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要約

単粒子のクライオ電子顕微鏡では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージとユーザーフレンドリーなパイプラインが必要です。ここでは、完全に自動化された画像取得ソフトウェアパッケージLatitude-Sの応用と、低線量条件下でのガラス化生体分子のデータ収集のための実用的なパイプラインを紹介する。

要約

過去数年間、単粒子クライオ電子顕微鏡(cryo-EM)の技術と方法論的進歩は、生物学的高分子の高解像度構造決定のための新しい道を開きました。クライオEMの著しい進歩にもかかわらず、単粒子分析ワークフローの様々な側面において改善の余地が依然として存在する。単粒子分析では、高スループットの自動データ取得に適したソフトウェアパッケージが必要です。過去8年間に単粒子クライオEM用の自動イメージング用に、いくつかの自動データ取得ソフトウェアパッケージが開発されました。本論文は、低用量条件下でのガラス化生体分子に対する完全自動画像取得パイプラインの適用を提示する。

これは、cryo-EMデータを完全、自動的、および正確に収集できるソフトウェアパッケージを示しています。さらに、さまざまな顕微鏡パラメータは、このソフトウェアパッケージによって容易に制御されます。このプロトコルは、直接電子検出器(DED)を搭載した200 keVクライオ電子顕微鏡を用いた重症急性呼吸器症候群-コロナウイルス2(SARS-CoV-2)スパイクタンパク質の自動イメージングにおけるこのソフトウェアパッケージの可能性を示しています。1回のセッション(48時間)で約3,000枚のクライオEMムービー画像を取得し、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質の原子分解能構造を生み出しました。さらに、この構造研究は、スパイクタンパク質が開いた1-RBD(受容体結合ドメイン)およびすべてのRBD閉鎖された立体構造の2つの主要な立体構造を採用することを示している。

概要

単粒子クライオEMは、生体高分子の高分解能構造決定のための主流の構造生物学技術となっています1。単粒子の再構築は、2次元(2D)粒子画像を抽出するために膨大な数のガラス化サンプルの顕微鏡写真を取得することに依存し、その後、生物学的高分子の3次元(3D)構造を再構築するために使用されます。DEDの開発前に、単粒子の再構成から達成された分解能は4から30Å4,5の範囲に及んだ。最近、単粒子クライオEMからの達成可能な解像度は1.8 Å6を超えています。DEDおよび自動データ収集ソフトウェアは、データ収集のための人間の介入が最小限に抑えられるこの解決革命7の主要な貢献者となっています。一般に、クライオEMイメージングは、低電子線量率(20-100 e/Å2)で行われ、生体試料の電子ビームによる放射線損傷を最小限に抑え、画像内の低信号対雑音比(SNR)に寄与します。この低いSNRは、単粒子分析を用いた生体高分子の高分解能構造の特性解析を妨げる。

新世代の電子検出器は、CMOS(相補的な金属酸化物半導体)ベースの検出器で、これらの低いSNR関連の障害を克服することができます。これらの直接検出CMOSカメラは、カメラが優れた点広がり機能、適切なSNR、および生体高分子のための優れた探偵量子効率(DQE)に寄与するため、信号の高速読み出しを可能にします。直接検出カメラは、記録された画像に高いSNR8と低ノイズを提供し、その結果、検出器が画像にどれだけのノイズを追加するかを測定する探偵量子効率(DQE)の定量的な増加をもたらします。これらのカメラは毎秒数百フレームの速度で映画を録画し、高速データ取得を可能にします 9,10.これらの特性はすべて、低線量のアプリケーションに適した高速直接検出カメラを作ります。

動補正スタック画像は、RELION11、FREALIGN12、cryoSPARC13、cisTEM14、EMAN215などの様々なソフトウェアパッケージを使用して、2D分類を計算し、高分子の3D密度マップを再構築するためにデータ処理に使用されます。ただし、単一粒子解析では、高解像度の構造を実現するためには膨大なデータセットが必要です。したがって、自動データ取得の通行料は、データ収集に非常に重要です。大規模なクライオEMデータセットを記録するために、過去10年間にいくつかのソフトウェアパッケージが使用されてきました。AutoEM16、AutoEMation17、Leginon18、SerialEM19、UCSF-Image420、TOM221、SAM22、JAMES23、JADAS24、EM-TOOLS、EPUなどの専用ソフトウェアパッケージが自動データ取得用に開発されています。

これらのソフトウェアパッケージは、低倍率画像を高倍率画像に相関させることによって、自動的に穴位置を見つけるためにルーチンタスクを使用し、低線量条件下で画像取得のための割り当て氷の硝子体氷で穴を識別するのに役立ちます。これらのソフトウェアパッケージは、繰り返しのタスクの数を減らし、オペレータの物理的な存在を中断することなく、数日間連続して高品質のデータの膨大な量を取得することにより、クライオEMデータ収集のスループットを向上させます。Latitude-S は、単一粒子分析のための自動データ収集に使用される同様のソフトウェア パッケージです。しかし、このソフトウェアパッケージはK2/K3 DEDsにのみ適しており、これらの検出器を備えています。

このプロトコルは、200 keV cryo-EMを搭載した直接電子検出器を備えたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の自動画像取得におけるLatitude-Sの可能性を示しています( 材料表を参照)。このデータ収集ツールを使用して、SARS-CoV-2スパイクタンパク質の3,000のムービーファイルが自動的に取得され、さらにデータ処理が行われ、3.9-4.4Å分解能スパイクタンパク質構造を得ます。

プロトコル

注:クライオEMデータ収集には、1.cryo-EMグリッドの準備、2.顕微鏡のキャリブレーションとアライメント、3.自動データ収集の3つの重要なステップが必要です(図1)。さらに、自動データ収集は、適切な領域選択、b.の最適化、緯度-S、c.開始自動穴選択、およびd.開始自動データ収集に細分化されます(図1)。

1. 自動データ取得のためのCryo-EMグリッドの準備とサンプルローディング

  1. グロー放電器を使用してグリッドを清掃し、実験要件に基づいてグロー放電パラメータを変更します(ここでは、20 mAで60 s)。
  2. 作りたてのタンパク質サンプル(3 μL)をグロー放電グリッドに加え、10秒インキュベートします。
  3. 湿度100%で3-5sのグリッドをブロットし、すぐにクライオプランジャーを使用して液体エタンに突っ込みます。
  4. グリッドをクリップリングに手動でクランプし、フレキシブルなCクリップリングを使用してカートリッジを形成します。
  5. 冷凍カートリッジ取り付けされたグリッドをオートローダーカセットにロードし、ナノキャップでカセットを顕微鏡のプリクールオートローダーに転送してデータ収集します。

2. 自動データ取得前の顕微鏡のチューニングと基本的なアライメント

  1. ビームシフト
    1. [直接配置]タブから[梁シフト]をクリックします。
    2. 倍率を下げ、 多機能 X および Y ノブを使用して光軸にビームを中央に配置します。
  2. ピボット ポイントの配置
    1. [直接配置]タブの[位置合わせ]の[X]で、[ビームチルト]オプションをクリックします。
    2. ビームをスポットに凝縮し、 多機能 X および Y ノブを使用して動きを最小限に抑えます。
  3. C2絞りセンタリング
    1. [配置]タブからコンデンサ絞りを選択します。
    2. ビームをスポットに凝縮し、ビームを光軸に中央に配置し、ビームを拡大して円を均等に覆います。
    3. コンデンサ2絞りが調整されるまで、これらの手順を繰り返します。
  4. コマフリーアライメント
    1. [直接配置]タブから[コマなしの位置合わせ X]をクリックして、ビームを光軸に位置合わせします。
    2. 多機能ノブを使用して、FFTの形状と動きを最小限に抑えます(安定していることを確認してください)。
    3. コマ - フリーアライメント Y についても同じ手順を繰り返します。
  5. Cツインレンズのため、クライオEMでデータ収集の前に平行光を設定します。
    1. 目的開口(70 μm)を回折モードで挿入します。
    2. 焦点が強いノブ(対物レンズとC2レンズ電流)を制御して、回折レンズの前面焦点面に目的開口を焦点を合わせます。
    3. 適切な焦点を下した後、客観的な絞りの鮮明なエッジが見えるようにしてください。
    4. ビームストッパーを挿入し、金粉回折リングが最小化されるまで強度を広げます。
      注:ビームが適切に広がっていれば、金色の粉末の透明な回折リングが画面に表示され、ビームが平行であることを示します。
    5. 平行照明を設定した後、ビームストッパーを引き込み、顕微鏡モードを ナノプローブに変更します。
      メモ:データ収集を開始する前に、顕微鏡のチューニングを確認して、顕微鏡の最適な性能を確認してください。これらの設定はすべて、顕微鏡の ダイレクトアライメントGUI タブで行われます。すべての顕微鏡のチューニングは、データ収集の前にテストグリッドを使用して行われます。

3. 緯度Sによるデータ取得

  1. Latitude-S 自動データ取得ソフトウェアを起動します。
    注:Latitude-Sのインストールには、データ収集前に実行される顕微鏡キャリブレーションも必要であり、設定は永久に保存されます。データ収集の 5 つの異なる状態は、4 つの異なる倍率で調整されます (図 1 および 図 2)。アトラス状態とグリッド状態は、LMモード(低倍率範囲)で2つの異なる倍率にあります。穴の状態は SA モード (高倍率の範囲) ですが、適度な拡大率で表示されます。フォーカスとデータの状態は、高倍率 SA モードを使用します。
    1. [スタート]メニューから[デジタルマイクログラフ]をクリックするか、デスクトップのDigitalMicrographアイコンをダブルクリックします。
    2. デジタルマイクログラフからテクニックマネージャアイコンを選択します。
      注: このシステムには 、TEM と 緯度 S の アイコンが表示されます (図 2 および 図 S1 の補足図)。
    3. 単一粒子自動データ収集の [緯度-S ]アイコンを選択します。
      メモ:K2カメラは、リニア/統合、カウント、超解像度の3つのモードで動作します。ユーザーは 、DigitalMicrographのインターフェースで任意のモードを選択できます。データ イメージは、線量分数画画像スタックとして保存することも、異なるビット深度の MRC、TIF、.dm4 ファイルの合計画像として保存することもできます。さらに、データはK3カメラの動き補正画像として保存することができます。K2 カメラでは、未処理のイメージ スタックを 4 ビット MRC、8 ビット TIF、または 8 ビットの .dm4 ファイルとして保存できます。
  2. 前のセッションの設定に基づいて新しいセッションを作成します。
    1. パレットの「 前のセッションに基づく 」チェックボックスをオンにします。
    2. [ 新規作成 ] ボタンを選択します。
    3. 新しいセッションの設定の基になるセッションを含むフォルダを選択します。前のセッションディレクトリに移動して、新しいセッションを作成します。新しいセッションと関連データを保存するフォルダを選択します。
    4. 新しいセッションと関連データを保存するフォルダを選択して選択します。
      注: 各状態とその下にある設定(拡大、照明条件、イメージ、またはプロジェクター)とビームシフトとカメラパラメータ(総露出、単一フレーム露出、およびビニング)は、既存のセッションから新しいセッションにエクスポートされます。フォルダのパスは、パレットの下部にテキスト文字列として表示されます。各状態パレットと構成パレットには、タイトルにアスタリスク (*) が付加され、既に設定されており、使用できる状態であることを示します。
  3. 既存のセッションを続行します。
    1. パレットの 「続行 」ボタンを押して、既存のセッションを続行します。
      注: アトラスモンタージュは変更できません。
    2. 続行する必要があるセッションを含むフォルダーを選択して、ナビゲートします。
  4. まったく新しいセッションを開始します。
    1. パレットの [新規]タブ をクリックします。継続するセッションが含まれているフォルダーを選択します。データを保存するフォルダを選択します。
      注: 既定のフォルダー名は、日付と時刻を使用して作成されます。
    2. [設定]アイコンをクリックします。表示される [状態の管理] 探索ボックスで、状態を追加し、TEM 条件、カメラの状態、およびイメージ/スタックを設定し、状態に名前を付けます。
      注: 自動データ取得ワークフローでは、自動データ収集に 5 つの異なる状態が使用されます。これらの状態は、それぞれの状態パレットで構成および保存されます。状態の概要は 表 1 に示されています。
  5. アトラス状態を設定します。
    1. アトラス状態パレットをクリックします。
    2. ナノプローブの拡大115x LMモード、照明条件スポットサイズ8、明るさ934400、ビニング:1とカメラ露出時間:低倍率での撮像時間:1.0 sのパラメータでアトラス状態を設定します。 表 1 に示す状態の概要を参照してください。
    3. 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
      注: アトラス状態は最も低い倍率状態で、グリッド全体の調査を提供します(補足図 S2)。一般的に、この状態は、低倍率でグリッド全体を視覚化し、氷の厚さ、平坦度、およびグリッドの壊れた正方形を判断するのに役立ちます。グリッドの異なる領域にアトラスを生成して、最適な氷の厚さとグリッドの最適でない氷の厚さを観察することをお勧めします(補足図S3)。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
  6. グリッド状態を構成します。
    1. グリッド状態パレットをクリックします。
    2. 次の顕微鏡イメージング光学(ナノプローブの拡大380x LMモード)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ626,200)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 sでグリッド状態を設定します。
    3. 表 1 に示す緯度-S の状態の概要を参照してください。
    4. 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
      注: グリッドの状態は、視野が 1 つのグリッド四角形になるように、アトラス状態よりも高い倍率で設定されます(図 2)。この特定の倍率では、1つのグリッド四角形が観察される。したがって、穴は、穴の氷の厚さを確認するのに役立つこの倍率で正しく観察されます(補足図S4)。シンプルなバンドパスフィルタは、パテントグリッドの穴を見つけるためにグリッド状態で使用されます。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
  7. 穴の状態を設定します。
    1. 穴パレットをクリックします。
    2. 穴の状態を次の顕微鏡設定で設定します:イメージング光学(ナノプローブの拡大4500x SMモード)、照明条件(スポットサイズ:7とビーム直径8.81μm)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 s。
    3. 必要に応じて、グリッドの種類に基づいてパラメータを変更します。 表 1 に示されている状態の概要を参照してください。
    4. 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
      注: SA モードは、電子顕微鏡の高倍率範囲を示します。穴の状態は、数マイクロメートル(10〜20 μm)の視野を持つSA倍率範囲内にあります(図2 および 補足図S4)。この倍率の範囲は、アトラスまたはグリッドの状態よりも高いが、フォーカス/データ状態よりもはるかに小さいです。この倍率では、個々の穴が表示されます。穴のサイズは、汚染の高い度、空の穴、および穴の適切な氷の厚さを観察するのに適しています。イメージング用の穴は、これらの仮定に基づいて選択されます。穴の状態では、1 つは新しい穴イメージと穴参照イメージを相互に関連付け、もう 1 つはステージの高さをユーセントリック高に調整するフィルタです。
  8. フォーカス状態を構成します。
    1. フォーカスパレットをクリックします。
    2. 焦点状態を次の顕微鏡設定で設定します:イメージング光学(ナノプローブの拡大45,000x SAモード)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ934400)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 s。
    3. 穴の近くのアモルファスカーボン領域に焦点を当てます。 表 1 に示す緯度 S の状態の概要を参照してください。
    4. 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
      注: SA モードは、電子顕微鏡の高倍率範囲を示します。フォーカス状態は、SA 範囲の倍率が高くなります。フォーカスモードでは、ビームはターゲットホールの近くのカーボン領域にシフトされ、自動的にフォーカスを実行してデータ状態のデータを収集します。焦点状態では、ハンニングまたはソフト長方形のフィルタと組み合わせたバンドパスフィルタを使用して、同じ領域の2つのフォーカス状態画像間のオフセットを測定します(図2)。上記のパラメータは、ユーザーのニーズに応じて変更できます。
  9. データ状態を構成します。
    1. データ パレットをクリックします。
    2. 画像化光学(例えば、ナノプローブのSAモードで倍率28,000x、45,000x、54,000倍)、照明条件(スポットサイズ:8と明るさ934400)、ビニング:1とカメラ露出時間:1.0 sのイメージング光学を使用してデータ状態を構成します。
    3. 表 1 に示す緯度-S の状態の概要を参照してください。
    4. 次の状態に移動するには、[ 次へ ]をクリックします。
      注: データ状態は、ピクセル サイズの要件とターゲット解像度に基づいて選択される最大の倍率です(図 2)。一般に、焦点を合わせた後、ビームは自動的にターゲット領域に移動してデータを収集します。上記のパラメータは、ユーザーの要件に基づいて変更できます。

4. フォーカス構成

  1. [フォーカス]設定パレットをクリックします。指定したタブで、フォーカス解除の値の範囲とステップサイズを指定します。
  2. [次へ] ボタンを押して、次のステップに進みます。
    注: 低いデフォーカス値は、高解像度のデータ取得に使用できます。一般に、0.25または0.5デフォーカスステップサイズの-0.5~-3.0 μmのデフォーカス値は、画像取得に使用されます。サンプルをスクリーニングするだけの場合は、フォーカス設定の手順を省略できます。パレットの Next ボタンを押すだけで、フォーカス設定のステップをスキップします。

5. 細かいアライメント

  1. グリッド上のいくつかの機能(例えば、氷の汚染六角形の氷)に焦点を当てます。 図3を参照してください。
    注: 機能は大きすぎたり小さすぎたりしないでください。これらは、アトラス状態拡大115x(LAモード)とデータ倍率の両方で表示される必要があります。
  2. [ キャプチャ ]ボタンをクリックします。異なる状態の各イメージ上の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。
  3. 視野がアトラスとグリッドの状態よりもはるかに大きいため、フォーカス、データ、穴の状態から始めます。アトラスとグリッドの状態を拡大して、アトラスとグリッドの状態の同じフィーチャに赤い十字マークを配置します。
  4. [計算]ボタンをクリックして、5つの異なる状態の位置を計算し、各状態間のオフセットを計算し、出力ウィンドウに反映します。
    注: オフセット値は、さらに使用するためにステートに統合されます(図 3)。細かなアライメントが各状態の位置の精度を高くするために行われる(図3)。この細かい配置は、5 つの状態すべてで正確な位置を特定するのに役立ちます。 細かい位置合わせは 、単一粒子データ集録に不可欠です。そのため、イメージングの前にファインアライメントを実行することを強くお勧めします。

6. 緯度Sを用いたデータ取得手順

  1. キャプチャ パレットをクリックします。
    注: 一般的に、アトラスデータは低倍率(115x)で収集され、グリッドの大部分を視覚化します。
  2. 要件に基づいてグリッド全体またはグリッドの一部をカバーするアトラスのサイズを選択します(例えば、6 x 6、8 x 8、12 x 12、6 x 8、8 x 6、12 x 8、または8 x 12)。
    注: 16 から 16 アトラスサイズはグリッド全体をカバーします。
  3. [キャプチャ]ボタンをクリックして、アトラスをキャプチャします。
    注: メインの Latitude-S ナビゲーション ウィンドウが開き、DigitalMicrograph の使用可能なスペースがいっぱい表示されます (補足図 S5)。メイン ナビゲーション ウィンドウの 3 つのピクチャ ウィンドウには、3 つの異なる倍率でシステム状態のイメージが表示されます。現在、全体のアトラスは、現在の取得状態で一番左側のペインに表示されます。各キャプチャが発生すると、アトラス内のタイルがいっぱいになります。
  4. アトラス上を移動して氷の厚さに基づいてグリッドの正方形を選択します(補足図S5)。目的のグリッドの正方形を選択したら、[ スケジュール ]ボタンをクリックし、グリッドの正方形がキャプチャされるごとに、グリッドの正方形のタイルがいっぱいに表示されます。
  5. グリッドの正方形を選択したら、[ スケジュール ] ボタンをクリックします。
  6. グリッドの位置を追加して、グリッドの正方形の代表穴を選択します。穴の画像を取得したら、データとフォーカス位置を定義し、レイアウトをテンプレートとして保存します(補足図S6)。
  7. [自動検索]をクリックし、穴のサイズ(R1.2/1.3など)を指定し、プログラムの[検索]ボタンをクリックすると、自動的に穴の直径に基づいて穴が見つかります。次に、[マーク] ボタンをクリックしてテンプレートを追加し (図 4)、1 つのグリッドまたは部分的なグリッドの四角形のすべての穴に赤い円マークを追加します。
  8. グリッドの正方形と氷の汚染から穴を取り除く強度を設定します(図4)。
    注: 最後に、選択した穴はデータ収集のスケジュールに黄色でマークされます。
  9. [自動検索]を通じて穴を追加した後、Latitude タスクの[スケジュール]ボタンをクリックします。
    注: 自動データ収集をスケジュールする前に、液体窒素タンクのレベルが十分で、オートローダー ターボポンプがオフで、RAID ドライブの空き容量があることを確認してください。Latitude-S タスク マネージャーは、データ収集にスケジュールされたアトラス、グリッドの正方形、穴、およびデータの状態の数を示します (図 5)。Latitude-S GUI では、さまざまな配色が表示され、異なる配色の意味が表示されます。2. 緑はスケジュールを示します。3. 青は取得済みであることを示します。4. 赤は失敗したことを示します。

7. クライオEMデータ処理

注:スパイクタンパク質のCryo-EM画像処理は、最近の文献25に詳述されている。

  1. RELION 3.011を用いてSARS-CoV2のスパイクタンパク質の画像処理を行う。
  2. Latitude-Sを使用して収集したムービー画像を手動でスクリーニングし、MotionCor2ソフトウェア9を使用して個々の映画のビーム誘発モーション補正を行います。cisTEMソフトウェアパッケージ14の助けを借りて、モーション補正された顕微鏡写真の初期スクリーニングを手動で行います。
    注:自動取得された顕微鏡写真のほぼ85%は良好な品質であり、データはcisTEMソフトウェア14 (補足図S7A、B)を使用して計算される3.7-5.2 Å内の信号を持っていました。
  3. RELION 3.0 ソフトウェア パッケージ11を使用してデータを処理します。
    1. スパイクパーティクルを手動で選択し、2D クラス分類(補足図 S7C)に適用します。RELION 自動ピック ツール 11 を使用して、マイクログラフから 3,99,842 個のシングルスパイク パーティクルを自動ピックするためのリファレンスとして、最適な 2D クラスを使用します。
      注:3D分類の3ラウンドは、粒子を3D分類にする前に行いました(補足図S8)。3D分類のために約2,55,982個の単一粒子が選択され、データセットは6つのクラスに分類されました。最終的な3D自動改良は、最高のクラスで行われました。85,227のスパイク粒子が3D分類から得られた。
    2. 自動改良後、解像度を向上させる適切なビームチルトパラメータを使用して、パーティクルごとに焦点を合わせ解除するリファインを実行します。次に、RELION 3.0ソフトウェアパッケージ11を用いて、ベイジアン研磨に粒子を供する。最後に、RELION 3.011 を使用して、別の 3D 自動細分化のラウンドに対して、ポリッシュパーティクル セットを使用します。

結果

現在のパンデミック状況では、CRYO-EMはSARS-CoV-226-226,27,28,29の様々なタンパク質の構造を特徴づける上で重要な役割を果たしており、ウイルスに対するワクチンや薬剤の開発に役立つ可能性があります。2019年のコロナウイルス病に対抗するために、限られた人材を持つ迅速な研究努力が急務です。?...

ディスカッション

Latitude-S は直感的なユーザー インターフェイスで、2 日間で何千もの高解像度の顕微鏡写真やムービー ファイルを自動的にセットアップして収集する環境を提供します。それは格子を渡る容易な運行を提供し、顕微鏡段階の位置を維持し、低倍率から高倍率に移動する。Latitude-S によるデータ取得の各ステップは、シンプルなユーザー インターフェイス、最大 4.5 GB/秒の速度での高速データ?...

開示事項

著者は、宣言する競合や財政的な利益相反はありません。

謝辞

我々は、バイオテクノロジー省、科学技術省(DST)、インドの人事開発省(MHRD)に対し、IISc-バンガロールの資金調達とクライオEM施設について認める。我々は、バンガロール州IIScのナショナルクライオEM施設に対するDBT-BUILDERプログラム(BT/INF/22/SP22844/2017)とDST-FIST(SR/FST/LSII-039/2015)を認めます。我々は、理工学研究委員会(SERB)(グラントNo.SB/S2/RJN-145/2015、SERB-EMR/2016/000608およびSERB-IPA/2020/000094)、DBT(グラントNo.1)からの財政支援を認める。BT/PR25580/BRB/10/1619/2017)。クライオEMグリッド、クライオEMデータ収集、 材料表の準備をしてくれたイシカ・プラマニックさんに感謝します。また、スマン・ミシュラ氏のクライオEM画像処理と、フィギュアの準備を手伝ってくれたことに感謝します。ラガヴァン・バラダラジャン教授は、この研究のために精製スパイクタンパク質サンプルを入手するのを助けてくれたことに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Blotting paperTed Pella, INC.47000-100EM specimen preparation item
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM specimen preparation unit
CassetteThermo Fisher Scientific1020863EM specimen preparation unit
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM specimen preparation item
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM specimen preparation tool
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube glow discharge machine
K2 DEDGatan Inc.N/ACryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Imaging software
Loading stationThermo Fisher Scientific1130698EM specimen preparation unit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/ACryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM specimen preparation unit

参考文献

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