JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Одночастичная криоэлектронная микроскопия требует подходящего программного пакета и удобного для пользователя конвейера для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. Здесь мы представляем применение полностью автоматизированного программного пакета для сбора изображений Latitude-S и практического конвейера для сбора данных остекленных биомолекул в условиях низких доз.

Аннотация

За последние несколько лет технологические и методологические достижения в области криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) проложили новый путь для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением. Несмотря на значительные достижения в области крио-ЭМ, все еще есть возможности для улучшения различных аспектов рабочего процесса анализа одной частицы. Для анализа одной частиц требуется подходящий программный пакет для автоматического сбора данных с высокой пропускной способностью. За последние восемь лет было разработано несколько пакетов программного обеспечения для автоматического сбора данных для автоматической визуализации крио-ЭМ с одной частицей. В данной статье представлено применение полностью автоматизированного конвейера сбора изображений для остеклованных биомолекул в условиях низких доз.

Он демонстрирует программный пакет, который может собирать крио-EM данные полностью, автоматически и точно. Кроме того, различные микроскопические параметры легко контролируются этим программным пакетом. Этот протокол демонстрирует потенциал этого программного пакета в автоматизированной визуализации спайкового белка тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) с помощью криоэлектронного микроскопа 200 кэВ, оснащенного прямым электронным детектором (DED). За один сеанс (48 ч) сбора данных было получено около 3000 крио-ЭМ-изображений фильмов, что дало структуру с атомным разрешением спайкового белка SARS-CoV-2. Кроме того, это структурное исследование показывает, что спайковый белок принимает две основные конформации: 1-RBD (рецептор-связывающий домен) вверх открытым и все RBD вниз закрытые конформации.

Введение

Крио-ЭМ с одной частицей стал основным методом структурной биологии для определения структуры биологических макромолекул с высоким разрешением1. Реконструкция одной частицы зависит от получения огромного количества микроснимков остеклованных образцов для извлечения двумерных (2D) изображений частиц, которые затем используются для реконструкции трехмерной (3D) структуры биологической макромолекулы2,3. До разработки DED разрешение, достигнутое при реконструкции одной частицы, варьировалось от 4 до 30 Å4,5. В последнее время достижимое разрешение от крио-ЭМ с одной частицей превысило 1,8 Å6. DED и автоматизированное программное обеспечение для сбора данных внесли основной вклад в эту революцию резолюции7, где вмешательство человека в сбор данных минимально. Как правило, крио-ЭМ-визуализация выполняется при низких мощностях дозы электронов (20-100 e/Å2) для минимизации электронно-лучевого радиационного повреждения биологических образцов, что способствует низкому соотношению сигнал/шум (SNR) на изображении. Этот низкий SNR препятствует характеристике структур с высоким разрешением биологических макромолекул с использованием анализа одиночных частиц.

Электронное детекторы нового поколения представляют собой кмОП-детекторы на основе КМОП (комплементарные металл-оксид-полупроводники), которые могут преодолевать эти препятствия, связанные с низким SNR. Эти КМОП-камеры с прямым обнаружением обеспечивают быстрое считывание сигнала, благодаря чему камера обеспечивает лучшую функцию точечного распространения, подходящую SNR и отличную детективную квантовую эффективность (DQE) для биологических макромолекул. Камеры прямого обнаружения обеспечивают высокий SNR8 и низкий уровень шума в записанных изображениях, что приводит к количественному увеличению квантовой эффективности детектива (DQE) - меры того, сколько шума детектор добавляет к изображению. Эти камеры также записывают фильмы со скоростью сотни кадров в секунду, что позволяет быстро собирать данные9,10. Все эти характеристики делают камеры быстрого прямого обнаружения пригодными для применения в низких дозах.

Стековые изображения с коррекцией движения используются для обработки данных для расчета 2D-классификации и реконструкции 3D-карты плотности макромолекул с помощью различных программных пакетов, таких как RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 и EMAN215. Однако для анализа одной частицы требуется огромный набор данных для достижения структуры с высоким разрешением. Поэтому плата за автоматический сбор данных имеет большое значение для сбора данных. Для записи больших наборов крио-ЭМ данных за последнее десятилетие было использовано несколько программных пакетов. Для автоматизированного сбора данных были разработаны специальные программные пакеты, такие как AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS и EPU.

Эти программные пакеты используют рутинные задачи для автоматического поиска положений отверстий путем корреляции изображений с низким увеличением с изображениями с высоким увеличением, что помогает идентифицировать отверстия со стекловидным льдом соответствующей толщины льда для получения изображений в условиях низкой дозы. Эти программные пакеты сократили количество повторяющихся задач и увеличили пропускную способность сбора крио-ЭМ данных за счет получения огромного количества высококачественных данных в течение нескольких дней непрерывно, без каких-либо перерывов и физического присутствия оператора. Latitude-S - это аналогичный программный пакет, который используется для автоматического сбора данных для анализа одиночных частиц. Однако этот программный пакет подходит только для DED K2/K3 и поставляется с этими детекторами.

Этот протокол демонстрирует потенциал Latitude-S в автоматизированном получении изображений спайкового белка SARS-CoV-2 с помощью прямого электронного детектора, оснащенного крио-ЭМ 200 кэВ (см. Таблицу материалов). С помощью этого инструмента сбора данных автоматически получают 3000 файлов фильмов спайкового белка SARS-CoV-2, и проводится дальнейшая обработка данных для получения структуры спайкового белка с разрешением 3,9-4,4 Å.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора крио-ЭМ данных необходимы три важных этапа: 1. подготовка крио-ЭМ сетки, 2. калибровка и выравнивание микроскопа, 3. автоматический сбор данных (рисунок 1). Кроме того, автоматизированный сбор данных подразделяется на a. выбор подходящей области, b. оптимизация Latitude-S, c. запуск автоматического выбора отверстий и d. запуск автоматического сбора данных (рисунок 1).

1. Подготовка крио-ЭМ сетки и загрузка образцов для автоматического сбора данных

  1. Очистите решетки с помощью тлеющего разряда и измените параметры тлеющего разряда на основе экспериментальных требований (здесь 60 с при 20 мА).
  2. Добавьте свежеприготовленный образец белка (3 мкл) в светящуюся сетку и инкубируйте в течение 10 с.
  3. Промокните сетки на 3-5 с при 100% влажности и быстро погрузите их в жидкий этан с помощью криомпенжера.
  4. Зажмите сетки вручную в кольцо зажима, чтобы сформировать картридж с помощью гибкого кольца C-clip.
  5. Загрузите замороженные решетки, установленные на картридже, в кассету автозарядчика и передайте кассету с помощью наноколпачка в предварительно охлажденный автозарядчик микроскопа для сбора данных.

2. Настройка микроскопа и базовое выравнивание перед автоматическим сбором данных

  1. Смещение луча
    1. Нажмите « Смещение луча » на вкладке «Прямое выравнивание ».
    2. Уменьшите увеличение и направьте луч на оптическую ось с помощью многофункциональной ручки X и Y .
  2. Выравнивание точек разворота
    1. Нажмите на опцию Наклон луча в прямом выравнивании pp X на вкладке Прямое выравнивание .
    2. Конденсируйте луч в точку и сведите к минимуму движение с помощью многофункциональной ручки X и Y .
  3. Центрирование диафрагмы C2
    1. Выберите диафрагму конденсатора на вкладке Выравнивание .
    2. Конденсируйте луч до точки, центрируйте луч на оптической оси, а затем расширьте луч, чтобы равномерно покрыть круг.
    3. Повторяйте эти шаги до тех пор, пока не будет отрегулирована диафрагма конденсатора 2.
  4. Выравнивание без комы
    1. Щелкните Выравнивание X без комы на вкладке Прямое выравнивание , чтобы выровнять луч по оптической оси.
    2. Используйте многофункциональную ручку, чтобы свести к минимуму форму и движение БПФ (убедитесь, что он стабилен).
    3. Повторите ту же процедуру для Coma - свободное выравнивание Y.
  5. Установите параллельное освещение перед сбором данных в крио-ЭМ из-за двойного объектива C.
    1. Вставьте объективную диафрагму (70 мкм) в дифракционном режиме.
    2. Сфокусируйте диафрагму объектива на передней фокальной плоскости дифракционного объектива, управляя регулятором интенсивности расфокусировки (объектив и ток объектива C2).
    3. Убедитесь, что четкий край объектива виден после правильной расфокусировки.
    4. Вставьте пробку балки и распределите интенсивность до тех пор, пока дифракционные кольца золотого порошка не будут сведены к минимуму.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если луч распределен правильно, на экране видно прозрачное дифракционное кольцо золотого порошка, что указывает на то, что луч параллельен.
    5. Уберите пробку луча после установки параллельного освещения и измените режим микроскопа на нанозонд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте настройку микроскопа перед началом сбора данных, чтобы обеспечить оптимальную производительность микроскопа. Все эти настройки будут выполняться в микроскопе Direct Alignment GUI Tab. Вся настройка микроскопа выполняется с использованием тестовой сетки перед сбором данных.

3. Сбор данных с помощью Latitude-S

  1. Запустите программное обеспечение для автоматического сбора данных Latitude-S.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка Latitude-S также требует калибровки микроскопа, которая будет выполнена перед сбором данных, и настройки будут сохранены постоянно. Пять различных состояний для сбора данных калибруются с четырьмя различными увеличениями (рисунок 1 и рисунок 2). Состояние атласа и состояние сетки находятся в двух разных увеличениях в режиме LM (диапазоны низкого увеличения). Состояние дыры находится в режиме SA (диапазоны высокого увеличения), но с умеренным увеличением. Фокусировка и состояние данных используют режим SA с высоким увеличением.
    1. Щелкните DigitalMicrograph в меню Пуск или дважды щелкните значок DigitalMicrograph на рабочем столе.
    2. Выберите значок Менеджера техники в DigitalMicrograph.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе будут отображаться значки TEM и Latitude-S (рисунок 2 и дополнительный рисунок S1).
    3. Щелкните значок Latitude-S для автоматического сбора данных по одной частице.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камера K2 работает в трех режимах: линейный/интегрированный, счетный и сверхвысокий. Пользователь мог выбрать любой режим в интерфейсе DigitalMicrograph. Изображения данных могут быть сохранены либо как стеки изображений с дозой фракционирования, либо как суммированные изображения в файлах MRC, TIF или .dm4 с различной битовой глубиной. Кроме того, данные могут быть сохранены в виде изображений с коррекцией движения для камеры K3. На камере K2 необработанный стек изображений может быть сохранен в виде 4-разрядных файлов MRC, 8-разрядных TIF или 8-разрядных файлов .dm4.
  2. Создайте новый сеанс на основе настроек предыдущего сеанса.
    1. Установите флажок На основе предыдущего сеанса в палитре.
    2. Нажмите кнопку Создать .
    3. Выберите папку, содержащую сеанс, на котором основаны настройки нового сеанса. Перейдите в каталог предыдущего сеанса, чтобы создать новый сеанс. Выберите папку для сохранения нового сеанса и связанных с ним данных.
    4. Выберите папку, в которую будет сохранен новый сеанс и связанные с ним данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое состояние и его базовые настройки (увеличение, условия освещения, изображение или проектор), а также смещение луча и параметры камеры (общая экспозиция, однокадровая экспозиция и биннинг) будут экспортированы из существующего сеанса в новый сеанс. Путь к папке отображается в виде текстовой строки в нижней части палитры. Каждая из палитр состояний и конфигурации имеет звездочку (*), добавленную к заголовку, чтобы показать, что она уже настроена и готова к использованию.
  3. Продолжите существующий сеанс.
    1. Нажмите кнопку Продолжить в палитре, чтобы продолжить существующий сеанс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монтаж атласа не может быть изменен.
    2. Выберите и перейдите к папке, содержащей сеанс, который необходимо продолжить.
  4. Начните совершенно новый сеанс.
    1. Нажмите на вкладку «Создать » в палитре. Выберите папку, содержащую сеанс для продолжения. Выберите папку для сохранения данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Имя папки по умолчанию строится с использованием даты и времени.
    2. Нажмите на значок Настройка . В появившемся окне Управление состоянием добавьте состояние, задайте условие TEM, условие камеры и изображение/стек, а затем присвойте этому состоянию имя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизированный рабочий процесс сбора данных использует 5 различных состояний для автоматического сбора данных. Эти состояния настраиваются и хранятся в соответствующих палитрах состояний. Сводка по состоянию приведена в таблице 1.
  5. Настройте состояние атласа.
    1. Нажмите на палитру состояния Атласа.
    2. Настройте состояние атласа со следующими параметрами: режим увеличения 115x LM в нанозонде, условия освещения - размер пятна 8 и яркость 934400, биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с для изображения при низком увеличении. Обратитесь к сводке по штатам, приведенной в таблице 1.
    3. Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние атласа является самым низким состоянием увеличения, которое обеспечивает обзор всей сетки (дополнительный рисунок S2). Как правило, это состояние помогает нам визуализировать все сетки при небольшом увеличении и судить о толщине льда, плоскостности и разбитом квадрате сеток. Рекомендуется формировать атлас на разных участках сетки для наблюдения за оптимальной толщиной льда и субоптимальной толщиной льда решеток (дополнительный рисунок S3). Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
  6. Настройте состояние сетки.
    1. Щелкните палитру состояния сетки.
    2. Настройте состояние Grid с помощью следующей оптики визуализации микроскопа (режим увеличения 380x LM в нанозонде), условий освещения (размер пятна: 8 и яркость 626 200), биннинга: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
    3. См. сводку состояния Latitude-S, приведенную в таблице 1.
    4. Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние сетки устанавливается с увеличением выше, чем состояние атласа, так что поле зрения представляет собой один квадрат сетки (рисунок 2). В этом конкретном увеличении наблюдается один квадрат сетки. Поэтому в этом увеличении правильно наблюдаются отверстия, что помогает проверить толщину отверстий на льду (дополнительный рисунок S4). Простой полосовой фильтр используется в состоянии сетки для поиска отверстий в патентной сетке. Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
  7. Настройте состояние отверстий.
    1. Нажмите на палитру отверстий.
    2. Настройте состояние отверстия со следующими параметрами микроскопа: оптика визуализации (режим увеличения 4500x SM в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 7 и диаметр луча 8,81 мкм), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
    3. При необходимости измените параметры в зависимости от типа сетки. См. сводку состояния, приведенную в таблице 1.
    4. Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Режим SA указывает на диапазон высокого увеличения в электронном микроскопе. Состояние дыры находится в диапазоне увеличения SA с полем зрения в несколько микрометров (10-20 мкм) (рисунок 2 и дополнительный рисунок S4). Этот диапазон увеличения выше, чем в состоянии Atlas или Grid, но намного меньше, чем в состоянии Focus/Data. В этом увеличении будут видны отдельные отверстия. Размер отверстия подходит для наблюдения за высокой степенью загрязнения, пустыми отверстиями и правильной толщиной льда отверстий. Отверстия для визуализации выбираются на основе этих предположений. В состоянии отверстия используются два фильтра: один для перекрестной корреляции эталонного изображения отверстия с новым изображением отверстия, а другой для регулировки высоты ступени до эйцентрической высоты.
  8. Настройте состояние фокусировки.
    1. Нажмите на палитру фокусировки.
    2. Настройте состояние фокусировки со следующими параметрами микроскопа: оптика визуализации (увеличение 45 000x РЕЖИМ SA в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 8 и яркость 934400), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
    3. Сосредоточьтесь на аморфной углеродной области вблизи отверстия. Обратитесь к сводке состояния Latitude-S, приведенной в таблице 1.
    4. Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Режим SA указывает на диапазон высокого увеличения в электронном микроскопе. Состояние фокусировки — это увеличение более высокого диапазона SA. В режиме фокусировки луч смещается в ближайшую углеродную область целевого отверстия и автоматически выполняет фокусировку для сбора данных в состоянии данных. Полосовой фильтр в сочетании с лазерным или мягким прямоугольным фильтром используется в состоянии фокусировки для измерения смещения между двумя изображениями состояния фокусировки одной и той же области (рисунок 2). Указанные параметры могут варьироваться в зависимости от потребностей пользователя.
  9. Настройте состояние данных.
    1. Нажмите на палитру данных.
    2. Настройте состояние данных с помощью следующих параметров микроскопа: оптика визуализации (например, увеличение 28 000x, 45 000x, 54 000x в режиме SA в нанозонде), условия освещения (размер пятна: 8 и яркость 934400), биннинг: 1 и время экспозиции камеры: 1,0 с.
    3. Обратитесь к сводке состояния Latitude-S, приведенной в таблице 1.
    4. Нажмите далее , чтобы перейти в следующее состояние.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Состояние данных - это наибольшее увеличение, выбранное на основе требований к размеру пикселя и целевому разрешению (рисунок 2). Как правило, после фокусировки луч автоматически смещается в целевую область для сбора данных. Вышеуказанные параметры могут быть изменены в зависимости от требований пользователя.

4. Настройка фокусировки

  1. Нажмите на палитру конфигурации фокусировки. Укажите диапазон значений расфокусировки и размер шага на данной вкладке.
  2. Нажмите кнопку Далее , чтобы перейти к следующему шагу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкие значения расфокусировки могут использоваться для сбора данных с высоким разрешением. Как правило, для получения изображения используются значения расфокусировки от -0,5 до -3,0 мкм с размерами шага расфокусировки 0,25 или 0,5 мкм. Пользователи могут пропустить этап настройки фокуса, если они хотят только отобразить образец. Просто нажмите кнопку Далее на палитре, чтобы пропустить шаг настройки фокуса.

5. Точное выравнивание

  1. Сосредоточьтесь на некоторых особенностях сетки (например, загрязнение льдом шестиугольным льдом); см. рисунок 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Функции не должны быть слишком большими или слишком маленькими. Они должны быть видны как при увеличении состояния Atlas 115x (режим LA), так и при увеличении данных.
  2. Нажмите на кнопку Захват . Расположите знак красного креста на одном и том же объекте на каждом изображении разных состояний.
  3. Начните с фокусировки, данных и состояний дыр, потому что их поле зрения намного больше, чем в атласе и сетке. Увеличьте масштаб состояния атласа и сетки, чтобы расположить знак красного креста на одном и том же объекте в атласе и состояниях сетки.
  4. Нажмите кнопку «Рассчитать », чтобы рассчитать позиции пяти различных состояний, которые будут вычислять смещения между каждым из состояний и отражать их в окне вывода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения смещения интегрированы в состояния для дальнейшего использования (рисунок 3). Тонкое выравнивание выполняется для обеспечения высокой точности положения каждого состояния (рисунок 3). Это точное выравнивание помогает точно определить точное положение во всех пяти состояниях. Точное выравнивание имеет решающее значение для сбора данных по одной частице. Поэтому настоятельно рекомендуется выполнить точное выравнивание перед визуализацией.

6. Процедура сбора данных с помощью Latitude-S

  1. Нажмите на палитру Захвата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, атласные данные собираются с небольшим увеличением (115x) для визуализации большинства квадратов сетки.
  2. Выберите размер атласа, чтобы охватить всю сетку или часть сетки в зависимости от требования (например, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 или 8 x 12).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер атласа 16 на 16 охватывает всю сетку.
  3. Нажмите на кнопку Захват , чтобы захватить атлас.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Главное окно навигации Latitude-S открывается и заполняет доступное пространство в DigitalMicrograph (дополнительный рисунок S5). Три панели изображений в главном окне навигации показывают изображения состояний системы при трех различных увеличениях. Общий атлас в настоящее время отображается в текущем состоянии приобретения на крайней левой панели. Плитки в атласе будут заполняться по мере каждого захвата.
  4. Выберите квадрат сетки в зависимости от толщины льда, перейдя по атласу (дополнительный рисунок S5). После того, как нужные квадраты сетки выбраны, нажмите кнопку «Расписание» и наблюдайте, как плитки в квадрате сетки заполняются по мере захвата каждого квадрата сетки.
  5. Нажмите кнопку «Расписание», как только будут выбраны квадраты сетки.
  6. Выберите репрезентативное отверстие в квадрате сетки, добавив его положение. После получения изображения отверстия определите данные и позиции фокусировки и сохраните макет в виде шаблона (дополнительный рисунок S6).
  7. Нажмите « Автоматический поиск», укажите размер отверстия (например, R1.2/1.3) и нажмите кнопку «Найти» в программе, что приведет к тому, что программа «Найти» автоматически найдет отверстия на основе диаметра отверстия. Затем нажмите на кнопку Mark , чтобы добавить шаблон (рисунок 4) и добавить знаки красного круга во всех отверстиях в одной сетке или частичном квадрате сетки.
  8. Установите интенсивность для удаления отверстий из квадрата сетки и загрязнения льдом (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконец, выбранные отверстия будут отмечены желтым цветом для планирования сбора данных.
  9. Нажмите кнопку «Расписание» в задачах Latitude после добавления отверстий через автоматический поиск.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем планировать автоматический сбор данных, убедитесь, что уровень жидкого азота в баке достаточен, турбонасос автозагрузчика выключен, а дисковое пространство RAID свободно. Диспетчер задач Latitude-S показывает количество состояний атласа, квадрата сетки, отверстий и данных, запланированных для сбора данных (рисунок 5). В графическом интерфейсе Latitude-S будут видны различные цветовые схемы, а также будет отображаться значение различных цветовых схем: 1. Желтый цвет указывает на незапланированное; 2. Зеленым цветом обозначено расписание; 3. Синим цветом обозначено Приобретенное; 4. Красным цветом обозначен сбой.

7. Обработка данных Cryo-EM

ПРИМЕЧАНИЕ: Крио-ЭМ обработка изображений спайкового белка подробно описана в новейшей литературе25.

  1. Выполнить обработку изображений спайкового белка SARS-CoV2 с помощью RELION 3.011.
  2. Вручную просматривайте изображения фильмов, собранные с помощью Latitude-S, и выполняйте коррекцию движения отдельных фильмов, вызванную лучом, с помощью программного обеспечения MotionCor29. Выполните первичный скрининг микрофотографий с коррекцией движения вручную с помощью программного пакета cisTEM14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Почти 85% автоматически полученных микроснимков были хорошего качества, а данные имели сигнал в пределах 3,7-5,2 Å, который рассчитывается с помощью программного обеспечения cisTEM14 (дополнительный рисунок S7A, B).
  3. Обработка данных с помощью программного пакета RELION 3.011.
    1. Подбирайте частицы шипов вручную и подвергайте их классификации 2D-классов (дополнительный рисунок S7C). Используйте лучший 2D-класс в качестве ссылки на автоотбор 3 99 842 односкоростных частиц с микроснимков с помощью инструмента автоподбора RELION11.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три раунда 2D-классификации были проведены перед тем, как подвергнуть частицы 3D-классификации (дополнительный рисунок S8). Приблизительно 2 55 982 одиночные частицы были отобраны для 3D-классификации, и набор данных был классифицирован на шесть классов. Финальная 3D автофинировка была выполнена с лучшим классом; 85 227 частиц шипов были получены из 3D-классификации.
    2. После автоматической очистки выполните очистку расфокусировки на частицу с правильными параметрами наклона луча для улучшения разрешения. Затем подвергаем частицы байесовской полировке с помощью программного пакета RELION 3.011. Наконец, используйте набор отполированных частиц для еще одного раунда 3D-автоочистки с помощью RELION 3.011.

Результаты

В нынешней пандемической ситуации крио-ЭМ играет ключевую роль в характеристике структур различных белков из SARS-CoV-226,27,28,29, которые могут помочь в разработке вакцин и лекарств против вируса. Существует острая необход...

Обсуждение

Latitude-S — это интуитивно понятный пользовательский интерфейс, который обеспечивает среду для автоматической настройки и сбора тысяч микроснимков высокого разрешения или файлов фильмов за два дня. Он обеспечивает легкую навигацию по сеткам и поддерживает положение ступени микроскопа, ...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих или финансовых конфликтов интересов, о которых можно было бы заявить.

Благодарности

Мы выражаем признательность Департаменту биотехнологии, Департаменту науки и техники (DST) и науки, а также Министерству развития людских ресурсов (MHRD), Индия, за финансирование и крио-ЭМ-объект в IISc-Бангалоре. Мы принимаем участие в программе DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) и DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) для Национального крио-ЭМ-объекта в IISc, Бангалор. Мы выражаем финансовую поддержку со стороны Совета по научным и инженерным исследованиям (SERB) (грант No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 и SERB-IPA/2020/000094), DBT (Грант No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Мы благодарим г-жу Исику Праманик за подготовку крио-ЭМ-сетей, сбор крио-ЭМ данных и подготовку Таблицы материалов. Мы также благодарим г-на Сумана Мишру за крио-ЭМ обработку изображений и за помощь в подготовке рисунков. Мы благодарим профессора Рагхавана Варадараджана за помощь в получении очищенного образца спайкового белка для этого исследования.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Blotting paperTed Pella, INC.47000-100EM specimen preparation item
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM specimen preparation unit
CassetteThermo Fisher Scientific1020863EM specimen preparation unit
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM specimen preparation item
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM specimen preparation tool
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube glow discharge machine
K2 DEDGatan Inc.N/ACryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Imaging software
Loading stationThermo Fisher Scientific1130698EM specimen preparation unit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/ACryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM specimen preparation unit

Ссылки

  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383 (2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

173SSARS CoV 2Talos Arctica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены