Méthode simple modifiée pour l’induction d’un infarctus du myocarde chez la souris

Résumé

Sous anesthésie adéquate, le cœur de la souris a été extériorisé par l’espace intercostal, et l’infarctus du myocarde a été induit avec succès en ligaturant l’artère descendante antérieure gauche (LAD) à l’aide de matériaux facilement disponibles dans la plupart des laboratoires.

Résumé

L’infarctus du myocarde (IM) représente l’une des principales causes de décès. Les modèles d’IM sont largement utilisés pour étudier les mécanismes pathologiques du remodelage post-IM et l’évaluation de nouvelles thérapies. Différentes méthodes (p. ex., traitement à l’isoprotérénol, cryolésion, ligature de l’artère coronaire, etc.) ont été utilisées pour induire l’infarctus du myocarde. Par rapport au traitement à l’isoprotérénol et à la cryolésion, la ligature de l’artère coronaire peut mieux refléter la réponse ischémique et le remodelage chronique après l’infarctus du myocarde. Cependant, les méthodes traditionnelles de ligature coronaire chez la souris sont techniquement difficiles. La présente étude décrit un processus simple et efficace pour l’induction de l’IM chez la souris avec des matériaux facilement disponibles. La peau de la poitrine de la souris a été ouverte sous anesthésie stable. Le cœur a été immédiatement extériorisé à travers l’espace intercostal après une séparation brutale du grand pectoral et du petit pectoral. La branche descendante antérieure gauche (LAD) a été ligaturée avec une suture 6-0 à 3 mm de son origine. Après la ligature LAD, la coloration au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) a indiqué une induction réussie de l’IM et des changements temporels de la taille de la cicatrice post-IM. Pendant ce temps, les résultats de l’analyse de survie ont montré une mortalité manifeste dans les 7 jours suivant l’infarctus du myocarde, principalement en raison d’une rupture cardiaque. De plus, l’évaluation échocardiographique post-IM a démontré une induction réussie de la dysfonction contractile et du remodelage ventriculaire. Une fois maîtrisé, un modèle d’IM peut être établi chez la souris en 2 à 3 minutes avec des matériaux facilement disponibles.

Introduction

L’infarctus du myocarde (IM) représente l’une des principales causes de décès et d’invalidité dans le monde 1,2,3,4,5. Malgré une reperfusion rapide, il existe actuellement un manque de thérapies efficaces pour traiter le remodelage cardiaque post-IM. En conséquence, des efforts considérables ont été faits pour l’exploration mécanistique et l’exploitation thérapeutique de l’IM ^6,7,8. Il convient de noter que l’établissement de modèles d’IM est une condition préalable à l’atteinte de ces objectifs.

Plusieurs méthodes (p. ex., traitement à l’isoprotérénol, cryolésion, ligature de l’artère coronaire, etc.) ont été proposées pour induire des modèles d’IM chez les petits animaux. Le traitement à l’isoprotérénol est une méthode simple d’induction de l’IM, mais il ne peut pas induire d’infarctus de la zone ciblée⁹. La cryolésion conduit à une nécrose myocardique via la génération de cristaux de glace et une perturbation de la membrane cellulaire plutôt qu’à une ischémie directe¹⁰. En revanche, la ligature de l’artère coronaire permet un contrôle précis du site d’occlusion et de l’étendue de la zone de l’infarctus et récapitule fidèlement la réponse de remodelage après l’infarctus^11,12. La ligature de l’artère coronaire est généralement effectuée après l’intubation, la ventilation mécanique et la thoracotomie, ce qui est techniquement difficile^13,14. Plusieurs protocoles modifiés pour la ligature de l’artère coronaire (p. ex., sans ventilation) ont été rapportés et ont potentialisé l’induction de l’IM, mais il manque des démonstrations visuelles détaillées^15,16,17. Ces questions constituent un obstacle financier et technique important pour les groupes qui souhaitent s’engager dans la recherche à l’aide de modèles d’IM. Ce rapport présente une approche pour l’induction de l’IM chez la souris. La méthode actuelle est simple, permet de gagner du temps et utilise des outils et des équipements chirurgicaux que l’on trouve facilement dans la plupart des laboratoires.

Protocole

Les expériences impliquant le travail sur les animaux sont réalisées avec toutes les approbations nécessaires du Comité d’éthique du bien-être des animaux de laboratoire de l’hôpital Renji, Université Jiao Tong de Shanghai, École de médecine (R52021-0506). Des souris C57BL/6J femelles et mâles âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées dans l’étude.

1. Préparation de l’équipement d’anesthésie simplifié (FACULTATIF)

REMARQUE : Il s’agit d’une configuration préopératoire facultative et peut être remplacée par une anesthésie titrable comme mentionné à la section 2. Le comité d’éthique animale de l’établissement et le ou les vétérinaires doivent être consultés avant d’adapter cette configuration aux procédures animales.

1. Prenez un tube à centrifuger de 15 mL et faites une coupe perpendiculaire à l’axe long du tube à environ 3 cm de l’ouverture.
   REMARQUE : Assurez-vous que la coupe est supérieure à la moitié de la circonférence circulaire de la lumière du tube afin que la valve puisse être insérée avec succès.
2. Percez des trous (diamètre 2 mm) au niveau de la paroi du tube à centrifuger entre la coupe et l’ouverture du tube.
3. Découpez un morceau de la valve de taille appropriée dans une feuille de plastique et insérez la valve dans la coupe sur la paroi du tube.
   REMARQUE : La valve peut être utilisée pour contrôler le taux de libération de l’isoflurane en modifiant la profondeur de l’insertion.
4. À l’intérieur d’une hotte, ouvrez le fond du tube et connectez-le à l’alimentation en oxygène. Placez une boule de coton près de l’extrémité inférieure du tube, ajoutez une charge de 0,5 mL d’isoflurane (tel qu’obtenu, voir le tableau des matériaux) sur la boule de coton et fermez la valve.
5. Testez l’efficacité de l’anesthésie en masquant les souris avec des tubes préparés comme décrit ci-dessus. Surveillez la fréquence respiratoire et la profondeur de l’anesthésie en fonction de la réponse de pincement des orteils.
   REMARQUE : Une fréquence respiratoire inférieure à 10 fois/10 s suggère une anesthésie excessive et la profondeur d’insertion de la valve doit être ajustée. Pour toutes les procédures impliquant une anesthésie, un filtre à gaz rempli de feuilles de charbon actif doit être utilisé (Figure 1A-i) et la chirurgie doit être effectuée à l’intérieur d’une cagoule.

2. Préparation opératoire et anesthésie

1. Préparez et stérilisez tous les instruments nécessaires le jour de l’opération, y compris une paire de pinces, un hémostat micro-moustique, une paire de ciseaux chirurgicaux, deux paires de porte-aiguilles, une suture chirurgicale en soie 4-0, une suture chirurgicale en soie 6-0, un filtre à gaz et une source de lumière (voir le tableau des matériaux) (figure 1A).
2. Mettez un masque chirurgical et des gants stériles.
3. Appliquez la crème dépilatoire sur la poitrine de la souris et attendez 1 min. Essuyez délicatement la crème dépilatoire et les cheveux avec de la gaze humide.
4. Tenez la souris avec la main dominante après l’épilation. Induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane vaporisé (4 %) avec apport d’oxygène (1 L/min) et maintenir à 2-3 % d’isoflurane.
5. Confirmer l’anesthésie adéquate par l’absence de réponse de pincement des orteils.
6. Appliquez une crème stérile pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse de la cornée.
7. Fixez les souris sur une plate-forme chirurgicale en position couchée. Appliquez trois fois des tampons à base de povidone iodée (voir le tableau des matériaux) sur la poitrine et couvrez la poitrine désinfectée avec un champ stérile.

3. Induction de l’infarctus du myocarde

1. Changez les gants contaminés pour assurer la stérilité.
2. Faites une incision cutanée de 0,5 cm le long de la ligne reliant le xiphoïde et l’aisselle après le blocage local avec la lidocaïne.
3. Séparez carrément les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs à l’aide d’une pince et d’un micro-moustique hémostatique pour exposer le quatrième espace intercostal.
4. Ouvrez le quatrième espace intercostal à l’aide d’un micro-hémostat de moustique.
5. Extériorisez le cœur en poussant le cœur vers le quatrième espace intercostal avec l’index de la main gauche.
6. Fixez le cœur avec la main gauche et ligaturez la branche descendante antérieure gauche avec une suture 6-0 à 3 mm de son origine.
7. Replacez rapidement le cœur dans la cavité thoracique.
   REMARQUE : Il est sécuritaire d’extérioriser le cœur pendant moins de 30 s.
8. Évacuez l’air de la cavité thoracique en appuyant doucement sur la cavité thoracique manuellement.
9. Fermez la couche musculaire sur les côtes avec une suture en soie 6-0.
10. Fermez la peau avec une suture en soie 4-0.
11. Placez les souris sur un tampon (37 °C) immédiatement après l’opération.
12. Injectez de la buprénorphine (0,05 à 0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 4 à 6 heures pour réduire la douleur postopératoire jusqu’à 72 heures.
13. Remettez les souris opérées dans des cages lorsqu’elles sont complètement rétablies.
    REMARQUE : Les souris seront complètement rétablies dans les 3 à 5 minutes suivant la chirurgie.
14. Surveillez attentivement les souris et donnez-leur de la nourriture humide jusqu’à 7 jours.

4. Prélèvement des tissus

1. Sacrifiez les souris à différents moments après l’établissement de l’infarctus du myocarde par luxation cervicale.
2. Fixez les souris sacrifiées sur la plate-forme chirurgicale en position couchée.
3. Faites une incision ventrale (~3-4 cm) dans la partie supérieure de l’abdomen. Coupez les côtes des deux côtés de la cavité thorax et retirez le diaphragme.
4. Perfuser le cœur avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (1x PBS, 4 °C) par injection intraventriculaire.
5. Prélevez le cœur en coupant la racine aortique et conservez immédiatement le cœur à -80 °C.
   REMARQUE : Selon l’expérience des auteurs, il est possible d’effectuer une coloration TTC dans les deux semaines suivant le stockage.
6. Colorer le cœur avec du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC).
   1. Coupez le cœur congelé en sections de 1 mm d’épaisseur sur de la glace à l’aide de lames de rasoir.
   2. Incuber les tranches de cœur préparées dans une solution de TTC à 1 % (dissoute dans 1x PBS) à 37 °C pendant 10-15 min.
      REMARQUE : Après 15 minutes d’incubation, jetez la solution de TTC et plongez les tranches de cœur tachées dans 1x PBS.
7. Photographiez les tranches à l’aide d’un appareil photo numérique.

Résultats

Le protocole expérimental et certaines des étapes critiques sont illustrés à la figure 1. L’équipement d’anesthésie simplifiée induit l’anesthésie. Comme le montre la figure 2A, l’anesthésie induite était stable, comme en témoignent les fréquences respiratoires régulières (variaient de 90 à 107 respirations/min chez les souris testées). À la suite de la ligature de l’artère coronaire, l’analyse de coloration TTC a indiqué une induc...

Discussion

Le présent rapport a démontré un protocole simple pour l’induction de l’IM chez la souris avec des matériaux facilement disponibles, qui a été modifié à partir d’une méthode rapportée par Gao¹⁶. Les modèles murins d’IM sont indispensables pour l’exploration mécanistique et le dépistage de médicaments pour le dysfonctionnement et le remodelage post-IM¹². Parmi les techniques existantes d’induction de l’IM, la ligature de l’artère coronaire repr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA	T8877-25G	TTC staining
4-0 silk suture	YUANKANG	4-0	Surgical instrument
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50	Sterilization for the solid
Buprenorphine	Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.	H10940181	reduce post-operative pain
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Forcep	RWD	F12028	Surgical instrument
Gas filter	ZHAOXIN	SA-493	Operator protection
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Light source	Beijing PDV	LG-150B	Operating lamp
Micro-mosquito hemostat	FST	13011-12	Surgical instrument
Needle	BINXIONG	42180104	Surgical instrument
Needle and the 6-0 silk suture	JIAHE	SC086	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32030	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Scissors	CNSTRONG	JYJ1030	Surgical instrument
Sterile eye cream	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H10940177	prevent corneal dryness
Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals	VisualSonics	Vevo 2100	Echocardiographic analysis