتي تستخدم بعد ذلك لإعادة بناء بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للجزيئات الجزيئية البيولوجية2،3. قبل تطوير DEDs، تراوحت الدقة التي تم تحقيقها من إعادة بناء جسيم واحد بين 4 و 30 Å4،5. في الآونة الأخيرة ، وصلت الدقة القابلة للتحقيق من cryo-EM أحادية الجسيمات إلى ما بعد 1.8 Å6. وكانت DED وبرامج الحصول الآلي على البيانات من المساهمين الرئيسيين في ثورة القرار هذه7 ، حيث التدخل البشري لجمع البيانات هو الحد الأدنى. عموما، يتم إجراء التصوير بالتبريد م بمعدلات جرعة الإلكترون منخفضة (20-100 e/Å2) لتقليل الأضرار الإشعاعية الناجمة عن شعاع الإلكترون من العينات البيولوجية، مما يساهم في انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) في الصورة. ويعوق هذا ال SNR المنخفض توصيف الهياكل عالية الاستبانة للجزيئات الجزيئية البيولوجية باستخدام تحليل جسيم واحد.

الجيل الجديد من أجهزة الكشف عن الإلكترونات هي أجهزة الكشف عن CMOS (التكميلية لأكسيد المعادن أشباه الموصلات) ، والتي يمكن التغلب على هذه العقبات المنخفضة المتعلقة SNR. تسمح كاميرات CMOS للكشف المباشر هذه بقراءة سريعة للإشارة ، والتي تساهم الكاميرا بسببها في وظيفة انتشار أفضل للنقاط ، وSNR مناسبة ، وكفاءة كمية ممتازة للمحققين (DQE) للجزيئات الكبيرة البيولوجية. توفر كاميرات الكشف المباشر SNR8 عالية وضوضاء منخفضة في الصور المسجلة ، مما يؤدي إلى زيادة كمية في كفاءة الكم المخبر (DQE) - وهو مقياس لمقدار الضوضاء التي يضيفها الكاشف إلى الصورة. هذه الكاميرات أيضا تسجيل الأفلام بسرعة مئات الإطارات في الثانية الواحدة، والتي تمكن من الحصول على البيانات بسرعة9،10. كل هذه الخصائص تجعل كاميرات الكشف المباشر السريع مناسبة لتطبيقات الجرعة المنخفضة.

تستخدم صور المكدس المصححة بالحركة لمعالجة البيانات لحساب التصنيف ثنائي الأبعاد وإعادة بناء خريطة كثافة ثلاثية الأبعاد للجزيئات الكبيرة باستخدام حزم برامج مختلفة مثل RELION11 وFREALIGN12 و cryoSPARC13 و cisTEM14 و EMAN215. ومع ذلك، بالنسبة لتحليل الجسيمات المفردة، هناك حاجة إلى مجموعة بيانات هائلة لتحقيق بنية عالية الدقة. ولذلك، فإن رسوم اكتساب البيانات التلقائية ضرورية للغاية لجمع البيانات. لتسجيل مجموعات بيانات cryo-EM كبيرة، تم استخدام العديد من حزم البرامج على مدى العقد الماضي. تم تطوير حزم برامج مخصصة، مثل AutoEM16 و AutoEMation17 و Leginon18 و SerialEM19 و UCSF-Image420 و TOM221 و SAM22 و JAMES23 و JADAS24 و EM-TOOLS و EPU، للحصول الآلي على البيانات.

تستخدم حزم البرامج هذه المهام الروتينية للعثور على مواقع الثقب تلقائيا من خلال ربط صور التكبير المنخفض بصور التكبير العالي ، مما يساعد في تحديد الثقوب ذات الجليد الزجاجي من سمك الجليد التكبيري للحصول على الصورة في ظل ظروف الجرعة المنخفضة. وقد خفضت هذه الحزم من البرامج عدد المهام المتكررة وزادت من الإنتاجية لجمع البيانات cryo-EM من خلال الحصول على كمية كبيرة من البيانات ذات نوعية جيدة لعدة أيام بشكل مستمر، دون أي انقطاع ووجود مادي للمشغل. Latitude-S هي حزمة برامج مماثلة، والتي تستخدم للحصول التلقائي على البيانات لتحليل الجسيمات المفردة. ومع ذلك ، فإن حزمة البرامج هذه مناسبة فقط لأجهزة الإزالة ال دي دي K2/K3 ويتم تزويدها بهذه الكاشفات.

يوضح هذا البروتوكول إمكانات Latitude-S في الحصول الآلي على صورة بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 مع كاشف إلكترون مباشر مجهز ب 200 كيلو فولت كريو-م (انظر جدول المواد). باستخدام هذه الأداة لجمع البيانات ، يتم الحصول تلقائيا على 3000 ملف فيلم من بروتين ارتفاع السارس-CoV-2 ، ويتم إجراء المزيد من معالجة البيانات للحصول على بنية بروتين ارتفاع 3.9-4.4 Å.

Protocol

ملاحظة: هناك حاجة إلى ثلاث خطوات مهمة لجمع البيانات cryo-EM: 1. إعداد شبكة cryo-EM، 2. معايرة ومحاذاة المجهر، 3. جمع البيانات التلقائي (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، يتم تقسيم جمع البيانات الآلي إلى أ. اختيار منطقة مناسبة، ب. التحسين من Latitude-S، ج. بدء اختيار ثقب التلقائي، و د. بدء الحصول التلقائي على البيانات (الشكل 1).

1. إعداد شبكة Cryo-EM وتحميل العينة للحصول التلقائي على البيانات

  1. تنظيف الشبكات باستخدام تفريغ توهج وتختلف المعلمات توهج التفريغ على أساس المتطلبات التجريبية (هنا، 60 ق في 20 م.
  2. أضف عينة بروتين طازجة (3 ميكرولتر) إلى الشبكة التي تم تفريغها بالتوهج واحتضنها لمدة 10 ق.
  3. لطخة الشبكات لمدة 3-5 ق في الرطوبة 100٪ ويغرق بسرعة لهم في الإيثان السائل باستخدام المكبس المبرد.
  4. قم بتثبيت الشبكات يدويا في حلقة مشبك لتشكيل الخرطوشة باستخدام حلقة C-clip مرنة.
  5. قم بتحميل الشبكات المجمدة المثبتة على الخرطوشة في كاسيت التحميل التلقائي ونقل الكاسيت بواسطة غطاء النانو إلى محمل تلقائي مسبق التبريد للمجهر لجمع البيانات.

2. ضبط المجهر والمحاذاة الأساسية قبل الحصول التلقائي على البيانات

  1. تحول شعاع
    1. انقر على Beam shift من علامة التبويب المحاذاة المباشرة .
    2. تقليل التكبير، ومركز شعاع إلى المحور البصري باستخدام متعدد الوظائف X و مقبض Y .
  2. محاذاة النقطة المحورية
    1. انقر على خيار إمالة الحزمة في المحاذاة المباشرة pp X من علامة التبويب المحاذاة المباشرة .
    2. تكثيف شعاع إلى بقعة وتقليل الحركة باستخدام مقبض X و Y متعدد الوظائف .
  3. توسيط فتحة C2
    1. حدد فتحة المكثف من علامة التبويب المحاذاة .
    2. تكثيف شعاع إلى بقعة، مركز شعاع إلى المحور البصري، ومن ثم توسيع شعاع لتغطية الدائرة بالتساوي.
    3. كرر هذه الخطوات حتى يتم ضبط فتحة المكثف 2.
  4. محاذاة خالية من الغيبوبة
    1. انقر على المحاذاة X الخالية من الغيبوبة من علامة التبويب المحاذاة المباشرة لمحاذاة الحزمة إلى المحور البصري.
    2. استخدام مقبض متعدد الوظائف لتقليل شكل وحركة FFT (تأكد من أنها مستقرة).
    3. كرر نفس الإجراء ل Coma - محاذاة حرة Y.
  5. تعيين الإضاءة الموازية قبل جمع البيانات في CRYO-EM بسبب عدسة التوأم C.
    1. أدخل الفتحة الهدف (70 ميكرومتر) في وضع الحيود.
    2. ركز الفتحة الموضوعية على المستوى البؤري الأمامي للعدسة الحيود من خلال التحكم في مقبض التركيز البؤري (العدسة الموضوعية وتيار عدسة C2).
    3. تأكد من أن ينظر إلى حافة هش من الفتحة الهدف بعد defocusing السليم.
    4. أدخل سدادة الشعاع ووزع الكثافة حتى يتم تقليل حلقات حيود مسحوق الذهب.
      ملاحظة: إذا كان الحزمة منتشرة بشكل صحيح، فإن حلقة حيود واضحة لمسحوق الذهب مرئية على الشاشة، مما يشير إلى أن الشعاع متوازي.
    5. تراجع سدادة شعاع بعد وضع الإضاءة الموازية وتغيير وضع المجهر إلى نانو التحقيق.
      ملاحظة: تحقق من ضبط المجهر قبل بدء جمع البيانات لضمان الأداء الأمثل للمجهر. وسيتم تنفيذ كل هذه الإعدادات في المجهر المباشر محاذاة GUI التبويب. يتم تنفيذ كل ضبط المجهر باستخدام شبكة اختبار قبل جمع البيانات.

3. الحصول على البيانات مع خط العرض-S

  1. بدء تشغيل برنامج الحصول الآلي على البيانات Latitude-S.
    ملاحظة: يتطلب تثبيت Latitude-S أيضا معايرة المجهر، والتي سيتم إجراؤها قبل جمع البيانات، وسيتم تخزين الإعدادات بشكل دائم. يتم معايرة خمس حالات مختلفة لجمع البيانات بأربعة تكبيرات مختلفة (الشكل 1 والشكل 2). حالة الأطلس وحالة الشبكة في اثنين من التكبيرات المختلفة في وضع LM (نطاقات التكبير المنخفض). حالة الثقب في وضع SA (نطاقات التكبير العالي) ولكن مع تكبير معتدل. التركيز وحالة البيانات استخدام وضع SA التكبير عالية.
    1. انقر على DigitalMicrograph من قائمة ابدأ ، أو انقر نقرا مزدوجا على رمز DigitalMicrograph على سطح المكتب.
    2. حدد رمز إدارة التقنية من ديجيتال ميتروغراف.
      ملاحظة: سيعرض هذا النظام رموز TEM و Latitude-S (الشكل 2 والشكل التكميلي S1).
    3. حدد رمز Latitude-S لجمع البيانات التلقائية من جسيم واحد.
      ملاحظة: تعمل كاميرا K2 في ثلاثة أوضاع: خطي/متكامل، محسوب، و فائق الدقة. يمكن للمستخدم تحديد أي وضع في واجهة DigitalMicrograph. يمكن حفظ صور البيانات إما ككدسات صور مجزأة بالجرعة أو كصور مجمعة في ملفات MRC أو TIF أو .dm4 ذات أعماق بت مختلفة. وعلاوة على ذلك، يمكن حفظ البيانات كصور مصححة للحركة للكاميرا K3. على كاميرا K2، يمكن حفظ مكدس صور غير معالج كملفات MRC 4 بت أو TIF 8 بت أو ملفات .dm4 8 بت.
  2. إنشاء جلسة عمل جديدة استنادا إلى الإعدادات من جلسة عمل سابقة.
    1. تحقق من خانة الاختيار استنادا إلى جلسة عمل سابقة في لوح الألوان.
    2. حدد الزر جديد .
    3. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي تستند إليها إعدادات جلسة العمل الجديدة. انتقل إلى دليل جلسة العمل السابقة لإنشاء جلسة عمل جديدة. اختر المجلد لحفظ جلسة العمل الجديدة والبيانات المقترنة بها.
    4. حدد المجلد الذي سيتم حفظ جلسة العمل الجديدة والبيانات المقترنة به واختره.
      ملاحظة: سيتم تصدير كل حالة وإعداداتها الأساسية (التكبير وظروف الإضاءة والصورة أو جهاز العرض) ومعلمات إزاحة الحزم والكاميرا (التعرض الكلي، والتعرض لإطار واحد، و binning) من الجلسة الحالية إلى الجلسة الجديدة. يظهر مسار المجلد كسلسلة نصية في أسفل لوح الألوان. تحتوي كل من لوحات الإعدادات والإعدادات على علامة نجمية (*) ملحقة بالعنوان لإظهار أنه تم إعداده بالفعل وأنه جاهز للاستخدام.
  3. متابعة جلسة عمل موجودة.
    1. اضغط الزر متابعة في لوح الألوان لمتابعة جلسة عمل موجودة.
      ملاحظة: لا يمكن تعديل المونتاج أطلس.
    2. اختر وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي تحتاج إلى مواصلة.
  4. بدء جلسة جديدة تماما.
    1. انقر على علامة تبويب جديدة في لوحة الألوان. اختر المجلد الذي يحتوي على جلسة العمل التي سيتم المواصلة. حدد مجلدا لحفظ البيانات.
      ملاحظة: يتم إنشاء اسم المجلد الافتراضي باستخدام التاريخ والوقت.
    2. انقر على أيقونة الإعداد . في المربع استكشاف حالة إدارة الذي يظهر، إضافة حالة، تعيين شرط TEM، شرط الكاميرا، والصورة / المكدس، ومن ثم تسمية الحالة.
      ملاحظة: يستخدم سير عمل اقتناء البيانات التلقائي 5 حالات مختلفة لجمع البيانات التلقائي. يتم تكوين هذه الحالات وتخزينها في لوحات الحالات الخاصة بها. 10- موجز الحالة مذكور في الجدول 1.
  5. تكوين حالة أطلس.
    1. انقر على لوحة حالة أطلس.
    2. تكوين حالة أطلس مع المعلمات التالية: التكبير 115x LM وضع في نانو التحقيق، وظروف الإضاءة بقعة حجم 8 والسطوع 934400، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية للتصوير في التكبير منخفضة. راجع ملخص الحالة الوارد في الجدول 1.
    3. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: حالة أطلس هي حالة التكبير الأدنى، التي توفر مسح الشبكة بأكملها (الشكل التكميلي S2). عموما، هذه الدولة يساعدنا على تصور الشبكات بأكملها في التكبير منخفضة والحكم على سمك الجليد، والتسطيح، ومربع مكسورة من الشبكات. ويوصى بتوليد الأطلس في مناطق مختلفة من الشبكة لمراقبة سمك الجليد الأمثل وسمك الجليد دون المستوى الأمثل للشبكات (الشكل التكميلي S3). يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  6. تكوين حالة الشبكة.
    1. انقر على لوحة حالة الشبكة.
    2. تكوين حالة الشبكة مع البصريات التصوير المجهر التالية (التكبير 380x LM الوضع في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 8 وسطوع 626،200)، binning: 1 ووقت التعرض للكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. انظر موجز حالة خط العرض-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يتم تعيين حالة الشبكة في تكبير أعلى من حالة أطلس بحيث يكون حقل العرض مربع شبكة واحدة (الشكل 2). في هذا التكبير خاصة، لوحظ مربع شبكة واحدة. لذلك ، لوحظت الثقوب بشكل صحيح في هذا التكبير ، مما يساعد على التحقق من سمك الجليد للثقوب (الشكل التكميلي S4). يتم استخدام فلتر ممر بسيط في حالة الشبكة لتحديد موقع الثقوب في شبكة براءات الاختراع. يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  7. تكوين حالة الثقب.
    1. انقر على لوحة حفرة.
    2. تكوين حالة الثقب مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (التكبير 4500x وضع SM في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 7 وقطر شعاع 8.81 ميكرومتر)، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. تغيير المعلمات إذا لزم الأمر استنادا إلى نوع الشبكة. انظر ملخص الحالة الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يشير وضع SA إلى نطاق تكبير عالي في المجهر الإلكتروني. تقع حالة الثقب في نطاق تكبير SA مع مجال رؤية لبضعة ميكرومترات (10-20 ميكرومتر) (الشكل 2 والشكل التكميلي S4). نطاق التكبير هذا أعلى من حالة أطلس أو الشبكة ولكنه أصغر بكثير من حالة التركيز/البيانات. في هذا التكبير، سوف تكون الثقوب الفردية مرئية. حجم الثقب مناسب لمراقبة درجات عالية من التلوث ، والثقوب الفارغة ، وسماكة الجليد المناسبة للثقوب. يتم اختيار ثقوب التصوير على أساس هذه الافتراضات. يتم استخدام اثنين من المرشحات في حالة ثقب: واحد لربط صورة مرجعية ثقب مع صورة ثقب جديد وآخر لضبط ارتفاع المرحلة إلى ارتفاع eucentric.
  8. تكوين حالة التركيز.
    1. انقر على لوحة التركيز.
    2. تكوين حالة التركيز مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (تكبير 45،000x وضع SA في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم بقعة: 8 والسطوع 934400)، binning: 1 ووقت التعرض الكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. التركيز على منطقة الكربون غير متبلور بالقرب من الحفرة. راجع ملخص حالة Latitude-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: يشير وضع SA إلى نطاق تكبير عالي في المجهر الإلكتروني. حالة التركيز هي تكبير نطاق SA الأعلى. في وضع التركيز البؤري، يتم نقل الشعاع إلى منطقة كربون قريبة من الثقب المستهدف ويؤدي التركيز تلقائيا لجمع البيانات في حالة البيانات. يتم استخدام فلتر ممر النطاقات مع مرشح مستطيل هانينغ أو ناعم في حالة التركيز لقياس الإزاحة بين صورتين من صور حالة التركيز لنفس المنطقة (الشكل 2). يمكن أن تختلف المعلمات المذكورة وفقا لاحتياجات المستخدم.
  9. تكوين حالة البيانات.
    1. انقر على لوحة البيانات.
    2. تكوين حالة البيانات مع إعدادات المجهر التالية: البصريات التصوير (على سبيل المثال، التكبير 28،000x، 45،000x، 54،000x في وضع SA في نانو التحقيق)، وظروف الإضاءة (حجم البقعة: 8 وسطوع 934400)، binning: 1 ووقت التعرض للكاميرا: 1.0 ثانية.
    3. راجع ملخص حالة Latitude-S الوارد في الجدول 1.
    4. انقر على التالي للانتقال إلى الحالة التالية.
      ملاحظة: حالة البيانات هي أعلى تكبير تم تحديده استنادا إلى متطلبات حجم البكسل ودقة الهدف (الشكل 2). عموما، بعد التركيز، يتم نقل الحزمة تلقائيا إلى المنطقة المستهدفة لجمع البيانات. يمكن تغيير المعلمات المذكورة أعلاه استنادا إلى متطلبات المستخدم.

4. تكوين التركيز

  1. انقر على لوحة التكوين التركيز. حدد نطاق قيم defocus وحجم الخطوة في علامة التبويب المحددة.
  2. اضغط على الزر التالي للانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن استخدام قيم defocus السفلية للحصول على بيانات عالية الدقة. بشكل عام، يتم استخدام -0.5 إلى -3.0 ميكرومتر قيم defocus مع أحجام خطوة defocus 0.25 أو 0.5 للحصول على الصورة. يمكن للمستخدمين تخطي خطوة إعداد التركيز إذا كانوا يريدون فقط فحص العينة. ما عليك سوى الضغط على الزر التالي على لوح الألوان لتخطي خطوة تكوين التركيز.

5. محاذاة غرامة

  1. التركيز على بعض الميزات على الشبكة (مثل الجليد سداسي التلوث الجليدي)؛ انظر الشكل 3.
    ملاحظة: يجب أن لا تكون الميزات كبيرة جدا أو صغيرة جدا. يجب أن تكون مرئية في كل من حالة أطلس تكبير 115x (وضع LA) وتكبير البيانات.
  2. انقر على زر الالتقاط . ضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة على كل صورة من حالات مختلفة.
  3. ابدأ بحالات التركيز والبيانات والثقوب لأن مجال الرؤية أكبر بكثير من حالات الأطلس والشبكة. تكبير حالات الأطلس والشبكة لوضع علامة الصليب الأحمر على نفس الميزة في حالات الأطلس والشبكة.
  4. انقر على زر حساب لحساب مواقف خمس حالات مختلفة، والتي سوف تحسب الإزاحات بين كل من الدول وتعكس هذه إلى إطار الإخراج.
    ملاحظة: يتم دمج قيم الإزاحة في الحالات لاستخدامها بشكل أكبر (الشكل 3). يتم تنفيذ محاذاة دقيقة لتوفير دقة عالية من موقف كل دولة (الشكل 3). تساعد هذه المحاذاة الدقيقة على تحديد الموضع الدقيق في جميع الولايات الخمس. محاذاة دقيقة أمر بالغ الأهمية للحصول على بيانات جسيم واحد. لذلك، يوصى بشدة بإجراء محاذاة دقيقة قبل التصوير.

6. إجراء الحصول على البيانات باستخدام Latitude-S

  1. انقر على لوحة التقاط.
    ملاحظة: بشكل عام، يتم تجميع بيانات أطلس عند التكبير المنخفض (115x) لتصور معظم مربعات الشبكة.
  2. اختر حجم الأطلس لتغطية الشبكة بأكملها أو جزء من الشبكة استنادا إلى المتطلبات (على سبيل المثال، 6 × 6، 8 × 8، 12 × 12، 6 × 8، 8 × 6، 12 × 8، أو 8 × 12).
    ملاحظة: يغطي حجم أطلس 16 في 16 الشبكة بأكملها.
  3. انقر على زر التقاط لالتقاط الأطلس.
    ملاحظة: تفتح نافذة التنقل Latitude-S الرئيسية وتملأ المساحة المتوفرة في DigitalMicrograph (الشكل التكميلي S5). تعرض ثلاثة أجزاء صور في إطار التنقل الرئيسي صورا لولايات النظام في ثلاثة تكبيرات مختلفة. يتم عرض الأطلس الكلي حاليا في حالته الحالية للاستحواذ في الجزء الموجود في أقصى اليسار. البلاط في الأطلس سوف تملأ كما يحدث كل التقاط.
  4. حدد مربع الشبكة استنادا إلى سمك الجليد عن طريق التنقل على الأطلس (الشكل التكميلي S5). بمجرد تحديد مربعات الشبكة المطلوبة ، انقر على زر الجدولة ولاحظ المربعات في مربع الشبكة تملأ كما يتم التقاط كل مربع الشبكة.
  5. انقر على الزر جدولة بمجرد تحديد مربعات الشبكة.
  6. حدد ثقب تمثيلي في مربع الشبكة بإضافة موضعه. بمجرد الحصول على صورة ثقب، حدد البيانات ومواضع التركيز وحفظ التخطيط كقالب (الشكل التكميلي S6).
  7. انقر على البحث التلقائي، وإعطاء حجم الثقب (على سبيل المثال، R1.2/1.3)، وانقر على زر البحث في البرنامج، مما سيؤدي إلى برنامج البحث عن العثور تلقائيا على الثقوب على أساس قطر الثقب. بعد ذلك، انقر على زر Mark لإضافة القالب (الشكل 4) وإضافة علامات دائرة حمراء في جميع الثقوب في شبكة واحدة أو مربع شبكة جزئي.
  8. إعداد كثافة لإزالة الثقوب من مربع الشبكة وتلوث الجليد (الشكل 4).
    ملاحظة: أخيرا، سيتم وضع علامة الثقوب المحددة باللون الأصفر لجدولة جمع البيانات.
  9. انقر على زر الجدولة في مهام Latitude بعد إضافة الثقوب من خلال البحث التلقائي.
    ملاحظة: قبل جدولة جمع البيانات التلقائي، تأكد من أن مستوى خزان النيتروجين السائل كاف، ومضخة توربو autoloader هو خارج، ومساحة محرك RAID مجانية. يعرض مدير مهام Latitude-S عدد حالات الأطلس ومربع الشبكة والثقب والبيانات المجدولة لجمع البيانات (الشكل 5). في Latitude-S GUI، ستكون أنظمة الألوان المختلفة مرئية، وسيتم عرض معنى أنظمة الألوان المختلفة: 1. يشير الأصفر إلى أنه غير مجدول؛ 1. 2. يشير الأخضر المقرر؛ 3. الأزرق يشير المكتسبة؛ 4. الأحمر يشير إلى فشل.

7. معالجة بيانات Cryo-EM

ملاحظة: يتم وصف معالجة الصور Cryo-EM من بروتين سبايك بالتفصيل في الأدب الحديث25.

  1. إجراء معالجة الصور من البروتين ارتفاع سارس-CoV2 باستخدام RELION 3.011.
  2. قم بفحص صور الأفلام التي تم جمعها باستخدام Latitude-S يدويا، واؤدي تصحيح الحركة الناجم عن الحزمة للأفلام الفردية باستخدام MotionCor2 software9. إجراء الفحص الأولي للصور المجهرية المصححة للحركة يدويا بمساعدة حزمة برامج cisTEM14.
    ملاحظة: كان ما يقرب من 85٪ من الصور الدقيقة المكتسبة تلقائيا ذات نوعية جيدة، وكانت البيانات إشارة في غضون 3.7-5.2 Å، والتي يتم حسابها باستخدام برنامج cisTEM14 (الشكل التكميلي S7A، B).
  3. معالجة البيانات باستخدام حزمة البرامج RELION 3.011.
    1. اختيار جزيئات ارتفاع يدويا وإخضاعها لتصنيف فئة 2D (الشكل التكميلي S7C). استخدم أفضل فئة 2D كمرجع إلى الجسيمات ذات الارتفاع الواحد 3,99,842 من الصور الدقيقة باستخدام أداة الاسترداد التلقائي RELION11.
      ملاحظة: أجريت ثلاث جولات من التصنيف ثنائي الأبعاد قبل إخضاع الجسيمات لتصنيف ثلاثي الأبعاد (الشكل التكميلي S8). وتم اختيار ما يقرب من 982 55 2 جسيما واحدا للتصنيف ثلاثي الأبعاد، وصنفت مجموعة البيانات في ست فئات. تم تنفيذ النهائي 3D لصناعة السيارات في الصقل مع أفضل فئة; تم الحصول على 85,227 جسيم ارتفاع من التصنيف ثلاثي الأبعاد.
    2. بعد التحسين التلقائي، قم بإجراء كل تحسين دقة لأوراق الجسيمات باستخدام معلمات إمالة الحزم المناسبة لتحسين الدقة. بعد ذلك ، أخضع الجسيمات لتلميع بايزي باستخدام حزمة برامج RELION 3.011. وأخيرا، استخدم مجموعة الجسيمات المصقولة لجولة أخرى من الصقل التلقائي ثلاثي الأبعاد باستخدام RELION 3.011.

النتائج

وفي ظل الوضع الحالي للجائحة، تلعب منظمة التبريد والطوارئ دورا رئيسيا في توصيف هياكل مختلف البروتينات من السارس-COV-226,27,28,29، والتي قد تساعد في تطوير اللقاحات والأدوية المضادة للفيروس. هناك حاجة ملحة لجهود بحثية سريعة الخ...

Discussion

Latitude-S هي واجهة مستخدم بديهية ، والتي توفر بيئة لإعداد وجمع الآلاف من الصور الدقيقة عالية الدقة أو ملفات الأفلام تلقائيا في يومين. ويوفر سهولة الملاحة عبر الشبكات ويحافظ على موقف مرحلة المجهر في حين أنه ينتقل من التكبير المنخفض إلى التكبير عالية. كل خطوة من خطوات الحصول على البيانات مع Latitud...

Disclosures

ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح المتنافسة أو المالية للإعلان عنه.

Acknowledgements

نعترف بإدارة التكنولوجيا الحيوية، وإدارة العلوم والتكنولوجيا (DST) والعلوم، ووزارة تنمية الموارد البشرية (MHRD)، الهند، للتمويل ومرفق التبريد والتبريد في IISc-Bangalore. نعترف ببرنامج DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) وDST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) لمنشأة Cryo-EM الوطنية في IISc، بنغالور. نعترف بالدعم المالي المقدم من مجلس البحوث العلمية والهندسية (SERB) (المنحة رقم SB/S2/RJN-145/2015، SERB-EMR/2016/000608 وSrb-IPA/2020/000094)، DBT (المنحة رقم BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). نشكر السيدة إيشيكا برامانيك على إعداد شبكات التبريد و EM وجمع بيانات cryo-EM وإعداد جدول المواد. كما نشكر السيد سومان ميشرا على معالجة الصور بالتبريد ومساعدتنا في إعداد الأرقام. نشكر البروفيسور راغافان فاراداراجان لمساعدتنا في الحصول على عينة بروتين سبايك النقية لهذه الدراسة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Blotting paperTed Pella, INC.47000-100EM specimen preparation item
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM specimen preparation unit
CassetteThermo Fisher Scientific1020863EM specimen preparation unit
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM specimen preparation item
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM specimen preparation tool
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube glow discharge machine
K2 DEDGatan Inc.N/ACryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Imaging software
Loading stationThermo Fisher Scientific1130698EM specimen preparation unit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/ACryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM specimen preparation unit

References

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 cryo EM Latitude S CoV 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved