Оценка производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников

Резюме

Это исследование описывает прямое измерение производства глюкозы в печени в мышиной модели синдрома поликистозных яичников с использованием стабильного изотопного индикатора глюкозы через хвостовую вену как натощак, так и в богатых глюкозой состояниях в тандеме.

Аннотация

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным заболеванием, которое приводит к нарушениям метаболизма глюкозы, таким как резистентность к инсулину и непереносимость глюкозы. Дисрегулируемый метаболизм глюкозы является важным проявлением заболевания и является залогом его патогенеза. Поэтому исследования, включающие оценку метаболизма глюкозы при СПКЯ, имеют первостепенное значение. Очень немногие исследования количественно оценивали производство глюкозы в печени непосредственно в моделях СПКЯ с использованием нерадиоактивных индикаторов глюкозы. В этом исследовании мы обсудим пошаговые инструкции по количественной оценке скорости производства глюкозы в печени в мышиной модели СПКЯ путем измерения обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозы, стабильного изотопного индикатора глюкозы, с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии (GCMS). Эта процедура включает в себя создание стабильного изотопного раствора индикатора глюкозы, использование катетера хвостовой вены и инфузию индикатора глюкозы как в состоянии натощак, так и в состояниях, богатых глюкозой, у одной и той же мыши в тандеме. Обогащение [6,6-2H2]глюкозы измеряют с использованием производного пентаацетата в GCMS. Этот метод может быть применен к широкому спектру исследований, включающих прямое измерение скорости производства глюкозы в печени.

Введение

Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) является распространенным расстройством, встречающимся у 12%-20% женщин репродуктивного ^{возраста1,2}. Это сложное заболевание, приводящее к переменным фенотипам, включающим поликистоз яичников, нерегулярные менструации и клинические или лабораторные доказательства гиперандрогении, и обычно диагностируется, когда женщина соответствует двум из трех ^{критериев3}. Преобладающим аспектом СПКЯ и ключевым фактором его патогенеза являются метаболические нарушения, которые обнаруживаются у женщин, страдающих этим заболеванием. Женщины с СПКЯ имеют более высокие показатели резистентности к инсулину, непереносимости глюкозы, ожирения и метаболического ^{синдрома3,4,5,6}. Инсулинорезистентность является не только проявлением заболевания, но и, как полагают, способствует его патогенезу, потенцируя действие лютеинизирующего гормона в яичнике, что приводит к увеличению выработки ^{андрогенов7,8}. Считается, что резистентность к инсулину имеет несколько возможных истоков, но исследования показывают, что это может быть связано с аномальными паттернами передачи сигналов рецепторов ^{инсулина9,10}. Исследования оценивали резистентность к инсулину у пациентов с СПКЯ с использованием метода золотого стандарта гиперинсулинемико-эугликемического зажима11,12,13,14,15. Женщины с СПКЯ, независимо от ИМТ, имеют более высокие уровни резистентности к инсулину по сравнению с контрольной группой. Инсулиновый контроль над выработкой глюкозы нарушается при нарушениях инсулинорезистентности, приводящих к избыточной выработке глюкозы. Например, у больных сахарным диабетом повышены показатели глюконеогенеза и нарушено подавление гликогенолиза16. Кроме того, нарушение подавления выработки глюкозы наблюдалось у крыс с ^{диабетом17}. Хотя исследования зажима могут дать измерение резистентности к инсулину, немногие исследования при СПКЯ сосредоточены на прямом измерении производства глюкозы в состоянии голодания и кормления. Это требует использования нерадиоактивного изотопного индикатора глюкозы и инфузии и измерения с помощью масс-спектрометрии.

Животные модели широко используются в исследованиях СПКЯ. Как худые, так и тучные модели СПКЯ были созданы путем введения андрогенов пренатально, препубертально или ^{постпубертально18}. Модели Грызунов СПКЯ также демонстрируют метаболические различия по сравнению с их соответствующими контрольными группами. Предыдущие данные из нашей лаборатории продемонстрировали аномальные тесты на толерантность к глюкозе (ГТТ) в моделях мышей с СПКЯ (худые и тучные), что согласуется с литературой по СПКЯ ^{человека19}. Использование модели бережливого и тучного животного позволяет дополнительно исследовать метаболические различия. В частности, эта модель позволяет оценить скорость производства глюкозы непосредственно с использованием изотопных индикаторов глюкозы. Одним из наиболее часто используемых стабильных изотопных индикаторов глюкозы является [6,6-2H2]глюкоза. Обогащение [6,6-2H2] глюкозой может быть измерено с использованием производного пентаацетата, как описано ^ранее20.

В этом исследовании наша цель состояла в том, чтобы измерить скорость производства глюкозы в печени при голодании и богатом глюкозой состоянии у мышей с СПКЯ с использованием изотопной инфузии глюкозы. Эти методы могут быть применены к широкому спектру экспериментов, связанных с кинетикой глюкозы.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинского колледжа Бейлора.

1. Получение [6,6-2H2] глюкозы

1. За день до процедуры приготовьте индикатор стабильного изотопа глюкозы в обычном физиологическом растворе. Для этого эксперимента [6,6-2H2] глюкоза использовалась в качестве индикатора для измерения скорости появления глюкозы в плазме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте измеряли выработку глюкозы во время голодания и условия, богатые глюкозой, поэтому изотоп глюкозы готовили в двух разных препаратах. Готовят растворы таким образом, чтобы конечная инфузионная доза была близка к 1 мг/(кг·мин) и 2 мг/(кг·мин) соответственно. Эти концентрации были оптимизированы несколькими предыдущими пилотными исследованиями.
2. Готовят первый инфусат только с [6,6-2H2]глюкозой в качестве индикатора, чтобы представить состояние голодания, растворяя стерильную и свободную от пирогена [6,6-2H2]глюкозу в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида.
3. Готовят второй инфусат, растворяя оба [6,6-2H2]индикатора глюкозы вместе с неизотопной глюкозой (~20 мг/кг·мин) в стерильном 0,9% растворе хлорида натрия для имитации исходного состояния.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем эксперименте использовалась загрунтованная постоянная скорость инфузии [6,6-2H2] глюкозы при (~) 1,08 мг/(кг·мин) (состояние натощак) и (~) 1,9 мг/кг·мин (состояние, богатое глюкозой). Чтобы имитировать «состояние, богатое глюкозой», скорость инфузии D-глюкозы была установлена на уровне (~) 18,8 мг / (кг · мин).
4. После приготовления растворов стерильно фильтруют растворы фильтром 0,22 мкм и хранят при 4 °C. Прогрейте растворы до комнатной температуры перед инфузией. Загрузите растворы на предварительно маркированные шприцы объемом 1 мл.
5. Настройте насос для облегчения загрунтованной постоянной скорости инфузии первого инфузии (для базального состояния), содержащего только индикатор, и запрограммируйте насос для постоянной скорости инфузии изотопа при 150 мкл/ч в течение 3 ч.
6. В конце 3-часового голодания заменить первый инфузионный шприц вторым инфузионным шприцем, содержащим изотопный индикатор и D-глюкозу (для моделируемого состояния кормления), и загрунтовать инфузию на интиальный 15 мин со скоростью 600 мкл/ч. Установите насос на постоянную скорость инфузии при 150 мкл/ч в течение дополнительных 3 ч.

2. Постановка инфузионных экспериментов

1. Выньте мышей из их домашних клеток и поместите их в клетки для голодания за 3 часа до начала эксперимента. Для этого эксперимента была использована 4-месячная самка мышей из штамма C57BL/6J.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура не требует анестезии до или во время процедуры, учитывая ее минимально инвазивный характер.
2. Соберите оборудование для клетки, сгруппировав мышей в определенное количество мышей на инсулиновую помпу. Поместите перегородки поверх плоского, стабильного основания, чтобы сделать отдельные стойла для мышей. Важно иметь доступ к катетеру хвостовой вены для проведения инфузии, поэтому убедитесь, что в нижней части дверцы клетки есть выемка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, показанные на видео, были сделаны специально для этого эксперимента. Клетки прозрачные и сделаны из оргстекла. Имеется плоское, стабильное основание (стандартное цеховое оборудование), на котором сидят перегородки. Эта установка состоит из нескольких частей, чтобы упростить настройку в нескольких различных средах в зависимости от высоты стола и потребностей экспериментатора. Дверь в клетку скользит, чтобы закрыться, и имеет выемку внизу, чтобы позволить хвосту пройти.
3. Соберите шприцы объемом 1 мл, содержащие 1 мл базального инфузизата, а затем подключите к трубке инфузионного насоса с помощью полиэтиленовой трубки 0,28 мм ID x 0,61 мм.
4. Подготовьте инфузионный насос, установив скорость до 150 мкл/ч, что является базальной скоростью.
5. Нагрейте водяную баню до 48 °C.
6. Подготовьте станцию введения катетера, прилегающую к водяной бане, содержащую 30 G 0,5-дюймовых игл, 0,3 мм ID x 0,64 мм силастическую трубку и 1-дюймовую прозрачную транспорную ленту.
7. После 3 ч голодания начинают процесс введения катетера, который подробно описан ниже.

3. Установка катетера

1. Выберите одну мышь и поместите ее в защищенный держатель с доступом к хвосту. Примером того, что использовать, является бутылка, разрезанная пополам с выемкой для хвоста. Поместите держатель на плоское основание. Поместите кусочную ленту на проксимальную часть хвоста, чтобы освободить место для введения катетера более дистально.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип ленты, выбранный для этой задачи, должен иметь умеренную прочность и адгезионность. В этом эксперименте была использована многоцелевая бумажная этикетировочная лента, так как она мягкая и легко отслаивается.
2. Подготовьте катетер (иглу 30 г, прикрепленную к 0,3 мм силастической трубке, и PE-10 стерилизовали газом), прикрепив его к шприцу объемом 1 мл, состерильным гепаринизированным физиологическим раствором. Аккуратно промыть катетер.
3. Подведите мышь к водяной бане и вставьте хвост на водяную баню примерно на 30-45 с. Это помогает расширить сосудистую систему хвоста для установки катетера.
4. Выполните установку катетера в стерильных условиях. Как только хвост прогреется, очистите хвост бензалконием и поместите небольшой медный, беззубый зажим аллигатора, который ранее был контурирован по форме хвоста, в виде жгута на проксимальном конце хвоста. Визуализируйте боковую хвостовую вену под увеличительным стеклом, а затем осторожно вставьте катетер в хвостовую вену и выведите иглу. Осторожно промойте раствор, чтобы обеспечить проходимость катетера.
5. Оберните кусок 1-дюймовой транспорной ленты вокруг места введения, чтобы закрепить катетер. Снимите небольшой жгут с хвоста.

4. Инфузионная установка и первая инфузия

1. Поместите мышь в ее индивидуальную клетку и закройте раздвижную дверь, убедившись, что хвост выступает через выемку и остается за пределами клетки.
2. Поместите дополнительный кусок ленты на весь катетер и хвост, чтобы закрепить его на опорной пластине клетки. Для этого шага использовалась многоцелевая цветная этикеточная лента.
3. Отсоедините смыв от катетера хвостовой вены и поместите небольшой зажим на силастическую трубку катетера, чтобы предотвратить обратный поток при подключении инфузионной линии от насоса.
4. После надежного соединения снимите зажим и промывайте грунтовочным раствором, который состоит из настоя. Убедитесь, что раствор прозрачен в трубке и не окрашен кровью.
5. Запишите время начала инфузии, чтобы убедиться, что она длится в течение общего времени примерно 3 ч. Если несколько клеток используются одновременно, их следует расположить в шахматном порядке, чтобы эффективно управлять временем инфузии.
6. Как только линии инфузии будут отмечены, что они функционируют должным образом, снимите крышку с мыши. Разместите стандартную постельную принадлежность вокруг мыши.
7. Начните инфузию с первого инфузии, содержащего индикатор, и запускайте его в течение 3 ч непрерывно. В течение всей инфузии продолжайте проверять самочувствие мышей, а также линии инфузии. Убедитесь, что инфузионная трубка надежно закреплена и что нет утечек из точек подключения линии.

5. Забор крови

1. После того, как первая инфузия завершена, остановите инфузию, поместите зажим на силастическую трубку на катетере, чтобы предотвратить обратный поток. Осторожно извлеките мышей из их вольеров, не нарушая катетер, чтобы собрать кровь. Поместите их в место рядом с клетками для забора крови. Для этого эксперимента мыши подверглись венипунктуре щек с использованием 4-миллиметрового ланцета.
2. Соберите ~75 мкл крови в нужном флаконе. Для депротеинизации образцов при подготовке к масс-спектрометрии добавляют примерно 15 мкл крови к 500 мкл ацетона. Оставшаяся кровь может быть использована для проверки уровня глюкозы в крови с помощью глюкометра и / или центрифугирована для разделения плазмы для будущих гормональных анализов.

6. Второй настой

1. Удалите инфузии из шприцевых насосов, отсоединив трубку от шприцев, и замените ее вторым инфузитом, содержащим индикатор вместе с глюкозой. Повторите шаги с 4.2 по 4.7, используя богатую глюкозой изотопную инфузию глюкозы.
   1. Чтобы достичь устойчивого состояния, запускают болюс второго инфузии со скоростью 600 мкл/ч в течение 15 мин. Обратите внимание на время начала для каждой группы клеток. Уменьшите скорость инфузии до 150 мкл/ч до завершения 3 ч общего времени инфузии.
2. Повторите шаги 5.1 и 5.2.
3. Остановите инфузионный насос и аккуратно удалите катетер хвостовой вены, надавите на участки катетера до тех пор, пока кровотечение не прекратится, и верните мышей в их домашние клетки.
4. Тщательно продезинфицируйте и продезинфицируйте клетку стандартным мылом и водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это процедура выживания. Мышей можно вернуть в клетки и содержать для дальнейших переживаний, если это необходимо. Рекомендуется, чтобы дальнейшее переживание не проводилось в течение по крайней мере недели после этой процедуры, чтобы обеспечить адекватное благополучие животных.

7. Масс-спектрометрия

1. Отправьте образцы для масс-спектрометрии.
2. Анализировать
   1. Измеряют изотопное обогащение [^6,6-2Н2]глюкозы методом газхроматографии - масс-спектрометрии (ГКМС) с использованием производного пентаацетата21,22. Вкратце, этот метод включает в себя получение пентаацетатного производного глюкозы с последующим анализом образца с использованием GCMS ^20,22.
3. Расчеты
   1. Выполняйте все кинетические измерения в установившихся условиях. Общая скорость появления глюкозы в плазме (глюкоза _{Ra) была рассчитана} на основе обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозы в плазме с использованием установленных уравнений разбавления изотопов21. В установившихся условиях предполагается, что скорость появления глюкозы равна скорости исчезновения глюкозы. Скорость эндогенной выработки глюкозы (мг/(кг·мин)) (GPR) = _{глюкозаRa} - экзогенная глюкоза.

Результаты

Используя ранее описанные уравнения разбавления изотопов, общая скорость глюкозы в плазме (_{глюкозаRa) была рассчитана} из обогащения M+2 [6,6-2H2]глюкозой в условиях голодания и богатых глюкозой состояний с использованием производного пентаацетата21. В стацион?...

Обсуждение

Гипергликемия и аномальный метаболизм глюкозы / гомеостаз являются особенностями СПКЯ. Уровень глюкозы в крови поддерживается комбинацией глюкозы из рациона и производства глюкозы посредством гликогенолиза и глюконеогенеза и гликогенеза под контролем гормонов и ферментов. Про?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion