تقييم إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج ماوس متلازمة المبيض المتعدد الكيسات

Summary

تصف هذه الدراسة القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأر متلازمة المبيض المتعدد الكيسات باستخدام متتبع جلوكوز نظائري مستقر عبر الوريد الخلفي في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية بالجلوكوز جنبا إلى جنب.

Abstract

متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو مرض شائع يؤدي إلى اضطرابات في استقلاب الجلوكوز، مثل مقاومة الأنسولين وعدم تحمل الجلوكوز. استقلاب الجلوكوز Dysregulated هو مظهر مهم من مظاهر المرض وهو المفتاح لمسببات الأمراض. لذلك، فإن الدراسات التي تنطوي على تقييم استقلاب الجلوكوز في PCولين الكلور ذات أهمية قصوى. وقد حددت دراسات قليلة جدا إنتاج الجلوكوز الكبدي مباشرة في نماذج PC أو إس باستخدام متتبعات الجلوكوز غير المشعة. في هذه الدراسة، نناقش التعليمات خطوة بخطوة لقياس كمي لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في نموذج فأرة PC أو سي إس من خلال قياس إثراء M+2 من الجلوكوز [6,6-2H2]، وهو متتبع مستقر للجلوكوز النظيري، عن طريق كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي (GCMS). يتضمن هذا الإجراء إنشاء محلول مستقر لتتبع الجلوكوز النظيري ، واستخدام موضع قسطرة الوريد الذيل وضخ متتبع الجلوكوز في كل من حالات الصيام والجلوكوز الغنية في نفس الماوس جنبا إلى جنب. يتم قياس إثراء [6,6-2H2] الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات في GCMS. ويمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة واسعة من الدراسات التي تنطوي على قياس مباشر لمعدل إنتاج الجلوكوز الكبدي.

Introduction

متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS) هو اضطراب شائع يحدث في 12٪ -20٪ من النساء في سن ^{الإنجاب1،2}. وهو مرض معقد يؤدي إلى أنماط الظاهرية المتغيرة التي تنطوي على المبيضين المتعدد الكيسات، الحيض غير النظامية والأدلة السريرية أو المختبرية من فرط الذكورة، وعادة ما يتم تشخيص عندما تلبي المرأة اثنين من المعايير ^{الثلاثة3}. أحد الجوانب السائدة في متلازمة تكيس المبايض، والعامل الرئيسي في مسببات الأمراض، هو الاختلالات الأيضية الموجودة في النساء المصابات بالمرض. النساء المصابات بمتلازمة تكيس المبايض أكثر من حالات مقاومة الأنسولين، وعدم تحمل الجلوكوز، والسمنة، ومتلازمة التمثيل ^{الغذائي3،4،5،6}. مقاومة الأنسولين ليست مجرد مظهر من مظاهر المرض، ولكن يعتقد أن تسهم في الإمراض من خلال قوة عمل هرمون اللوتين في المبيض مما يؤدي إلى زيادة إنتاج الاندروجين7^،8. ويعتقد أن مقاومة الأنسولين لها العديد من الأصول المحتملة ولكن الدراسات تشير إلى أنه قد يكون بسبب أنماط غير طبيعية من مستقبلات الأنسولين مما يشير إلى ^9,10. وقد قيمت الدراسات مقاومة الأنسولين في مرضى PCولينوس باستخدام تقنية معيار الذهب من المشبك hyperinsulinemic-euglycemic11,12,13,14,15. النساء المصابات بذلك، بغض النظر عن مؤشر كتلة الجسم، يتمتعن بمستويات أعلى من مقاومة الأنسولين مقارنة بالضوابط. يضعف التحكم في الأنسولين على إنتاج الجلوكوز في اضطرابات مقاومة الأنسولين مما يؤدي إلى إنتاج الجلوكوز الزائد. على سبيل المثال، مرضى السكري قد زادت معدلات جلوكونيوجينيسيس وضعف قمع انحلال ^{الجليكوجين16}. وعلاوة على ذلك، لوحظ ضعف قمع إنتاج الجلوكوز في الفئران ^{السكري17}. على الرغم من أن الدراسات المشبك يمكن أن تعطي قياس مقاومة الأنسولين، إلا أن القليل من الدراسات في PCولين مبايسول الخماسي الكلور تركز على القياس المباشر لإنتاج الجلوكوز في حالات الصيام والتغذية. وهذا يتطلب استخدام ضخ متتبع الجلوكوز غير المشع وقياسه عن طريق قياس الطيف الكتلي.

وقد استخدمت نماذج الحيوانات على نطاق واسع في بحوث PCOS. تم إنشاء كل من نماذج العجاف والسمنة من نوع PCوس مورين عن طريق إدارة الاندروجين قبل الولادة, prepubertally, أو ما بعد ^pubertally18. نماذج القوارض متلازمة تكيس المبايض تظهر أيضا الاختلافات الأيضية مقارنة مع الضوابط الخاصة بهم. أظهرت البيانات السابقة من مختبرنا اختبارات تحمل الجلوكوز غير الطبيعية (GTT) في نماذج فأرة PCOS (الهزيل والبدناء) ، بما يتفق مع أدب PCOS ^{البشري19}. استخدام نموذج العجاف والسمنة يسمح بمزيد من التحقيق في الاختلافات الأيضية. على وجه التحديد، يسمح هذا النموذج بتقييم معدل إنتاج الجلوكوز مباشرة باستخدام متتبعات الجلوكوز النظيرية. واحدة من الأكثر استخداما مستقرة تتبع الجلوكوز النظائري هو [6,6-2H2]الجلوكوز. [6,6-2H2]يمكن قياس إثراء الجلوكوز باستخدام مشتق بنتاسيتات كما هو موضح ^سابقا20.

في هذه الدراسة، كان هدفنا هو قياس معدل إنتاج الجلوكوز الكبدي في حالة الصيام والجلوكوز الغنية في فئران PC أو إس باستخدام ضخ الجلوكوز النظائري. ويمكن تطبيق هذه التقنيات على مجموعة واسعة من التجارب التي تنطوي على حركية الجلوكوز.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة لكلية بايلور للطب.

1. إعداد [6,6-2H2] الجلوكوز

1. قبل يوم واحد من الإجراء، قم بإعداد متتبع الجلوكوز النظيري المستقر في المحلول الملحي الطبيعي. لهذه التجربة، [6,6-2H2] تم استخدام الجلوكوز كمتتبع لقياس معدل ظهور الجلوكوز البلازما.
   ملاحظة: في هذه التجربة، تم قياس إنتاج الجلوكوز أثناء الصيام والحالات الغنية بالجلوكوز، لذلك تم إعداد نظائر الجلوكوز في تحضيرين مختلفين. إعداد الحلول بطريقة أن الجرعة النهائية غرس ستكون قريبة من 1 ملغ / (kg·min) و 2 ملغ / (كغ · دقيقة) ، على التوالي. وقد تم تحسين هذه التركيزات من خلال العديد من الدراسات التجريبية السابقة.
2. إعداد أول غرس مع الجلوكوز فقط [6,6-2H2] كمتتبع لتمثيل حالة الصيام عن طريق حل المعقمة والبيروجين الحرة [6,6-2H2] الجلوكوز في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ معقمة.
3. إعداد غرس الثاني عن طريق حل كل من [6,6-2H2] متتبع الجلوكوز جنبا إلى جنب مع الجلوكوز غير النظائري (~ 20 ملغ /كغ·دقيقة) في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ معقمة لمحاكاة حالة تغذية.
   ملاحظة: في التجربة الحالية، تم استخدام ضخ معدل ثابت جاهز من [_6,6-2H2] الجلوكوز في (~) 1.08 ملغ/(kg·min) (حالة الصيام) و (~) 1.9 ملغم/كغ·دقيقة (حالة غنية بالجلوكوز). من أجل تقليد "حالة الجلوكوز الغنية"، تم تعيين معدل ضخ D-الجلوكوز في (~) 18.8 ملغ /(kg·min).
4. بمجرد إعداد الحلول، قم بتصفية الحلول العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينها عند 4 درجات مئوية. قم بتدفئة الحلول لدرجة حرارة الغرفة قبل التسريب. تحميل الحلول على المحاقن 1 مل prelabeled.
5. إعداد المضخة لتسهيل ضخ معدل ثابت تستعد من غرس الأولى (لحالة القاعدية) التي تحتوي على التتبع فقط، وبرنامج المضخة لضخ معدل ثابت من النظائر في 150 ميكرولتر / ساعة لمدة 3 ساعة.
6. في نهاية إعداد الصيام 3 ح، واستبدال الحقنة الأولى بثرس مع حقنة غرس الثانية التي تحتوي على التتبع النظيري والجلوكوز D (للدولة تغذية محاكاة)، ورئيس ضخ ل15 دقيقة intial في 600 ميكرولتر / ساعة. تعيين المضخة إلى ضخ معدل ثابت في 150 ميكرولتر / ساعة ل3 ساعة إضافية.

2. إعداد تجارب التسريب

1. إزالة الفئران من أقفاص منازلهم ووضعها في أقفاص الصيام 3 ساعة قبل بدء التجربة. لهذه التجربة، تم استخدام فئران أنثى عمرها 4 أشهر من سلالة C57BL/6J.
   ملاحظة: لا يتطلب هذا الإجراء أي مسكن قبل أو أثناء العملية نظرا لطبيعته طفيفة التوغل.
2. تجميع معدات caging عن طريق تجميع الفئران في عدد محدد من الفئران لكل مضخة الأنسولين. ضع أقساما فوق قاعدة مسطحة ومستقرة لإنشاء أكشاك فردية للفئران. من المهم الوصول إلى قسطرة الوريد الذيل للتسريب لتشغيل، لذلك تأكد من أن هناك درجة في الجزء السفلي من باب القفص.
   ملاحظة: تم إجراء الأقفاص المعروضة في الفيديو خصيصا لهذه التجربة. الأقفاص واضحة ومصص (مصنوعة من زجاج شبكي) هناك قاعدة مسطحة ومستقرة (معدات التكاتج القياسية) التي تجلس عليها الأقسام. يتكون هذا الإعداد من عدة قطع للسماح بسهولة الإعداد في بيئات مختلفة عديدة اعتمادا على ارتفاع الجدول واحتياجات المجرب. الباب إلى قفص الشرائح لإغلاق ولديه درجة في الجزء السفلي للسماح للذيل لتناسب من خلال.
3. تجميع المحاقن 1 مل تحتوي على 1 مل من غرس القاعدية، ومن ثم الاتصال أنابيب مضخة التسريب باستخدام أنابيب البولي ايثيلين 0.28 مم معرف × 0.61 ملم.
4. إعداد مضخة التسريب عن طريق تحديد معدل إلى 150 ميكرولتر / ساعة، وهو المعدل الأساسي.
5. سخني حمام مائي إلى 48 درجة مئوية.
6. قم بإعداد محطة إدخال القسطرة المجاورة لحمام الماء الذي يحتوي على إبر 30 G 0.5 بوصة، و0.3 مم معرف × 0.64 مم أنابيب سيلاستيك، وشريط إرسال واستقبال واضح 1 بوصة.
7. بعد 3 ساعة من الصيام، ابدأ عملية إدخال القسطرة، والتي هي مفصلة أدناه.

3. إدخال القسطرة

1. حدد ماوس واحد ووضعه في حامل آمن مع الوصول إلى الذيل. مثال على ما يجب استخدامه هو زجاجة مقطعة إلى نصفين مع درجة للذيل. ضع الحامل على قاعدة مسطحة. ضع شريط قطعة على الجزء القريب من الذيل للسماح مساحة لإدراج القسطرة أكثر distally.
   ملاحظة: يجب أن يكون نوع الشريط الذي تم اختياره لهذه المهمة معتدل القوة واللصق. تم استخدام شريط وضع العلامات الورقي متعدد الأغراض في هذه التجربة لأنه خفيف وسهل التقشير.
2. إعداد القسطرة (30 إبرة G تعلق على أنابيب 0.3 ملم silastic وPE- 10 تم تعقيم الغاز) عن طريق إرفاقه إلى حقنة 1 مل تحتوي على تدفق ملحي معقم heparinized. اغسل القسطرة برفق.
3. جلب الماوس إلى حمام الماء وإدراج الذيل في حمام الماء لمدة 30-45 ق تقريبا. وهذا يساعد على توسيع الأوعية الدموية الذيل لوضع القسطرة.
4. إجراء إدخال القسطرة في ظل ظروف معقمة. مرة واحدة يتم تسخين الذيل، وتنظيف الذيل مع مناديل البنزالكونيوم ووضع النحاس الصغيرة، مشبك التمساح بلا أسنان، التي كانت محاطة سابقا إلى شكل الذيل، كما tourniquet في نهاية قريبة من الذيل. تصور الوريد الذيل الجانبي تحت عدسة مكبرة، ومن ثم إدراج بعناية القسطرة في الوريد الذيل وسحب الإبرة. قم بغسل المحلول برفق لضمان ثبات القسطرة.
5. التفاف قطعة من شريط الإرسال والاستقبال 1 بوصة حول موقع الإدراج لتأمين القسطرة. إزالة tourniquet الصغيرة من الذيل.

4. ضخ انشاء والتسريب الأول

1. ضع الماوس في قفصه الفردي واغلق الباب المنزلق ، مما يضمن أن الذيل يبرز من خلال الشق ويبقى خارج القفص.
2. ضع قطعة إضافية من الشريط على القسطرة بأكملها والذيل لتأمينها إلى لوحة الأساس للقفص. متعددة الأغراض الملونة، تم استخدام الشريط التسمية لهذه الخطوة.
3. افصل التدفق عن قسطرة الوريد الذيل وضع مشبك صغير على أنابيب القثطار للوقاية من التدفق الخلفي أثناء توصيل الخط المغرس من المضخة.
4. مرة واحدة متصلة بشكل آمن، وإزالة المشبك وتدفق مع حل فتيلة، والذي يتكون من غرس. تأكد من أن الحل واضح في الأنابيب وليس ملطخة بالدماء.
5. دون وقت بدء التسريب لضمان تشغيله في الوقت الإجمالي الذي يبلغ حوالي 3 ح. إذا تم استخدام أقفاص متعددة في وقت واحد ، فيجب أن تكون متداخلة لإدارة أوقات التسريب بشكل فعال.
6. بمجرد ملاحظة خطوط التسريب لتكون تعمل بشكل صحيح، وإزالة الغطاء من الماوس. وضع الفراش القياسية حول الماوس.
7. بدء التسريب مع أول غرسة تحتوي على التتبع وتشغيله لمدة 3 ساعة بشكل مستمر. لمدة التسريب، والاستمرار في التحقق من رفاهية الفئران، فضلا عن خطوط التسريب. تأكد من أن أنابيب التسريب مؤمنة بشكل صحيح وأنه لا توجد تسربات من نقاط اتصال الخط.

5. أخذ عينات الدم

1. بعد اكتمال التسريب الأول ، أوقف التسريب ، ضع مشبكا على الأنابيب الانسيابية على القسطرة لمنع التدفق الخلفي. إزالة الفئران بلطف من المرفقات دون إزعاج القسطرة من أجل جمع الدم. ضعهم في مكان بالقرب من الأقفاص لسحب الدم. لهذه التجربة ، خضعت الفئران لفينبونكتور الخد باستخدام لانسيت 4 ملم.
2. جمع ~ 75 ميكرولتر من الدم في القارورة المطلوبة. لإلغاء حماية العينات استعدادا لقياس الطيف الكتلي، أضف ما يقرب من 15 ميكرولتر من الدم إلى 500 ميكرولتر من الأسيتون. يمكن استخدام الدم المتبقي للتحقق من مستوى السكر في الدم عن طريق جهاز الجلوكومتر و/ أو الطرد المركزي لفصل البلازما عن فحوصات الهرمونات المستقبلية.

6. ضخ الثانية

1. إزالة الضخات من مضخات الحقنة عن طريق فصل الأنابيب من المحاقن واستبدالها بثاني يحتوي على التتبع جنبا إلى جنب مع الجلوكوز. كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.7 باستخدام ضخ الجلوكوز النظيري الغني بالجلوكوز.
   1. للوصول إلى حالة ثابتة، قم بتشغيل بولوس من غرس الثاني في 600 ميكرولتر / ساعة لمدة 15 دقيقة. لاحظ وقت البدء لكل مجموعة من الأقفاص. خفض معدل التسريب إلى 150 ميكرولتر / ساعة لإكمال 3 ساعة من إجمالي وقت التسريب.
2. كرر الخطوتين 5.1 و 5.2.
3. أوقف مضخة التسريب وأزل قسطرة الوريد الذيل برفق، وممارسة الضغط في مواقع القسطرة حتى يتوقف النزيف، وإعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية.
4. Santize وتطهير الإعداد caging جيدا مع الصابون والماء القياسية.
   ملاحظة: هذا إجراء البقاء على قيد الحياة. يمكن إعادة الفئران إلى الأقفاص والاحتفاظ بها لمزيد من التجهيزات إذا لزم الأمر. ويوصى بعدم إجراء أي عملية إضافية للتكسير لمدة أسبوع على الأقل بعد هذا الإجراء لضمان الرفاه الكافي للحيوانات.

7. قياس الطيف الكتلي

1. أرسل العينات لقياس الطيف الكتلي.
2. تحاليل
   1. قياس الإثراء النظائري للجلوكوز [6,6-2H2] عن طريق قياس خواص الغاز - قياس الطيف الكتلي (GCMS) باستخدام مشتقة ^{الخماسي21,22}. باختصار، تتضمن هذه الطريقة إعداد مشتق بنتاسيتات الجلوكوز، يليه تحليل العينة باستخدام GCMS ^20,22.
3. الحسابات
   1. إجراء جميع القياسات الحركية في ظل ظروف الحالة الثابتة. تم حساب إجمالي معدل ظهور الجلوكوز في البلازما (_{الجلوكوز ريا)} من إثراء M +2 من الجلوكوز [6,6-2H2] في البلازما باستخدام معادلات تخفيف النظائر ^{المنشأة21}. في ظل ظروف الحالة الثابتة ، يفترض أن معدل ظهور الجلوكوز يساوي معدل اختفاء الجلوكوز. معدل إنتاج الجلوكوز الداخلي (ملغم/(kg·min)) (GPR) = _{الجلوكوزيرا -} الجلوكوز الخارجي.

النتائج

باستخدام معادلات تخفيف النظائر الموصوفة سابقا، تم حساب إجمالي معدل الجلوكوز في البلازما (_glucoseRa) من إثراء M+2 من الجلوكوز [6,6-2H2] في ظروف الصيام والجلوكوز الغنية باستخدام مشتقة بنتاسيتات21. في ظل ظروف الحالة الثابتة ، يفترض أن معدل ظهور الجلوكوز يساوي معدل اختفاء...

Discussion

فرط السكر في الدم والتمثيل الغذائي غير طبيعي الجلوكوز / التوازن هي ملامح PCOS. يتم الحفاظ على مستوى السكر في الدم من خلال مزيج من الجلوكوز من النظام الغذائي وإنتاج الجلوكوز عن طريق انحلال الجليكوجين وجلوكونيوجينيسيس و جليكوجينيسيس، تحت سيطرة الهرمونات والإنزيمات. يتم قمع إنتاج الجلوك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion