הערכה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי

Summary

מחקר זה מתאר את המדידה הישירה של ייצור גלוקוז בכבד במודל עכבר תסמונת השחלות הפוציקסטי באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי יציב באמצעות וריד הזנב הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז יחד.

Abstract

תסמונת השחלות הפוליצסטיות (PCOS) היא מחלה נפוצה המביאה להפרעות בחילוף החומרים של גלוקוז, כגון עמידות לאינסולין ואי סבילות לגלוקוז. חילוף החומרים של גלוקוז Dysregulated הוא ביטוי חשוב של המחלה והוא המפתח לפתוגנזה שלה. לכן, מחקרים מעורבים הערכה של חילוף החומרים גלוקוז ב- PCOS הם בעלי חשיבות עליונה. מעט מאוד מחקרים כימתו את ייצור הגלוקוז בכבד ישירות בדגמי PCOS באמצעות מעקבים לא רדיואקטיביים של גלוקוז. במחקר זה, אנו דנים בהוראות שלב אחר שלב לכימות קצב ייצור הגלוקוז בכבד במודל עכבר PCOS על ידי מדידת העשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז, מעקב גלוקוז איזוטופי יציב, באמצעות כרומטוגרפיה של גז - ספקטרומטריית מסה (GCMS). הליך זה כרוך ביצירת פתרון מעקב איזוטופי יציב, שימוש במיקום צנתר וריד הזנב ועירוי של נותב הגלוקוז הן בצום והן במצבים עשירים בגלוקוז באותו עכבר במקביל. ההעשרה של [6,6-2H2]] גלוקוז נמדדת באמצעות נגזרת פנטאצטאט ב- GCMS. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מחקרים מעורבים מדידה ישירה של קצב ייצור הגלוקוז בכבד.

Introduction

תסמונת השחלות הפוציסטיות (PCOS) היא הפרעה נפוצה המתרחשת ב 12%-20% של נשים בגיל ^{הרבייה1,2}. זוהי מחלה מורכבת וכתוצאה מכך פנוטיפים משתנים מעורבים שחלות פוליציסטיות, menses לא סדיר וראיות קליניות או מעבדה של hyperandrogenemia, והוא מאובחן בדרך כלל כאשר אישה עומדת בשניים משלושת ^{הקריטריונים3}. היבט דומיננטי של PCOS, וגורם מפתח בפתוגנזה שלה, הוא דעים מטבוליים שנמצאים אצל נשים שיש להם את המחלה. נשים עם PCOS יש שכיחות גבוהה יותר של תנגודת לאינסולין, אי סבילות לגלוקוז, השמנת יתר, תסמונת מטבולית3,4,5,6. תנגודת לאינסולין היא לא רק ביטוי של המחלה, אבל הוא חשב לתרום פתוגנזה שלה על ידי potentiating הפעולה של הורמון תחליב בשחלה ובכך מוביל ייצור אנדרוגן ^{מוגבר7,8}. תנגודת לאינסולין נחשבת יש מספר מקורות אפשריים אבל מחקרים מראים שזה יכול להיות בגלל דפוסים חריגים של קולטן אינסולין ^{איתות9,10}. מחקרים העריכו עמידות לאינסולין בחולי PCOS באמצעות טכניקת הזהב הסטנדרטית של מלחציים היפראינסולנמיים-אוגליקמיים11,12,13,14,15. לנשים עם PCOS, ללא קשר ל- BMI, יש רמות גבוהות יותר של תנגודת לאינסולין בהשוואה לבקרות. בקרת אינסולין על ייצור גלוקוז נפגעת בהפרעות של תנגודת לאינסולין המובילה לייצור עודף גלוקוז. לדוגמה, חולי סוכרת יש שיעורים מוגברים של gluconeogenesis ודיכוי לקוי של גליקוגנוליזה16. יתר על כן, דיכוי לקוי של ייצור גלוקוז נצפתה בחולדות ^סוכרת17. למרות שמחקרים מהדקים יכולים לתת מדידה של תנגודת לאינסולין, מחקרים מעטים ב- PCOS מתמקדים במדידה ישירה של ייצור גלוקוז במדינות צום ומזון. זה דורש שימוש עירוי מעקב איזוטופי איזוטופי לא רדיואקטיבי ומדידה באמצעות ספקטרומטריית מסה.

דגמים של בעלי חיים שימשו בהרחבה במחקר PCOS. מודלים מוריניים PCOS רזה והשמנת יתר נוצרו על ידי מתן אנדרוגנים לפני ההפלגה, prepubertally, או לאחר ^pubertally18. דגמי PCOS מכרסמים מדגימים גם הבדלים מטבוליים בהשוואה לבקרות שלהם. נתונים קודמים מהמעבדה שלנו הדגימו בדיקות סובלנות גלוקוז חריגות (GTT) בדגמי עכבר PCOS (רזה והשמנת יתר), העולים בקנה אחד עם ספרות PCOS ^{אנושית19}. שימוש במודל בעלי חיים רזה והשמנת יתר מאפשר חקירה נוספת של הבדלים מטבוליים. באופן ספציפי, מודל זה מאפשר הערכה של קצב ייצור הגלוקוז ישירות באמצעות מעקב גלוקוז איזוטופי. אחד ממעקב הגלוקוז האיזוטופי היציב הנפוץ ביותר הוא [6,6-2H2]גלוקוז. ניתן למדוד את העשרת הגלוקוז [^6,6-2H2]באמצעות נגזרת פנטאצטאט כפי שתואר קודם ^לכן20.

במחקר זה, המטרה שלנו הייתה למדוד את קצב ייצור הגלוקוז בכבד בצום ובמצב עשיר בגלוקוז בעכברים PCOS באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי. טכניקות אלה ניתן ליישם על מגוון רחב של ניסויים מעורבים קינטיקה גלוקוז.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה.

1. הכנת [6,6-2H2]גלוקוז

1. יום אחד לפני ההליך, להכין את מאתר גלוקוז איזוטופ יציב מלוחים רגילים. בניסוי זה, [6,6-2H2]גלוקוז שימש כמעקב למדידת קצב הופעת הגלוקוז בפלזמה.
   הערה: בניסוי זה נמדדו ייצור גלוקוז במהלך צום ותנאים עשירים בגלוקוז, ולכן איזוטופ הגלוקוז הוכן בשתי תכשירים שונים. הכן את הפתרונות באופן כזה כי המינון הסופי infusing יהיה קרוב 1 מ"ג /(kg·min) ו 2 מ"ג /(kg·min), בהתאמה. ריכוזים אלה היו אופטימיזציה על ידי מספר מחקרי פיילוט קודמים.
2. הכן את ההטמה הראשונה עם גלוקוז [6,6-2H2] בלבד כמעקב כדי לייצג את מצב הצום על ידי המסת גלוקוז סטרילי ופירוגן [6,6-2H2] בתמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9%.
3. הכן את ההטמה השנייה על ידי המסת שניהם [6,6-2H2]מעקב גלוקוז יחד עם גלוקוז לא איזוטופי (~ 20 מ"ג / קילוגרם) בתמיסת נתרן כלורי סטרילית 0.9% כדי לדמות את מצב המזון.
   הערה: בניסוי הנוכחי, עירוי קצב קבוע ראשוני של [6,6-2H2]גלוקוז ב (~) 1.08 מ"ג /(קג"מ) (מצב צום) ו (~) 1.9 מ"ג/ק"ג (מצב עשיר בגלוקוז) שימש. על מנת לחקות את 'מצב עשיר גלוקוז', שיעור עירוי D-גלוקוז נקבע על (~) 18.8 מ"ג /(kg·min).
4. לאחר הכנת הפתרונות, לסנן את הפתרונות עם מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (50 °F). מחממים את הפתרונות לטמפרטורת החדר לפני העירוי. טען את הפתרונות על מזרקי 1 מ"ל עם תווית מראש.
5. הגדר את המשאבה כדי להקל על עירוי קצב קבוע של אינפוזאט הראשון (עבור מצב בסיסי) המכיל רק את המעקב, ולתכנת את המשאבה עבור עירוי קצב קבוע של איזוטופ ב 150 μL / שעה עבור 3 שעות.
6. בסוף צום 3 שעות להגדיר, להחליף את המזרק הראשון infusate עם מזרק אינפוזיט השני המכיל את המעקב האיזוטופי D-גלוקוז (עבור מצב הפד מדומה), וראש עירוי עבור 15 דקות intial ב 600 μL / שעה. הגדר את המשאבה לעירוי קצב קבוע ב 150 μL / שעה עבור 3 שעות נוספות.

2. הקמת ניסויי עירוי

1. מוציאים את העכברים מכלובי הבית שלהם ומניחים אותם בכלובי הצום שלהם 3 שעות לפני תחילת הניסוי. לניסוי זה נעשה שימוש בעכברות בנות 4 חודשים מזן C57BL/6J.
   הערה: הליך זה אינו דורש כל שךך לפני או במהלך ההליך בהתחשב באופיו הפלגני המינימלי.
2. להרכיב את ציוד caging על ידי קיבוץ העכברים למספר מוגדר של עכברים לכל משאבת אינסולין. מניחים מחיצות על בסיס שטוח ויציב כדי ליצור דוכנים בודדים לעכברים. חשוב שתהיה גישה לקטטר הווריד הזנב עבור עירוי לרוץ, כדי להבטיח כי יש חריץ בתחתית דלת הכלוב.
   הערה: כלובים המוצגים בסרטון נעשו במיוחד עבור ניסוי זה. הכלובים נקיים ועשויים מפלקסיגלס. יש בסיס שטוח ויציב (ציוד קליט סטנדרטי) שעליו יושבות המחיצות. התקנה זו מורכבת ממספר חלקים כדי לאפשר קלות התקנה במספר סביבות שונות בהתאם לגובה הטבלה ולצרכים של הנסיין. הדלת לכלוב מחליקה להיסגר ויש לה חריץ בתחתית כדי לאפשר לזנב להיכנס.
3. להרכיב את מזרקי 1 מ"ל המכילים 1 מ"ל של אינפוסאט בזאלי, ולאחר מכן להתחבר צינורות משאבת עירוי באמצעות צינורות פוליאתילן 0.28 מ"מ מזהה x 0.61 מ"מ.
4. הכן את משאבת עירוי על ידי הגדרת הקצב ל 150 μL / שעה, שהוא שיעור בזאלי.
5. מחממים אמבט מים ל 48 °C (70 °F).
6. הכן את תחנת החדרת הצנתר הסמוכה לאמבט המים המכיל את המחטים בגודל 30 G 0.5 אינץ', מזהה 0.3 מ"מ x 0.64 מ"מ צינורות סילאסטיים, וסרט טרנספורי ברור בגודל 1 אינץ'.
7. לאחר 3 שעות של צום, להתחיל את תהליך החדרת קטטר, אשר מפורט להלן.

3. החדרת קטטר

1. בחר עכבר אחד והצב אותו במחזיק מאובטח עם גישה לזנב. דוגמה של מה להשתמש הוא בקבוק לחתוך לשניים עם חריץ לזנב. מניחים את המחזיק על בסיס שטוח. מניחים סרט הדבקה על החלק הפרוקסימלי של הזנב כדי לאפשר מקום להכנסת קטטר בצורה מרוקנת יותר.
   הערה: סוג הקלטת שנבחרה עבור משימה זו חייב להיות כוח ודבק מתונים. בניסוי זה נעשה שימוש בסרט תיוג רב תכליתי ומבוסס נייר, שכן היא קלה וקלה לקלף אותה.
2. הכן את הקטטר (מחט 30 G מחובר צינורות סילאסטיים 0.3 מ"מ ו PE- 10 היו מעוקרים גז) על ידי חיבורו מזרק 1 מ"ל המכיל סומק מלוח סטרילי. לשטוף את הקטטר בעדינות.
3. להביא את העכבר לאמבט המים ולהכניס את הזנב באמבט המים במשך כ 30-45 s. זה עוזר להרחיב את כלי הזנב עבור מיקום קטטר.
4. בצע את החדרת הצנתר בתנאים סטריליים. לאחר שהזנב מתחמם, נקו את הזנב עם מגבוני בנזלקוניום והנחו מהדק תנין קטן וחסר שיניים, שהיה מקודם בעבר לצורת הזנב, כחוסם עורקים בקצה הפרוקסימלי של הזנב. דמיינו את וריד הזנב לרוחב מתחת לזכוכית מגדלת, ואז מכניסים בזהירות את הקטטר לווריד הזנב ונסוגים את המחט. יש לשטוף את הפתרון בעדינות כדי להבטיח טפיחה של הקטטר.
5. עטפו חתיכה של סרט טרנספורי בגודל 1 אינץ' סביב אתר הכניסה כדי לאבטח את הצנתר. הסר את חוסם העורקים הקטן מהזנב.

4. הגדרת עירוי וחליטה ראשונה

1. מניחים את העכבר בכלוב הבודד שלו וסוגרים את דלת ההזזה, ומבטיחים שהזנב בולט דרך החריץ ונשאר מחוץ לכלוב.
2. מניחים פיסת סרט נוספת על כל הקטטר והזנב כדי לאבטח אותו ללוח הבסיס של הכלוב. עבור שלב זה, סרט צבעוני מרובה תכליתים.
3. נתק את הסומק מצנתר הוורידים של הזנב והניח מהדק קטן על הצינורות הסילאסטיים של הצנתר כדי למנוע זרימה אחורית תוך חיבור קו החדירה מהמשאבה.
4. לאחר חיבור מאובטח, להסיר את המהדק לשטוף עם פתרון priming, אשר מורכב infusate. ודא כי הפתרון ברור צינורות ולא מוכתם בדם.
5. שים לב לזמן החניכה של עירוי כדי להבטיח כי הוא פועל לזמן הכולל של כ 3 שעות. אם כלובים מרובים משמשים בו זמנית, הם צריכים להיות מתנדנדים לנהל זמני עירוי ביעילות.
6. לאחר קווי עירוי הם ציינו לתפקד כראוי, להסיר את הכיסוי מן העכבר. מקם מצעים סטנדרטיים סביב העכבר.
7. התחל את עירוי עם אינפוזיט הראשון המכיל את המעקב ולהפעיל אותו במשך 3 שעות ברציפות. למשך העירוי, להמשיך לבדוק את רווחת העכברים, כמו גם קווי עירוי. ודא כי צינורות עירוי מאובטח כראוי וכי אין דליפות מנקודות החיבור הקו.

5. דגימת דם

1. לאחר העירוי הראשון הושלם, להפסיק את עירוי, מניחים מלחציים על צינורות sylastic על הקטטר כדי למנוע את זרימת הגב. מוציאים בעדינות את העכברים מהמתחמים שלהם מבלי להפריע לצנתר כדי לאסוף דם. הנח אותם במקום ליד הכלובים להוצאת דם. לניסוי זה, העכברים עברו ווניפונקטור לחי באמצעות 4 מ"מ lancet.
2. לאסוף ~ 75 μL של דם בוויאלי הרצוי. כדי deproteinize דגימות כהכנה ספקטרומטריית מסה, להוסיף כ 15 μL של דם כדי 500 μL של אצטון. הדם הנותר יכול לשמש כדי לבדוק את רמת הגלוקוז בדם באמצעות glucometer ו/או צנטריפוגה כדי להפריד פלזמה לבדיקות הורמון בעתיד.

6. עירוי שני

1. הסר את infusates מן משאבות המזרק על ידי ניתוק הצינורות מן המזרקים ולהחליף אותו עם infusate השני המכיל את המעקב יחד עם גלוקוז. חזור על שלבים 4.2 עד 4.7 באמצעות עירוי גלוקוז איזוטופי עשיר גלוקוז.
   1. כדי להגיע למצב יציב, להפעיל בולוס של אינפוזיט השני ב 600 μL / שעה במשך 15 דקות. שים לב לזמן ההתחלה עבור כל קבוצה של כלובים. להקטין את קצב עירוי ל 150 μL / שעה כדי להשלים את 3 שעות של זמן עירוי הכולל.
2. חזור על שלבים 5.1 ו- 5.2.
3. עצרו את משאבת העירוי והסירו בעדינות את צנתר וריד הזנב, החל לחץ באתרי הצנתר עד שהדימום ייפסק, והחזירו עכברים לכלובים הביתיים שלהם.
4. יש להקפיד ולחטא את מערך ההזדקנות ביסודיות עם סבון ומים סטנדרטיים.
   הערה: זהו הליך הישרדות. עכברים ניתן להחזיר לכלובים ושמר על experiements נוספים במידת הצורך. מומלץ כי לא יבוצע הסברה נוספת למשך שבוע לפחות לאחר הליך זה כדי להבטיח רווחת בעלי חיים נאותה.

7. ספקטרומטריית מסה

1. שלח את הדגימות לספקטרומטריית מסה.
2. ניתוחים
   1. מדוד את ההעשרה האיזוטופית של [6,6-2H2]] גלוקוז על ידי גסכרומטוגרפיה - ספקטרומטריית מסה (GCMS) באמצעות נגזרת המחומש21,22. בקצרה, שיטה זו כרוכה בהכנת נגזרת המחומש של גלוקוז, ואחריה ניתוח מדגם באמצעות GCMS ^20,22.
3. חישובים
   1. בצע את כל המדידות הקינטיות בתנאי מצב יציבים. קצב הופעת הגלוקוז הכולל של _{פלזמה (גלוקוז Ra}) חושב מהעשרת M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בפלזמה באמצעות משוואות דילול איזוטופים ^{מבוססות21}. בתנאי מצב יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. קצב ייצור הגלוקוז האדוגוגני (מ"ג/קג"מ)) (GPR) = _{גלוקוז - גלוקוז} אקסוגני.

תוצאות

באמצעות משוואות דילול איזוטופ שתוארו בעבר, שיעור הגלוקוז הכולל _{בפלזמה (גלוקוזRa}) חושב מהעשרה M+2 של [6,6-2H2]גלוקוז בתנאי צום וגלוקוז עשירים בגלוקוז באמצעות נגזרת המחומש21. בתנאים יציבים, ההנחה היא כי שיעור המראה של גלוקוז שווה לקצב היעלמות הגלוקוז. בקבוצת הביקורת,...

Discussion

היפרגליקמיה ומטבוליזם גלוקוז חריג/הומאוסטזיס הם תכונות של PCOS. רמת הגלוקוז בדם נשמרת על ידי שילוב של גלוקוז מתזונה וייצור גלוקוז באמצעות גליקוגנוליזה וגלוקונוגנזה וגליקוגנזה, בשליטת הורמון ואנזימים. ייצור גלוקוז בכבד מדוכא על ידי נוכחות של רמות גלוקוז במחזור מוגבר. בהפרעות של חילוף ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion