Модифицированный простой метод индукции инфаркта миокарда у мышей

Резюме

Под адекватной анестезией сердце мыши было экстернализовано через межреберное пространство, и инфаркт миокарда был успешно индуцирован путем перевязки левой передней нисходящей артерии (LAD) с использованием материалов, легко доступных в большинстве лабораторий.

Аннотация

Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из ведущих причин смерти. Модели инфаркта миокарда широко используются для изучения патомеханизмов постинфаркта миокарда и оценки новых терапевтических средств. Для индуцирования инфаркта миокарда использовались различные методы (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т. д.). По сравнению с лечением изопротеренолом и криотравмой, перевязка коронарных артерий может лучше отражать ишемический ответ и хроническое ремоделирование после ИМ. Однако традиционные методы перевязки коронарных артерий у мышей технически сложны. В настоящем исследовании описывается простой и эффективный процесс индукции инфаркта миокарда у мышей с помощью легкодоступных материалов. Кожа грудной клетки мыши была вскрыта под стабильным наркозом. Сердце было немедленно экстернализовано через межреберье после тупого разделения большой и малой грудных мышц. Левая передняя нисходящая ветвь (LAD) была перевязана швом 6-0 в 3 мм от ее источника. После перевязки LAD окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС) указывало на успешную индукцию инфаркта миокарда и временные изменения размера рубцов после ИМ. Между тем, результаты анализа выживаемости показали явную смертность в течение 7 дней после инфаркта миокарда, в основном из-за разрыва сердца. Кроме того, эхокардиографическая оценка после инфаркта миокарда продемонстрировала успешную индукцию сократительной дисфункции и ремоделирования желудочков. После освоения модель ИМ может быть установлена на мышах в течение 2-3 минут с помощью легкодоступных материалов.

Введение

Инфаркт миокарда (ИМ) является одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире 1,2,3,4,5. Несмотря на своевременную реперфузию, в настоящее время не существует эффективных методов лечения ремоделирования сердца после инфаркта миокарда. Соответственно, были предприняты значительные усилия по механистическому исследованию и терапевтической эксплуатации ИМ ^6,7,8. Следует отметить, что создание моделей ИМ является необходимым условием для достижения этих целей.

Предложено несколько методов (например, лечение изопротеренолом, криотравма, перевязка коронарных артерий и т.д.) для индуцирования моделей инфаркта миокарда у мелких животных. Лечение изопротеренолом является простым методом индукции инфаркта миокарда, но оно не может индуцировать инфаркт целевой области⁹. Криоповреждение приводит к некрозу миокарда за счет образования кристаллов льда и разрушения клеточной мембраны, а не к прямой ишемии¹⁰. В отличие от этого, перевязка коронарных артерий позволяет точно контролировать место окклюзии и протяженность области инфаркта и точно повторяет реакцию ремоделирования после инфаркта^11,12. Перевязка коронарных артерий обычно выполняется после интубации, искусственной вентиляции легких и торакотомии, что технически сложно^13,14. Сообщалось о нескольких модифицированных протоколах перевязки коронарных артерий (например, без вентиляции), которые потенцировали индукцию инфаркта миокарда, но подробные визуальные демонстрации отсутствуют^15,16,17. Эти проблемы создают значительный финансовый и технический барьер для групп, желающих заниматься исследованиями с использованием моделей ИМ. В данном докладе представлен подход к индукции инфаркта миокарда у мышей. Нынешний метод прост, экономит время и использует хирургические инструменты и оборудование, которые можно найти в большинстве лабораторий.

протокол

Эксперименты, связанные с работой с животными, проводятся со всеми необходимыми разрешениями Комитета по этике благополучия лабораторных животных больницы Жэньцзи, Шанхайского университета Цзяотун, Школа медицины (R52021-0506). В исследовании использовались самки и самцы мышей C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель.

1. Подготовка упрощенного анестезиологического оборудования (ОПЦИОНАЛЬНО)

ПРИМЕЧАНИЕ: Это дополнительная предоперационная установка, которая может быть заменена титруемой анестезией, как указано в разделе 2. Следует проконсультироваться с институциональным комитетом по этике животных и ветеринаром (ветеринарами), прежде чем адаптировать эту систему в процедурах для животных.

1. Возьмите центрифужную пробирку объемом 15 мл и сделайте надрез перпендикулярно длинной оси пробирки примерно в 3 см от отверстия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез превышает половину окружности просвета трубки, чтобы клапан можно было успешно вставить.
2. Просверлите отверстия (диаметр 2 мм) на стенке трубки центрифуги между разрезом и отверстием трубы.
3. Отрежьте подходящий по размеру кусок клапана из пластикового листа и вставьте клапан в вырез на стенке трубки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клапан можно использовать для контроля скорости высвобождения изофлурана путем изменения глубины введения.
4. Внутри вытяжного шкафа разрежьте нижнюю часть трубки и подключите ее к подаче кислорода. Поместите ватный тампон к нижнему концу пробирки, добавьте на ватный тампон 0,5 мл изофлурана (как получено, см. Таблицу материалов) и закройте клапан.
5. Проверьте эффективность анестезии, замаскировав мышей трубками, приготовленными, как описано выше. Контролируйте частоту дыхания и глубину анестезии по реакции на щипки пальцев ног.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания менее 10 раз/10 с указывает на чрезмерную анестезию, и глубина введения клапана должна быть отрегулирована. Для всех процедур, связанных с анестезией, необходимо использовать газовый фильтр, заполненный листами активированного угля (рис. 1A-i), а операцию следует проводить в капюшоне.

2. Оперативная подготовка и анестезия

1. Подготовьте и простерилизуйте все необходимые инструменты в день операции, включая пару щипцов, микро-москитный гемостат, пару хирургических ножниц, две пары иглодержателей, шелковый хирургический шовный материал 4-0, шелковый хирургический шовный материал 6-0, газовый фильтр и источник света (см. Таблицу материалов) (Рисунок 1A).
2. Наденьте хирургическую маску и стерильные перчатки.
3. Нанесите крем для депиляции на грудь мыши и подождите 1 минуту. Аккуратно сотрите крем для депиляции и волосы влажной марлей.
4. Удерживайте мышь доминирующей рукой после депиляции. Индуцируют анестезию путем вдыхания парообразного изофлурана (4%) с подачей кислорода (1 л/мин) и поддерживают 2-3% изофлурана.
5. Подтвердите адекватную анестезию отсутствием реакции на щипок пальца ноги.
6. Нанесите стерильный крем для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы.
7. Закрепите мышей на операционной платформе в положении лежа на спине. Трижды приложите к груди тампоны с повидон-йодом (см. таблицу материалов) и накройте продезинфицированную грудную клетку стерильной простыней.

3. Индукция инфаркта миокарда

1. Смените загрязненные перчатки, чтобы обеспечить стерильность.
2. Сделайте разрез кожи 0,5 см по линии, соединяющей мечевидную мышцу и подмышечную впадину, после локальной блокады лидокаином.
3. Тупо разделите большую грудную и малую грудные мышцы с помощью щипцов и микро-москитного гемостата, чтобы обнажить четвертое межреберье.
4. Откройте четвертое межреберье с помощью микро-москитного гемостата.
5. Экстернализуйте сердце, подталкивая сердце к четвертому межреберью указательным пальцем левой руки.
6. Левой рукой закрепите сердце, а левую переднюю нисходящую ветвь наложите шов 6-0 на расстоянии 3 мм от его начала.
7. Быстро поместите сердце обратно в грудную полость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Можно безопасно экстернализировать сердце менее чем на 30 секунд.
8. Откачайте воздух из грудной полости легким нажатием на грудную полость вручную.
9. Закройте мышечный слой над ребрами шелковым швом 6-0.
10. Закройте кожу шелковым швом 4-0.
11. Положите мышей на подушечку (37 °C) сразу после операции.
12. Вводите бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) подкожно каждые 4-6 часов, чтобы уменьшить послеоперационную боль на срок до 72 часов.
13. Верните прооперированных мышей в клетки после полного выздоровления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши полностью выздоровеют в течение 3-5 минут после операции.
14. Внимательно следите за мышами и обеспечьте влажный корм на срок до 7 дней.

4. Заготовка тканей

1. Приносили в жертву мышей в разные моменты времени после установления ИМ при вывихе шейки матки.
2. Закрепите принесенных в жертву мышей на операционной платформе в положении лежа на спине.
3. Сделайте вентральный разрез (~3-4 см) в верхней части живота. Отрежьте ребра с обеих сторон грудной полости, и удалите диафрагму.
4. Перфузии сердца 10 мл холодного фосфатно-буферного физиологического раствора (1x PBS, 4 °C) путем внутрижелудочковой инъекции.
5. Соберите сердце, отрезав корень аорты, и сразу же храните сердце при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту авторов, окрашивание ТТС можно проводить в течение двух недель после хранения.
6. Окрасьте сердце 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (ТТС).
   1. Замороженное сердце нарезать на льду ломтиками толщиной 1 мм с помощью бритвенных лезвий.
   2. Подготовленные сердечные срезы инкубируют в 1% растворе ТТС (растворенном в 1х ПБС) при 37 °С в течение 10-15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 15-минутной инкубации выбросьте раствор TTC и погрузите окрашенные ломтики сердца в 1x PBS.
7. Сфотографируйте срезы с помощью цифровой камеры.

Результаты

Протокол эксперимента и некоторые критические этапы показаны на рисунке 1. Упрощенное анестезиологическое оборудование индуцировано анестезией. Как показано на рисунке 2А, индуцированная анестезия была стабильной, что отражалось в регулярной частоте ?...

Обсуждение

В настоящем отчете был продемонстрирован простой протокол индукции инфаркта миокарда у мышей с легкодоступными материалами, который был модифицирован по сравнению с методом, описанным в Gao¹⁶. Мышиные модели инфаркта миокарда незаменимы для механистического исследования ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA	T8877-25G	TTC staining
4-0 silk suture	YUANKANG	4-0	Surgical instrument
Autoclave	HIRAYAMA	HVE-50	Sterilization for the solid
Buprenorphine	Qinghai Pharmaceutical FACTORY Co., Ltd.	H10940181	reduce post-operative pain
Centrifugation tube	Biological Hope	1850-K	15ML
Depilatory cream	ZIKER BIOTECHNOLOGY	ZK-L2701	Depilation agent for laboratory animals
Forcep	RWD	F12028	Surgical instrument
Gas filter	ZHAOXIN	SA-493	Operator protection
Isoflurane	RWD	20071302	Used for anesthesia
Light source	Beijing PDV	LG-150B	Operating lamp
Micro-mosquito hemostat	FST	13011-12	Surgical instrument
Needle	BINXIONG	42180104	Surgical instrument
Needle and the 6-0 silk suture	JIAHE	SC086	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32030	Surgical instrument
Needle holder	ShangHaiJZ	J32010	Surgical instrument
Povidone-iodine swabs	SingleLady	GB26368-2010	Skin disinfection
Scissors	CNSTRONG	JYJ1030	Surgical instrument
Sterile eye cream	Shenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.	H10940177	prevent corneal dryness
Ultra-high resolution ultrasound imaging system for small animals	VisualSonics	Vevo 2100	Echocardiographic analysis