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摘要

单颗粒冷冻电子显微镜需要合适的软件包和用户友好的管道来实现高通量自动数据采集。在这里，我们介绍了全自动图像采集软件包Latitude-S的应用，以及用于在低剂量条件下收集玻化生物分子数据的实用管道。

摘要

近年来，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）的技术和方法学进步为生物大分子的高分辨率结构测定铺平了新的途径。尽管冷冻电镜取得了显著进展，但在单颗粒分析工作流程的各个方面仍有改进的余地。单颗粒分析需要合适的软件包来实现高通量自动数据采集。在过去八年中，开发了几个自动数据采集软件包，用于单颗粒冷冻电镜的自动成像。本文提出了一种全自动图像采集管线在低剂量条件下用于玻化生物分子的应用。

它演示了一个软件包，可以完全、自动、精确地收集冷冻电镜数据。此外，该软件包可以轻松控制各种微观参数。该协议证明了该软件包在配备直接电子探测器（DED）的200 keV冷冻电子显微镜对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白进行自动成像方面的潜力。在单次（48小时）的数据收集中采集了大约3，000张冷冻电镜电影图像，产生了SARS-CoV-2刺突蛋白的原子分辨率结构。此外，该结构研究表明，刺突蛋白采用两种主要构象，1-RBD（受体结合结构域）向上开放，所有RBD向下闭合构象。

引言

单颗粒冷冻电镜已成为生物大分子高分辨率结构测定的主流结构生物学技术1。单颗粒重建依赖于获取大量玻化样品的显微照片来提取二维（2D）颗粒图像，然后用于重建生物大分子的三维（3D）结构2，3。在DED开发之前，单粒子重建获得的分辨率在4到30 Å4，5之间。最近，单颗粒冷冻电镜可实现的分辨率已超过1.8 Å6。DED和自动数据采集软件是这一分辨率革命7的主要贡献者，其中人为数据收集干预最少。通常，冷冻电镜成像以低电子剂量率（20-100 e / Å2）进行，以最大限度地减少电子束引起的生物样品辐射损伤，这有助于图像中的低信噪比（SNR）。这种低SNR阻碍了使用单颗粒分析表征生物大分子的高分辨率结构。

新一代电子探测器是基于CMOS（互补金属氧化物半导体）的探测器，可以克服这些与SNR相关的低障碍。这些直接检测CMOS相机可以快速读出信号，因此相机为生物大分子提供了更好的点扩散功能，合适的SNR和出色的检测量子效率（DQE）。直接检测相机在记录的图像中提供高SNR8 和低噪声，从而定量提高检测量子效率（DQE） - 测量探测器向图像增加的噪声量。这些相机还以每秒数百帧的速度录制短片，从而实现快速数据采集9，10。所有这些特性使得快速直接检测相机适用于低剂量应用。

运动校正堆栈图像用于数据处理，以计算2D分类，并使用各种软件包（如RELINE11，FREALIGN12，cryoSPARC13，cisTEM14和EMAN215）重建大分子的3D密度图。然而，对于单粒子分析，需要一个巨大的数据集来实现高分辨率结构。因此，自动数据采集收费对于数据收集至关重要。为了记录大型冷冻电镜数据集，在过去十年中已经使用了几个软件包。专用软件包，如AutoEM16，AutoEMation17，Leginon18，SerialEM19，UCSF-Image420，TOM221，SAM22，JAMES23，JADAS24，EM-TOOLS和EPU，已经开发用于自动数据采集。

这些软件包使用常规任务，通过将低倍率图像与高倍率图像相关联来自动查找孔位置，这有助于识别具有专有冰厚的玻璃体冰的孔，以便在低剂量条件下进行图像采集。这些软件包通过连续几天获取大量高质量数据，减少了重复性任务的数量，并提高了冷冻电镜数据收集的吞吐量，没有任何中断和操作员的物理存在。Latitude-S是一个类似的软件包，用于单颗粒分析的自动数据采集。但是，该软件包仅适用于K2 / K3 DED，并随这些探测器一起提供。

该协议证明了Latitude-S在使用配备200 keV冷冻电镜的直接电子探测器自动图像采集SARS-CoV-2刺突蛋白方面的潜力（见 材料表）。利用该数据采集工具，自动采集3000个SARS-CoV-2刺突蛋白电影文件，并进行进一步的数据处理，得到分辨率为3.9-4.4Å的刺突蛋白结构。

研究方案

注:冷冻电镜数据收集需要三个重要步骤:1.冷冻电镜网格制备，2.显微镜的校准和对准，3.自动数据收集（图1）。此外，自动数据收集细分为a.合适区域选择，b.Latitude-S优化，c.启动自动孔选择和d.启动自动数据采集（图1）。

1. 用于自动数据采集的冷冻电镜网格制备和样品加载

  1. 使用辉光放电器清洁网格，并根据实验要求改变辉光放电参数（此处，20 mA时为60 s）。
  2. 将新鲜制备的蛋白质样品（3μL）加入辉光放电网格中并孵育10 s。
  3. 在100%湿度下将网格吸干3-5秒，并使用冷冻柱塞将其快速浸入液体乙烷中。
  4. 使用灵活的C形夹环手动将网格夹入夹环中以形成墨盒。
  5. 将冷冻的墨盒安装网格加载到自动加载器盒中，并通过纳米盖将盒传输到显微镜的预冷自动加载器以进行数据收集。

2. 自动数据采集前的显微镜调谐和基本对准

  1. 光束偏移
    1. 单击"直接对齐"选项卡中的"光束偏移"。
    2. 减小放大倍率，并使用 多功能 X 和 Y 旋钮将光束居中到光轴。
  2. 枢轴点对齐
    1. 单击"直接对齐"选项卡中的"直接对齐 pp X"中的"光束倾斜"选项。
    2. 通过使用 多功能 X 和 Y 旋钮将光束压缩到一个点并最小化运动。
  3. C2 孔径定心
    1. 从" 对齐 "选项卡中选择聚光镜孔径。
    2. 将光束凝聚到一个点上，将光束居中到光轴上，然后扩大光束以均匀地覆盖圆圈。
    3. 重复这些步骤，直到调整了聚光镜2光圈。
  4. 无昏迷对齐
    1. 单击"直接对齐"选项卡中的"无昏迷对齐 X"，将光束与光轴对齐。
    2. 使用 多功能 旋钮将FFT的形状和运动最小化（确保其稳定）。
    3. 对昏迷重复相同的过程 - 自由对齐Y。
  5. 由于C双透镜，在冷冻电镜中收集数据之前设置平行照明。
    1. 在衍射模式下插入物镜孔径（70 μm）。
    2. 通过控制散焦强度旋钮（物镜和C2透镜电流），将物镜孔径聚焦在衍射镜的前焦平面上。
    3. 确保在正确散焦后可以看到物镜光圈的清晰边缘。
    4. 插入光束塞并扩散强度，直到金粉衍射环最小化。
      注:如果光束正确展开，则屏幕上可以看到金粉的透明衍射环，这表明光束是平行的。
    5. 设置平行照明后，收回光束塞，并将显微镜模式更改为 纳米探头。
      注:在开始数据收集之前，请检查显微镜调谐，以确保显微镜的最佳性能。所有这些设置都将在显微镜 直接对准GUI 选项卡中执行。在数据收集之前，所有显微镜调整都使用测试网格执行。

3. 使用Latitude-S进行数据采集

  1. 启动Latitude-S自动数据采集软件。
    注意:Latitude-S 安装还需要显微镜校准，这将在数据收集之前执行，并且设置将被永久存储。使用四种不同的放大倍率校准五种不同的数据收集状态（图1 和 图2）。在 LM 模式下，Atlas 状态和格网状态处于两种不同的放大倍率（低放大倍率范围）。孔状态为 SA 模式（高放大倍率范围），但放大倍率适中。焦点和数据状态使用高放大倍率SA模式。
    1. 从"开始"菜单中单击"数字显微图"，或双击桌面上的"数字显微图"图标。
    2. 从数字显微图中选择技术管理器图标。
      注:此系统将显示 TEM 和 Latitude-S 图标（图2 和 补充图S1）。
    3. 选择 Latitude-S 图标以进行单粒子自动数据收集。
      注:K2相机在三种模式下工作:线性/积分、计数和超分辨率。用户可以在 DigitalMicrograph的界面中选择任何模式。数据图像可以保存为剂量分段图像堆栈，也可以保存为具有不同位深度的MRC，TIF或.dm4文件中的求和图像。此外，数据可以保存为K3相机的运动校正图像。在K2相机上，未处理的图像堆栈可以保存为4位MRC，8位TIF或8位.dm4文件。
  2. 根据上一个会话中的设置创建新会话。
    1. 选中调色板中的 基于先前的会话 复选框。
    2. 选择" 新建 "按钮。
    3. 选择包含新会话设置所基于的会话的文件夹。转到上一个会话目录以创建新会话。选择要保存新会话和关联数据的文件夹。
    4. 选择并选择将保存新会话和关联数据的文件夹。
      注:每个状态及其基础设置（放大倍率、照明条件、图像或投影仪）以及光束偏移和相机参数（总曝光、单帧曝光和合并）将从现有会话导出到新会话。文件夹的路径在选项板底部显示为文本字符串。每个状态和配置调色板的标题后面都附加了一个星号 （*），以表明它已设置并可供使用。
  3. 继续现有会话。
    1. 按调色板中的" 继续 "按钮以继续现有会话。
      注:地图集蒙太奇无法修改。
    2. 选择并导航到包含需要继续的会话的文件夹。
  4. 启动一个全新的会话。
    1. 单击调色板中的 "新建"选项卡 。选择要继续的会话的文件夹。选择要保存数据的文件夹。
      注意:默认文件夹名称是使用日期和时间生成的。
    2. 单击 设置 图标。在出现的 "管理状态浏览 "框中，添加状态，设置 TEM 条件、相机条件和图像/堆栈，然后命名状态。
      注意:自动数据采集工作流使用 5 种不同的状态进行自动数据收集。这些状态被配置并存储在各自的状态调色板中。 表 1 给出了状态摘要。
  5. 配置地图集状态。
    1. 单击 "图集"状态调色板。
    2. 使用以下参数配置图集状态:在纳米探头中放大倍率为115x LM模式，照明条件 - 光斑尺寸8和亮度934400，分档:1和相机曝光时间:1.0秒，用于低放大倍率下的成像。请参阅 表 1 中给出的状态摘要。
    3. 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
      注:图集状态是最低放大倍率状态，它提供了整个网格的测量（补充图S2）。通常，这种状态有助于我们在低放大倍率下可视化整个网格，并判断网格的冰厚度，平面度和破碎的平方。建议在格网的不同区域生成图集，以观察格网的最佳冰厚和次优冰厚（附图S3）。上述参数可以根据用户需求而变化。
  6. 配置网格状态。
    1. 单击" 网格状态"选项板。
    2. 使用以下显微镜成像光学元件（Nano探头中的放大倍率为380x LM模式）、照度条件（光斑尺寸:8，亮度626，200）、分档:1和相机曝光时间:1.0秒）配置网格状态。
    3. 请参阅 表 1 中提供的 Latitude-S 状态摘要。
    4. 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
      注:网格状态设置为高于图集状态的放大倍率，使得视野为一个网格正方形（图 2）。在这个特定的放大倍率中，观察到一个网格正方形。因此，在此放大倍率下可以正确观察孔，这有助于检查孔的冰厚度（补充图S4）。在网格状态下使用简单的带通滤波器来定位专利网格中的孔。上述参数可以根据用户需求而变化。
  7. 配置孔状态。
    1. 单击 孔调色板。
    2. 使用以下显微镜设置配置孔状态:成像光学元件（Nano探头中的放大倍率为4500x SM模式），照明条件（光斑尺寸:7和光束直径8.81μm），像素:1和相机曝光时间:1.0秒。
    3. 如果需要，请根据网格类型更改参数。请参阅 表 1 中提供的状态摘要。
    4. 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
      注:SA模式表示电子显微镜中的高放大倍率范围。孔状态在SA放大倍率范围内，视场为几微米（10-20μm）（图2 和 补充图S4）。此放大范围高于"图集"或"网格"状态，但远小于"焦点/数据"状态。在此放大倍率下，可以看到单个孔。孔的大小适合观察高度污染，空孔和孔的适当冰厚度。根据这些假设选择成像孔。在孔状态下使用两个滤光片:一个用于将孔参考图像与新孔图像交叉关联，另一个用于将载物台高度调整为真心高度。
  8. 配置焦点状态。
    1. 单击" 焦点"调色板。
    2. 使用以下显微镜设置配置对焦状态:成像光学元件（纳米探头中的放大倍率为45，000x SA模式），照明条件（光斑尺寸:8，亮度934400），像素化:1和相机曝光时间:1.0秒。
    3. 将焦点集中在孔附近的无定形碳区域。请参阅 表 1 中提供的 Latitude-S 状态摘要。
    4. 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
      注:SA模式表示电子显微镜中的高放大倍率范围。对焦状态是较高的 SA 范围放大倍率。在对焦模式下，光束被移动到目标孔附近的碳区域，并自动执行对焦以收集数据状态下的数据。带通滤波器与汉宁或软矩形滤波器相结合，在对焦状态下用于测量同一区域的两个对焦状态图像之间的偏移（图2）。上述参数可以根据用户需求而变化。
  9. 配置数据状态。
    1. 单击" 数据"选项板。
    2. 使用以下显微镜设置配置数据状态:成像光学元件（例如，在纳米探头的SA模式下放大倍率为28，000x，45，000x，54，000x），照明条件（光斑大小:8，亮度934400），分档:1和相机曝光时间:1.0秒。
    3. 请参阅 表 1 中给出的 Latitude-S 状态摘要。
    4. 单击" 下一步 "移动到下一个状态。
      注:数据状态是根据像素大小要求和目标分辨率选择的最高放大倍率（图2）。通常，聚焦后，光束会自动移动到目标区域以收集数据。上述参数可以根据用户的要求进行更改。

4. 焦点配置

  1. 单击" 焦点配置调色板"。在给定选项卡中指定散焦值的范围和步长。
  2. 按 "下一步 "按钮转到下一步。
    注:较低的散焦值可用于高分辨率数据采集。通常，散焦步长为0.25或0.5的散焦值为-0.5至-3.0 μm，用于图像采集。如果用户只想筛选示例，则可以跳过焦点设置步骤。只需按调色板上的" 下一步 "按钮即可跳过焦点配置步骤。

5. 精细对齐

  1. 专注于网格上的一些特征（例如，冰污染六角形冰）;参见 图3。
    注意:功能不应太大或太小。它们在 Atlas 状态放大倍率 115 倍（LA 模式）和数据放大倍率下都应可见。
  2. 单击" 捕获 "按钮。将红叉标记定位在不同状态的每个图像上的同一特征上。
  3. 从焦点、数据和孔状态开始，因为它们的视野比图集和网格状态大得多。放大地图集和格网状态，将红叉标记定位在地图集和格网状态中的同一要素上。
  4. 单击" 计算 "按钮以计算五个不同状态的位置，这将计算每个状态之间的偏移量并将其反射到输出窗口中。
    注:偏移值已集成到状态中以供进一步使用（图3）。执行精细对准以提供每个状态位置的高精度（图3）。这种精细对齐有助于精确定位所有五个州的确切位置。 精细对准 对于单颗粒数据采集至关重要。因此，强烈建议在成像之前执行精细对准。

6. 使用Latitude-S的数据采集程序

  1. 单击" 捕获"选项板。
    注:通常，地图集数据以低放大倍率（115倍）收集，以可视化大多数网格正方形。
  2. 根据要求选择地图集的大小以覆盖整个网格或部分网格（例如，6 x 6、8 x 8、12 x 12、6 x 8、8 x 6、12 x 8 或 8 x 12）。
    注:16 x 16 图集大小覆盖了整个网格。
  3. 单击" 捕获 "按钮以捕获地图集。
    注:Latitude-S主导航窗口打开并填满数字显微图中的可用空间（补充图S5）。主导航窗口中的三个图片窗格以三种不同的放大倍率显示系统状态的图像。整个地图集当前以其当前获取状态显示在最左侧窗格中。地图集中的图块将在每次捕获发生时填满。
  4. 通过在图集上导航，根据冰层厚度选择网格正方形（附图 S5）。选择所需的网格方块后，单击" 计划 "按钮，并在捕获每个网格方块时观察网格方块中的磁贴填满。
  5. 选择网格方块后，单击" 计划 "按钮。
  6. 通过添加其位置，在栅格正方形中选择一个具有代表性的孔。获取孔图像后，定义数据和焦点位置，并将布局另存为模板（附图S6）。
  7. 单击" 自动查找"，给出孔大小（例如，R1.2 / 1.3），然后单击程序中的" 查找 "按钮，这将使 "查找" 程序根据孔径自动查找孔。接下来，单击" 标记 "按钮以添加模板（图 4），并在一个网格或部分网格正方形的所有孔中添加红色圆圈标记。
  8. 设置强度以从网格方块和冰污染中去除孔（图4）。
    注意:最后，所选孔将标记为黄色，用于调度数据收集。
  9. 单击纬度任务中的计划按钮，通过自动查找添加孔后。
    注:在安排自动数据收集之前，请确保液氮罐液位充足，自动加载器涡轮泵已关闭，并且 RAID 驱动器空间可用。Latitude-S 任务管理器显示为数据收集计划的数据集、格网正方形、孔和数据状态的数量（图 5）。在Latitude-S GUI中，各种配色方案将可见，并且将显示不同配色方案的含义:1.黄色表示计划外;2. 绿色表示已安排;3. 蓝色表示已获得;4. 红色表示失败。

7. 冷冻电镜数据处理

注:刺突蛋白的冷冻电镜图像处理在最近的文献中有详细描述25。

  1. 使用RELINE 3.011对SARS-CoV2的刺突蛋白进行图像处理。
  2. 使用Latitude-S手动筛选收集的电影图像，并使用MotionCor2软件9对单个电影执行光束诱导的运动校正。在cisTEM软件包的帮助下手动执行运动校正显微照片的初始筛选14。
    注:近85%的自动采集显微照片质量良好，数据信号在3.7-5.2埃范围内，这是使用cisTEM软件14 计算的（补充图S7A，B）。
  3. 使用 RELION 3.0 软件包处理数据11。
    1. 手动拾取尖峰颗粒并对其进行2D类分类（补充图S7C）。使用最佳 2D 类作为参考，使用 RELION 自动选择工具从显微照片中自动选择 3，99，842 个单尖峰粒子11。
      注:在对颗粒进行3D分类之前，进行了三轮2D分类（补充图S8）。选择大约2，55，982个单一颗粒进行3D分类，并将数据集分为六类。最终的3D自动细化是用最好的类进行的;从3D分类中获得85，227个尖峰颗粒。
    2. 自动细化后，使用适当的光束倾斜参数执行每个粒子散焦细化，以提高分辨率。接下来，使用 RELION 3.0 软件包对颗粒进行贝叶斯抛光11。最后，使用抛光粒子集使用RELION 3.011进行另一轮3D自动细化。

结果

在当前的大流行形势下，冷冻电镜在表征SARS-CoV-226，27，28，29的各种蛋白质的结构方面起着关键作用，这可能有助于开发针对该病毒的疫苗和药物。迫切需要以有限的人力资源进行快节奏的研究工作，以抗击2019年的冠状病毒病。单颗粒冷冻电镜中的数据采集是大分子结构测定中耗时但至关重要的步骤...

讨论

Latitude-S 是一个直观的用户界面，它提供了一个环境，可以在两天内自动设置和收集数千张高分辨率显微照片或电影文件。它提供了跨网格的轻松导航，并在显微镜载物台从低放大倍率移动到高放大倍率时保持显微镜载物台的位置。使用Latitude-S进行数据采集的每个步骤都非常省时，具有简单的用户界面，以高达4.5 GB / s的速度快速流式传输数据以及在采集过程中同时显示数据等功能。此外，预校准...

披露声明

作者没有竞争或财务利益冲突需要声明。

致谢

我们感谢印度生物技术部，科学技术部（DST）和科学部以及人力资源开发部（MHRD）提供资金和IISc-Bangalore的冷冻电镜设施。我们感谢位于班加罗尔IISc的国家冷冻电镜设施的DBT-BUILDER计划（BT / INF / 22 / SP22844 / 2017）和DST-FIST（SR / FST / LSII-039 / 2015）。我们感谢科学与工程研究委员会（SERB）（拨款编号-SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608和SERB-IPA/2020/000094）、DBT（拨款编号:SERB）的财政支持。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017）。我们感谢Ishika Pramanick女士准备冷冻电镜网格，冷冻电镜数据收集和准备 材料表。我们还感谢Suman Mishra先生的冷冻电镜图像处理，并帮助我们准备数字。我们感谢Raghavan Varadarajan教授帮助我们为这项研究获得纯化的刺突蛋白样品。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Blotting paperTed Pella, INC.47000-100EM specimen preparation item
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM specimen preparation unit
CassetteThermo Fisher Scientific1020863EM specimen preparation unit
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM specimen preparation item
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM specimen preparation tool
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube glow discharge machine
K2 DEDGatan Inc.N/ACryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Imaging software
Loading stationThermo Fisher Scientific1130698EM specimen preparation unit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/ACryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM specimen preparation unit

参考文献

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