طريقة بسيطة معدلة لتحريض احتشاء عضلة القلب في الفئران

Summary

تحت التخدير الكافي ، تم إخراج قلب الفأر من خلال الفضاء الوربي ، وتم إحداث احتشاء عضلة القلب بنجاح عن طريق ربط الشريان النازل الأمامي الأيسر (LAD) باستخدام مواد متاحة بسهولة في معظم المختبرات.

Abstract

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب الرئيسية للوفاة. تستخدم نماذج MI على نطاق واسع للتحقيق في الآليات المرضية لإعادة عرض ما بعد MI وتقييم العلاجات الجديدة. تم استخدام طرق مختلفة (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على MI. بالمقارنة مع علاج الأيزوبروتيرينول والإصابة بالتبريد ، قد يعكس ربط الشريان التاجي بشكل أفضل الاستجابة الإقفارية وإعادة التشكيل المزمن بعد MI. ومع ذلك ، فإن الطرق التقليدية لربط الشريان التاجي في الفئران تمثل تحديا تقنيا. تصف الدراسة الحالية عملية بسيطة وفعالة لتحريض MI في الفئران بمواد متاحة بسهولة. تم قطع جلد صدر الفأر تحت التخدير المستقر. تم إخراج القلب على الفور من خلال الفضاء الوربي بعد الفصل الحاد بين الصدرية الكبرى والصدرية الصغرى. تم ربط الفرع الهابط الأمامي الأيسر (LAD) بخياطة 6-0 3 مم من أصله. بعد ربط LAD ، أشار التلوين بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازوليوم (TTC) إلى تحريض ناجح ل MI والتغيرات الزمنية لحجم ندبة ما بعد MI. وفي الوقت نفسه ، أظهرت نتائج تحليل البقاء على قيد الحياة وفيات علنية في غضون 7 أيام بعد MI ، ويرجع ذلك أساسا إلى تمزق القلب. علاوة على ذلك ، أظهر تقييم تخطيط صدى القلب بعد MI تحريضا ناجحا لضعف الانقباض وإعادة تشكيل البطين. بمجرد إتقانه ، يمكن إنشاء نموذج MI في الفئران في غضون 2-3 دقائق بمواد متاحة بسهولة.

Introduction

يمثل احتشاء عضلة القلب (MI) أحد الأسباب المهمة للوفاة والعجز في جميع أنحاء العالم¹،²،³،^4،5. على الرغم من إعادة التروية في الوقت المناسب ، يوجد حاليا نقص في العلاجات الفعالة لعلاج إعادة تشكيل القلب بعد MI. في المقابل ، بذلت جهود كبيرة للاستكشاف الميكانيكي واستغلال العلاج ل MI^6،7،8. وتجدر الإشارة إلى أن إنشاء نماذج MI هو شرط أساسي لتحقيق هذه الغايات.

تم اقتراح عدة طرق (على سبيل المثال ، علاج الأيزوبروتيرينول ، والإصابة بالتبريد ، وربط الشريان التاجي ، وما إلى ذلك) للحث على نماذج MI في الحيوانات الصغيرة. علاج الأيزوبروتيرينول هو طريقة بسيطة لتحريض MI ، لكنه لا يمكن أن يحفز احتشاء المنطقة المستهدفة⁹. تؤدي الإصابة بالتبريد إلى نخر عضلة القلب عن طريق توليد بلورات الثلج وتعطيل غشاء الخلية بدلا من نقص التروية المباشر¹⁰. على النقيض من ذلك ، يسمح ربط الشريان التاجي بالتحكم الدقيق في موقع الانسداد ومدى منطقة الاحتشاء ويلخص بأمانة استجابة إعادة البناء بعد الاحتشاء^11,12. عادة ما يتم إجراء ربط الشريان التاجي بعد التنبيب والتهوية الميكانيكية وبضع الصدر ، وهو أمر يمثل تحديا تقنيا^13,14. تم الإبلاغ عن العديد من البروتوكولات المعدلة لربط الشريان التاجي (على سبيل المثال ، التهوية الحرة) وعززت تحريض MI ، ولكن لا توجد عروض بصرية مفصلة¹⁵،^16،17. تشكل هذه القضايا حاجزا ماليا وتقنيا كبيرا أمام المجموعات الراغبة في المشاركة في البحث باستخدام نماذج MI. يقدم هذا التقرير نهجا لتحريض MI في الفئران. الطريقة الحالية سهلة وموفرة للوقت وتستخدم الأدوات والمعدات الجراحية الموجودة بسهولة في معظم المختبرات.

Protocol

يتم إجراء التجارب التي تنطوي على عمل حيواني مع جميع الموافقات اللازمة من لجنة أخلاقيات رعاية المختبر في مستشفى رينجي ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، كلية الطب (R52021-0506). تم استخدام إناث وذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 8-10 أسابيع في الدراسة.

1. إعداد معدات التخدير المبسطة (اختياري)

ملاحظة: هذا إعداد اختياري قبل الجراحة ويمكن استبداله بتخدير قابل للمعايرة كما هو مذكور في القسم 2. يجب استشارة لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية والطبيب البيطري (الأطباء البيطريين) قبل تكييف هذا الإعداد في الإجراءات الحيوانية.

1. خذ أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، وقم بعمل قطع عمودي على المحور الطويل للأنبوب على بعد حوالي 3 سم من الفتحة.
   ملاحظة: تأكد من أن القطع أكبر من نصف المحيط الدائري لتجويف الأنبوب بحيث يمكن إدخال الصمام بنجاح.
2. حفر ثقوب (قطرها 2 مم) في جدار أنبوب الطرد المركزي بين القطع وفتحة الأنبوب.
3. اقطع قطعة مناسبة الحجم من الصمام من صفيحة بلاستيكية وأدخل الصمام في القطع الموجود على جدار الأنبوب.
   ملاحظة: يمكن استخدام الصمام للتحكم في معدل إطلاق الأيزوفلوران عن طريق تغيير عمق الإدخال.
4. داخل غطاء الدخان ، قم بقطع الجزء السفلي من الأنبوب وتوصيله بإمدادات الأكسجين. ضع كرة قطنية بالقرب من الطرف السفلي للأنبوب ، وأضف حمولة 0.5 مل إيزوفلوران (كما تم الحصول عليها ، انظر جدول المواد) على كرة القطن ، وأغلق الصمام.
5. اختبر فعالية التخدير عن طريق إخفاء الفئران بأنابيب معدة كما هو موضح أعلاه. راقب معدل التنفس وعمق التخدير عن طريق استجابة قرصة إصبع القدم.
   ملاحظة: يشير معدل التنفس الأقل من 10 مرات / 10 ثوان إلى التخدير المفرط ، ويجب تعديل عمق إدخال الصمام. بالنسبة لجميع الإجراءات التي تنطوي على التخدير ، يجب استخدام مرشح غاز مملوء بألواح الفحم المنشط (الشكل 1A-i) ، ويجب إجراء الجراحة داخل غطاء.

2. التحضير الجراحي والتخدير

1. قم بإعداد وتعقيم جميع الأدوات المطلوبة في يوم الجراحة ، بما في ذلك زوج من الملقط ، ومرقئ البعوض الصغير ، ومقص جراحي ، وزوجان من حاملات الإبر ، وخياطة جراحية من الحرير 4-0 ، وخياطة جراحية من الحرير 6-0 ، وفلتر غاز ، ومصدر ضوء (انظر جدول المواد) (الشكل 1 أ).
2. ارتد قناعا جراحيا وقفازات معقمة.
3. ضع كريم مزيل الشعر على صندوق الماوس وانتظر لمدة 1 دقيقة. امسح بلطف كريم مزيل الشعر والشعر بشاش مبلل.
4. امسك الماوس باليد المهيمنة بعد إزالة الشعر. تحفيز التخدير عن طريق استنشاق الأيزوفلوران المتبخر (4٪) مع إمداد الأكسجين (1 لتر / دقيقة) والحفاظ على 2-3٪ إيزوفلوران.
5. تأكد من التخدير الكافي بسبب عدم استجابة قرصة إصبع القدم.
6. ضع كريم العين المعقم على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
7. تأمين الفئران على منصة الجراحة في موقف ضعيف. ضع مسحات البوفيدون واليود (انظر جدول المواد) على الصدر ثلاث مرات وقم بتغطية الصدر المطهر بستارة معقمة.

3. تحريض احتشاء عضلة القلب

1. تغيير القفازات الملوثة لضمان العقم.
2. اصنع قطعا جلديا بطول 0.5 سم على طول الخط الذي يربط الخنجري والإبط بعد الكتلة المحلية مع يدوكائين.
3. افصل بصراحة بين العضلات الصدرية الكبرى والصدرية الصغيرة باستخدام ملقط ومرقئ البعوض الصغير لفضح الفضاء الوربي الرابع.
4. افتح المساحة الوربية الرابعة باستخدام مرقئ البعوض الصغير.
5. قم بإخراج القلب عن طريق دفع القلب نحو الفضاء الوربي الرابع بإصبع السبابة في اليد اليسرى.
6. تأمين القلب باليد اليسرى ، وربط الفرع الأمامي الأيسر النازل مع خياطة 6-0 3 ملم من أصله.
7. ضع القلب مرة أخرى في التجويف الصدري بسرعة.
   ملاحظة: من الآمن إخراج القلب من الخارج لمدة تقل عن 30 ثانية.
8. قم بإخلاء الهواء من التجويف الصدري بضغطة لطيفة على تجويف الصدر يدويا.
9. أغلق طبقة العضلات فوق الأضلاع بخياطة حريرية 6-0.
10. أغلق الجلد بخياطة حرير 4-0.
11. ضع الفئران على وسادة (37 درجة مئوية) مباشرة بعد العملية.
12. حقن البوبرينورفين (0.05-0.1 ملغ / كغ) تحت الجلد كل 4-6 ساعات للحد من آلام ما بعد الجراحة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
13. أعد الفئران التي تم تشغيلها إلى أقفاص عند الشفاء التام.
    ملاحظة: سيتم استرداد الفئران بالكامل في غضون 3-5 دقائق بعد الجراحة.
14. راقب الفئران بعناية وقدم الطعام الرطب لمدة تصل إلى 7 أيام.

4. حصاد الأنسجة

1. التضحية بالفئران في نقاط زمنية مختلفة بعد إنشاء MI عن طريق خلع عنق الرحم.
2. تأمين الفئران التي تم التضحية بها على منصة الجراحة في وضع ضعيف.
3. قم بعمل شق بطني (~ 3-4 سم) في الجزء العلوي من البطن. قطع الأضلاع من كلا جانبي تجويف الصدر ، وإزالة الحجاب الحاجز.
4. قم بتغذية القلب بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد سعة 10 مل (1x PBS ، 4 درجات مئوية) من خلال الحقن داخل البطيني.
5. اجمع القلب عن طريق قطع جذر الأبهر وخزن القلب على الفور عند -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: وفقا لتجربة المؤلفين ، من الممكن إجراء تلطيخ TTC في غضون أسبوعين من التخزين.
6. صبغ القلب بكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC).
   1. قطعي القلب المتجمد إلى أقسام بسمك 1 مم على الثلج باستخدام شفرات الحلاقة.
   2. احتضان شرائح القلب المحضرة في محلول TTC 1٪ (مذاب في 1x PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: بعد 15 دقيقة من الحضانة ، تخلص من محلول TTC واغمر شرائح القلب الملطخة في 1x PBS.
7. صور الشرائح باستخدام كاميرا رقمية.

النتائج

يوضح الشكل 1 البروتوكول التجريبي وبعض الخطوات الحاسمة. معدات التخدير المبسطة تسبب التخدير. كما هو موضح في الشكل 2 أ ، كان التخدير المستحث مستقرا ، كما ينعكس في معدلات التنفس العادية (تراوحت من 90-107 أنفاس / دقيقة في الفئران المختبرة). بعد ربط الشريان التاجي ، أش...

Discussion

وأظهر هذا التقرير بروتوكولا سهلا لتحريض MI في الفئران ذات المواد المتاحة بسهولة، والذي تم تعديله من طريقة أبلغ عنها^{GAO 16}. لا غنى عن نماذج Murine MI للاستكشاف الميكانيكي وشاشة الأدوية لخلل وظيفي بعد MI وإعادة عرض¹². من بين التقنيات الحالية لتحريض MI ، يمثل ربط الشريان التاج...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA	T8877-25G	TTC staining
4-0 silk suture	YUANKANG	4-0	Surgical instrument
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50	Sterilization for the solid
Buprenorphine	Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.	H10940181	reduce post-operative pain
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Forcep	RWD	F12028	Surgical instrument
Gas filter	ZHAOXIN	SA-493	Operator protection
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Light source	Beijing PDV	LG-150B	Operating lamp
Micro-mosquito hemostat	FST	13011-12	Surgical instrument
Needle	BINXIONG	42180104	Surgical instrument
Needle and the 6-0 silk suture	JIAHE	SC086	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32030	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Scissors	CNSTRONG	JYJ1030	Surgical instrument
Sterile eye cream	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H10940177	prevent corneal dryness
Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals	VisualSonics	Vevo 2100	Echocardiographic analysis