Valutazione della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico

Riepilogo

Questo studio descrive la misurazione diretta della produzione epatica di glucosio in un modello murino di sindrome dell'ovaio policistico utilizzando un tracciante di glucosio isotopico stabile attraverso la vena della coda sia a digiuno che in stati ricchi di glucosio in tandem.

Abstract

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che provoca disturbi del metabolismo del glucosio, come l'insulino-resistenza e l'intolleranza al glucosio. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della malattia ed è la chiave della sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza. Pochissimi studi hanno quantificato la produzione di glucosio epatico direttamente in modelli PCOS utilizzando traccianti di glucosio non radioattivi. In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M + 2 di [6,6-2H2] glucosio, un tracciante isotopico stabile del glucosio, tramite gascromatografia - spettrometria di massa (GCMS). Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. L'arricchimento del glucosio [_6,6-2H2] viene misurato utilizzando il derivato del pentaacetato in GCMS. Questa tecnica può essere applicata a un'ampia varietà di studi che coinvolgono la misurazione diretta del tasso di produzione epatica di glucosio.

Introduzione

La sindrome dell'ovaio policistico (PCOS) è una malattia comune che si verifica nel 12%-20% delle donne in età ^{riproduttiva1,2}. È una malattia complessa che provoca fenotipi variabili che coinvolgono ovaie policistiche, mestruazioni irregolari e prove cliniche o di laboratorio di iperandrogenemia, e viene tipicamente diagnosticata quando una donna soddisfa due dei tre ^criteri3. Un aspetto predominante della PCOS, e un fattore chiave nella sua patogenesi, sono gli squilibri metabolici che si trovano nelle donne che hanno la malattia. Le donne con PCOS hanno una maggiore incidenza di insulino-resistenza, intolleranza al glucosio, obesità e sindrome ^{metabolica3,4,5,6}. La resistenza all'insulina non è solo una manifestazione della malattia, ma si pensa che contribuisca alla sua patogenesi potenziando l'azione dell'ormone luteinizzante nell'ovaio portando così ad un aumento della produzione di ^androgeni7,8. Si ritiene che la resistenza all'insulina abbia diverse possibili origini, ma gli studi suggeriscono che potrebbe essere dovuta a modelli anormali di segnalazione del recettore dell'insulina9,10. Gli studi hanno valutato la resistenza all'insulina nei pazienti con PCOS utilizzando la tecnica gold standard del morsetto iperinsulinemico-euglicemico11,12,13,14,15. Le donne con PCOS, indipendentemente dal BMI, hanno livelli più elevati di insulino-resistenza rispetto ai controlli. Il controllo dell'insulina sulla produzione di glucosio è compromesso nei disturbi della resistenza all'insulina che portano alla produzione eccessiva di glucosio. Ad esempio, i pazienti diabetici hanno un aumento dei tassi di gluconeogenesi e una ridotta soppressione della glicogenolisi16. Inoltre, è stata osservata una ridotta soppressione della produzione di glucosio nei ratti ^diabetici17. Sebbene gli studi sui morsetti possano fornire una misurazione della resistenza all'insulina, pochi studi sulla PCOS si concentrano sulla misurazione diretta della produzione di glucosio negli stati di digiuno e alimentazione. Ciò richiede l'uso di un'infusione di traccianti di glucosio isotopico non radioattivo e la misurazione tramite spettrometria di massa.

I modelli animali sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sulla PCOS. Sia i modelli murini di PCOS magri che quelli obesi sono stati creati somministrando androgeni prenatale, prepubertale o post-puberale18. I modelli di PCOS dei roditori dimostrano anche differenze metaboliche rispetto ai rispettivi controlli. Dati precedenti del nostro laboratorio hanno dimostrato test di tolleranza al glucosio anormali (GTT) in modelli murini PCOS (magri e obesi), coerenti con la letteratura PCOS ^umana19. L'uso di un modello animale magro e obeso consente ulteriori indagini sulle differenze metaboliche. Nello specifico, questo modello consente di valutare il tasso di produzione di glucosio direttamente utilizzando traccianti isotopici del glucosio. Uno dei traccianti isotopici del glucosio stabile più comunemente usato è il glucosio [_6,6-2H2]. L'arricchimento del glucosio [_6,6-2H2] può essere misurato utilizzando un derivato del pentaacetato come descritto in ^precedenza20.

In questo studio, il nostro obiettivo era misurare il tasso di produzione di glucosio epatico a digiuno e allo stato ricco di glucosio nei topi PCOS utilizzando l'infusione isotopica di glucosio. Queste tecniche possono essere applicate a una vasta gamma di esperimenti che coinvolgono la cinetica del glucosio.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.

1. Preparazione di [6,6-2H2]glucosio

1. Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale. Per questo esperimento, il glucosio [6,6-2H2] è stato usato come tracciante per misurare il tasso di comparsa del glucosio plasmatico.
   NOTA: In questo esperimento, è stata misurata la produzione di glucosio durante il digiuno e le condizioni ricche di glucosio, quindi l'isotopo del glucosio è stato preparato in due diversi preparati. Preparare le soluzioni in modo tale che la dose finale di infusione sia vicina rispettivamente a 1 mg/(kg·min) e 2 mg/(kg·min). Queste concentrazioni sono state ottimizzate da diversi studi pilota precedenti.
2. Preparare il primo infuso con solo [6,6-2H2]glucosio come tracciante per rappresentare la condizione di digiuno sciogliendo glucosio sterile e privo di pirogeni [6,6-2H2] in soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9%.
3. Preparare il secondo infuso sciogliendo sia il tracciante di glucosio [6,6-2H2] che il glucosio non isotopico (~ 20 mg / kg·min) in una soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% per simulare la condizione alimentata.
   NOTA: Nel presente esperimento, è stata utilizzata un'infusione a velocità costante innescata di [_6,6-2H2]glucosio a (~) 1,08 mg/(kg·min) (condizione di digiuno) e (~) 1,9 mg/kg·min (condizione ricca di glucosio). Al fine di imitare la "condizione ricca di glucosio", la velocità di infusione di D-glucosio è stata fissata a (~) 18,8 mg/(kg·min).
4. Una volta preparate le soluzioni, filtrare sterili le soluzioni con un filtro da 0,22 μm e conservare a 4 °C. Riscaldare le soluzioni a temperatura ambiente prima dell'infusione. Caricare le soluzioni su siringhe preetichettate da 1 mL.
5. Impostare la pompa per facilitare un'infusione a velocità costante innescata del primo infusato (per condizioni basali) contenente solo il tracciante e programmare la pompa per un'infusione a velocità costante dell'isotopo a 150 μL/h per 3 ore.
6. Al termine dell'impostazione del digiuno di 3 ore, sostituire la prima siringa infusata con la seconda siringa infuso contenente il tracciante isotopico e D-glucosio (per lo stato di alimentazione simulato) e innescare l'infusione per l'iniziale 15 min a 600 μL/h. Impostare la pompa su un'infusione a velocità costante a 150 μL/h per le ulteriori 3 ore.

2. Impostazione degli esperimenti di infusione

1. Rimuovi i topi dalle loro gabbie domestiche e mettili nelle loro gabbie di digiuno 3 ore prima dell'inizio dell'esperimento. Per questo esperimento, è stata utilizzata una topa femmina di 4 mesi del ceppo C57BL / 6J.
   NOTA: Questa procedura non richiede alcuna analgesia prima o durante la procedura data la sua natura minimamente invasiva.
2. Assemblare l'attrezzatura di ingabbiamento raggruppando i topi in un determinato numero di topi per pompa di insulina. Posiziona le partizioni sopra una base piatta e stabile per creare stalli individuali per i topi. È importante avere accesso al catetere della vena della coda per far funzionare l'infusione, quindi assicurarsi che ci sia una tacca nella parte inferiore della porta della gabbia.
   NOTA: Le gabbie mostrate nel video sono state realizzate appositamente per questo esperimento. Le gabbie sono chiare e realizzate in plexiglass. C'è una base piatta e stabile (attrezzatura di ingabbiamento standard) su cui si trovano le partizioni. Questa configurazione è composta da diversi pezzi per consentire una facile installazione in diversi ambienti a seconda dell'altezza del tavolo e delle esigenze dello sperimentatore. La porta della gabbia scorre per chiudersi e ha una tacca nella parte inferiore per consentire alla coda di passare.
3. Assemblare le siringhe da 1 mL contenenti 1 mL di infusato basale, quindi collegarle al tubo della pompa di infusione utilizzando il tubo di polietilene 0,28 mm ID x 0,61 mm.
4. Preparare la pompa per infusione impostando la velocità su 150 μL/h, che è la velocità basale.
5. Riscaldare un bagno d'acqua a 48 °C.
6. Preparare la stazione di inserimento del catetere adiacente al bagno d'acqua contenente gli aghi da 30 G da 0,5 pollici, il tubo silastico ID da 0,3 mm x 0,64 mm e il nastro trasparente da 1 pollice.
7. Dopo 3 ore di digiuno, iniziare il processo di inserimento del catetere, che è dettagliato di seguito.

3. Inserimento del catetere

1. Selezionare un mouse e posizionarlo in un supporto sicuro con accesso alla coda. Un esempio di cosa usare è una bottiglia tagliata a metà con una tacca per la coda. Posizionare il supporto su una base piatta. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sulla porzione prossimale della coda per consentire lo spazio per l'inserimento del catetere in modo più distale.
   NOTA: il tipo di nastro scelto per questa attività deve avere una resistenza e un'adesività moderate. In questo esperimento è stato utilizzato un nastro di etichettatura multiuso a base di carta in quanto è delicato e facile da staccare.
2. Preparare il catetere (ago da 30 G attaccato a un tubo silastico da 0,3 mm e PE-10 sterilizzato a gas) attaccandolo a una siringa da 1 mL contenente lavaggio salino eparinizzato sterile. Lavare delicatamente il catetere.
3. Portare il mouse a bagnomaria e inserire la coda nel bagno d'acqua per circa 30-45 s. Questo aiuta a dilatare la vascolarizzazione della coda per il posizionamento del catetere.
4. Eseguire l'inserimento del catetere in condizioni sterili. Una volta riscaldata la coda, pulire la coda con salviette benzalconio e posizionare un piccolo morsetto di alligatore rame e sdentato, che in precedenza era sagomato a forma di coda, come un laccio emostatico all'estremità prossimale della coda. Visualizzare la vena laterale della coda sotto una lente d'ingrandimento, quindi inserire con attenzione il catetere nella vena della coda e prelevare l'ago. Lavare delicatamente la soluzione per garantire la pervietà del catetere.
5. Avvolgere un pezzo di nastro transporo da 1 pollice attorno al sito di inserimento per fissare il catetere. Rimuovere il piccolo laccio emostatico dalla coda.

4. Impostazione dell'infusione e prima infusione

1. Posiziona il mouse nella sua gabbia individuale e chiudi la porta scorrevole, assicurandoti che la coda sporga attraverso la tacca e rimanga all'esterno della gabbia.
2. Posizionare un ulteriore pezzo di nastro adesivo su tutto il catetere e la coda per fissarlo alla piastra di base della gabbia. Per questo passaggio è stato utilizzato un nastro per etichette colorato multiuso.
3. Scollegare il filo dal catetere della vena di coda e posizionare un piccolo morsetto sul tubo silastico del catetere per evitare il riflusso mentre si collega la linea di infusione dalla pompa.
4. Una volta fissato saldamente, rimuovere il morsetto e sciacquare con la soluzione di adescamento, che consiste nell'infuso. Assicurarsi che la soluzione sia limpida nel tubo e non macchiata di sangue.
5. Prendere nota del tempo di inizio dell'infusione per assicurarsi che funzioni per il tempo totale di circa 3 ore. Se vengono utilizzate più gabbie contemporaneamente, devono essere sfalsate per gestire efficacemente i tempi di infusione.
6. Una volta che le linee di infusione sono notate per funzionare correttamente, rimuovere il coperchio dal mouse. Posiziona la biancheria da letto standard attorno al mouse.
7. Iniziare l'infusione con il primo infuso contenente il tracciante ed eseguirlo per 3 ore ininterrottamente. Per tutta la durata dell'infusione, continuare a controllare il benessere dei topi e le linee di infusione. Assicurarsi che il tubo di infusione sia fissato correttamente e che non vi siano perdite dai punti di connessione della linea.

5. Prelievo di sangue

1. Al termine della prima infusione, interrompere l'infusione, posizionare un morsetto sul tubo silastico sul catetere per impedire il riflusso. Rimuovere delicatamente i topi dai loro recinti senza disturbare il catetere per raccogliere il sangue. Posizionali in un punto vicino alle gabbie per il prelievo di sangue. Per questo esperimento, i topi sono stati sottoposti a venipuntura della guancia usando una lancetta da 4 mm.
2. Raccogliere ~75 μL di sangue nel flaconcino desiderato. Per deproteinizzare i campioni in preparazione per la spettrometria di massa, aggiungere circa 15 μL di sangue a 500 μL di acetone. Il sangue rimanente può essere utilizzato per controllare il livello di glucosio nel sangue tramite il glucometro e / o centrifugato per separare il plasma per futuri saggi ormonali.

6. Seconda infusione

1. Rimuovere gli infusi dalle pompe della siringa scollegando il tubo dalle siringhe e sostituirlo con il secondo infusato contenente il tracciante insieme al glucosio. Ripetere i passaggi da 4,2 a 4,7 utilizzando l'infusione isotopica di glucosio ricca di glucosio.
   1. Per raggiungere uno stato stazionario, eseguire un bolo del secondo infuso a 600 μL/h per 15 min. Nota l'ora di inizio per ogni gruppo di gabbie. Ridurre la velocità di infusione a 150 μL/h per completare le 3 ore di tempo totale di infusione.
2. Ripetere i passaggi 5.1 e 5.2.
3. Arrestare la pompa di infusione e rimuovere delicatamente il catetere della vena di coda, applicare pressione sui siti del catetere fino a quando l'emorragia si ferma e riportare i topi alle loro gabbie domestiche.
4. Santizzare e disinfettare accuratamente la configurazione di ingabbiamento con acqua e sapone standard.
   NOTA: Questa è una procedura di sopravvivenza. I topi possono essere restituiti alle gabbie e tenuti per ulteriori esperienze, se necessario. Si raccomanda di non eseguire ulteriori esperienze per almeno una settimana dopo questa procedura per garantire un adeguato benessere degli animali.

7. Spettrometria di massa

1. Inviare i campioni per la spettrometria di massa.
2. Analisi
   1. Misurare l'arricchimento isotopico del glucosio [6,6-2H2] mediante gascromatografia - spettrometria di massa (GCMS) utilizzando il derivato pentaacetato21,22. In breve, questo metodo prevede la preparazione del derivato pentaacetato del glucosio, seguita da analisi del campione utilizzando GCMS ^20,22.
3. Calcoli
   1. Eseguire tutte le misurazioni cinetiche in condizioni di stato stazionario. Il tasso di comparsa totale del glucosio plasmatico (glucosio _Ra) è stato calcolato dall'arricchimento M+2 del [6,6-2H2]glucosio nel plasma utilizzando equazioni di diluizione isotopica ^stabilite21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Tasso di produzione di glucosio endogeno (mg/(kg·min)) (GPR) = _glucosioRa - glucosio esogeno.

Risultati

Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, il tasso di glucosio plasmatico totale (_glucoseRa) è stato calcolato dall'arricchimento M+2 di [6,6-2H2]glucosio in condizioni di digiuno e ricche di glucosio utilizzando il derivato pentaacetato21. In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Nel gruppo di controllo, il glugerba _totale è stato ...

Discussione

L'iperglicemia e il metabolismo anormale del glucosio / omeostasi sono caratteristiche della PCOS. Il livello di glucosio nel sangue è mantenuto da una combinazione di glucosio dalla dieta e produzione di glucosio attraverso la glicogenolisi e la gluconeogenesi e la glicogenesi, sotto il controllo di ormoni ed enzimi. La produzione epatica di glucosio è soppressa dalla presenza di un aumento dei livelli di glucosio circolante. Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppression...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion