Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تلخص الطريقة المعروضة هنا البروتوكولات المحسنة لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا الجذعية المكونة للدم غير الملتصقة بالفئران والخلايا السلفية البدائية (HSPCs) باستخدام محلل التدفق خارج الخلية لقياس معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ل HSPCs في الوقت الفعلي.

Abstract

في ظل الحالة المستقرة ، تظل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هادئة إلى حد كبير ويعتقد أنها تعتمد في الغالب على تحلل السكر لتلبية احتياجاتها النشطة. ومع ذلك ، في ظل ظروف الإجهاد مثل العدوى أو فقدان الدم ، تصبح HSCs تكاثرية وتنتج بسرعة خلايا السلف في المصب ، والتي بدورها تتمايز بشكل أكبر ، مما يؤدي في النهاية إلى إنتاج خلايا الدم الناضجة. خلال عملية الانتقال والتمايز هذه ، تخرج HSCs من السكون وتخضع بسرعة لتبديل التمثيل الغذائي من تحلل السكر إلى الفسفرة التأكسدية (OxPHOS). يمكن أن تؤثر ظروف الإجهاد المختلفة ، مثل الشيخوخة والسرطان والسكري والسمنة ، سلبا على وظيفة الميتوكوندريا ، وبالتالي يمكن أن تغير إعادة برمجة التمثيل الغذائي والتمايز بين HSCs والأسلاف أثناء تكون الدم. يمكن الحصول على رؤى قيمة حول وظائف تحلل السكر والميتوكوندريا ل HSCs والأسلاف في ظل الظروف العادية وظروف الإجهاد من خلال تقييم معدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، وهما مؤشران على تحلل السكر الخلوي وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي.

هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لقياس ECAR و OCR في مجموعات الخلايا السلبية المشتقة من نخاع عظم الفأر ، والتي تشمل كلا من الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا السلفية البدائية (HSPCs) ، باستخدام محلل التدفق خارج الخلية. يصف هذا البروتوكول أساليب عزل الخلايا السلبية النسب من نخاع عظام الفأر ، ويشرح تحسين كثافة بذر الخلايا وتركيزات 2-deoxy-D-glucose (2-DG ، وهو تناظري للجلوكوز يمنع تحلل السكر) والعديد من الأدوية التي تستهدف OxPHOS (oligomycin، FCCP، rotenone، وantimycin A) المستخدمة في هذه المقاييس، ويصف استراتيجيات العلاج من تعاطي المخدرات. يمكن قياس المعلمات الرئيسية للتدفق المحلل للسكر ، مثل تحلل السكر ، والقدرة على تحلل السكر ، واحتياطي تحلل السكر ، ومعلمات OxPHOS ، مثل التنفس القاعدي ، والتنفس الأقصى ، وتسرب البروتون ، وإنتاج ATP ، والقدرة التنفسية الاحتياطية ، وكفاءة الاقتران ، في هذه المقاييس. يسمح هذا البروتوكول بقياسات ECAR و OCR على HSPCs غير الملتصقة ويمكن تعميمه لتحسين ظروف التحليل لأي نوع من خلايا التعليق.

Introduction

تكون الدم هو العملية التي يتم من خلالها تشكيل أنواع مختلفة من خلايا الدم الناضجة ذات الوظائف المتخصصة للغاية من HSCs1. HSCs قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في مختلف مجموعات السلف متعددة القدرات والخاصة بالنسب. ينتج هؤلاء الأسلاف في نهاية المطاف خلايا من سلالات اللمفاوية والنخاعية والإريثرويد والخلايا النوية الضخمة. للحفاظ على قدرتها على التجديد الذاتي ، تظل HSCs هادئة إلى حد كبير ، ومثل الخلايا الجذعية الأخرى للأنسجة ، يعتقد أنها تعتمد على تحلل السكر بدلا من الميتوكوندريا OxPHOS لإنتاج ATP 2,3. يؤدي الدخول إلى دورة الخلية إلى تعزيز التنفس و OxPHOS ، مما يؤدي إلى مستويات مرتفعة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تضر بصيانة HSC ووظيفتها3. وبالتالي ، قد يؤدي الانقسام المتكرر للخلايا إلى انخفاض قدرة التجديد الذاتي ل HSCs وفي النهاية إلى استنفادها.

في تكون الدم لدى البالغين ، تخضع HSCs في المقام الأول لانقسام الخلايا غير المتماثل ، حيث تحتفظ إحدى الخلايا الابنة بإمكانات HSC وتستمر في الاعتماد على التمثيل الغذائي السكري. تصبح الخلية الابنة الأخرى خلية سلف بدائية تفقد قدرتها على التجديد الذاتي ولكنها تتكاثر وتؤدي في النهاية إلى خلايا مكونة للدم وظيفية متباينة4. عندما تتمايز HSCs لإنتاج أسلاف في اتجاه المصب ، يعتقد أن التحول من تحلل السكر إلى استقلاب الميتوكوندريا يحدث لتوفير الطاقة واللبنات الأساسية اللازمة لدعم هذا الانتقال السريع5 ، كما هو مقترح من الملاحظات التي تفيد بأن HSCs تمتلك كتلة ميتوكوندريا غير نشطة 6,7,8,9 . في المقابل ، فإن نشاط الميتوكوندريا (المشار إليه بمستويات ROS المرتبطة) أعلى بكثير في الأسلاف الملتزمين بالنسب منه في HSCs9،10،11. وبالتالي فإن التغيرات الأيضية التي تحدث خلال الخطوة الأولى من تكون الدم تشير إلى دور مباشر وحاسم للميتوكوندريا في تنظيم مصير HSC.

الميتوكوندريا المختلة وظيفيا الموجودة في ظل ظروف الإجهاد المختلفة ، مثل الشيخوخة والسرطان والسكري والسمنة 12 ، يمكن أن تتداخل مع قدرة التجديد الذاتي HSC ، مما يؤدي إلى اختلال التوازن في تمايز HSC / السلف عن طريق إنتاج كميات زائدة من ROS ، وإضعاف إنتاج ATP ، و / أو عن طريق تغيير عمليات التمثيل الغذائي الأخرى9,12,13 . يمكن أن تؤثر الاضطرابات في التوازن الأيضي في تمايز HSC / السلف بشكل كبير على تكون الدم ، مما قد يساهم في تطور تشوهات الدم13. بالنظر إلى التأثيرات الحرجة لتحلل السكر والميتوكوندريا OxPHOS على جذع HSC والتمايز ، فمن المهم التحقيق في كل من المعلمات الأيضية في ظل الظروف العادية والإجهاد. يمكن الحصول على رؤى قيمة حول وظيفة تحلل السكر والميتوكوندريا ل HSCs والخلايا السلفية من خلال تقييم ECAR و OCR ، وهما مؤشران على تحلل السكر الخلوي وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي.

محلل التدفق خارج الخلية من فرس البحر هو جهاز قوي مجهز بمسبارين لكل بئر لقياس ECAR و OCR في وقت واحد في الخلايا الحية ، وبالتالي يمكن استخدامه لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي ، استجابة لمختلف الركائز أو المثبطات. تحتوي خرطوشة الفحص المستخدمة مع المحلل على منافذ حقن لاستيعاب ما يصل إلى أربعة أدوية للحقن الآلي أثناء الفحص. يظهر مخطط لاختبار إجهاد تحلل السكر النموذجي في الشكل 1A. يبدأ الفحص بقياس ECAR للخلايا ، المحتضنة في وسط اختبار إجهاد تحلل السكر الذي يحتوي على الجلوتامين ولكن ليس الجلوكوز أو البيروفات. هذا يمثل التحمض الذي يحدث بسبب الأنشطة غير المحللة للسكر للخلايا ويتم الإبلاغ عنه على أنه تحمض غير جليكوليتيك. ويتبع ذلك حقن الجلوكوز بتركيز مشبع. عن طريق تحلل السكر ، يتم تحويل الجلوكوز في الخلية إلى بيروفات ، والتي يتم استقلابها بشكل أكبر في السيتوبلازم لإنتاج اللاكتات ، أو في الميتوكوندريا لإنتاج ثاني أكسيد الكربون2 والماء.

يؤدي تحويل الجلوكوز إلى اللاكتات إلى إنتاج صاف وإطلاق لاحق للبروتونات في الوسط خارج الخلية ، مما يؤدي إلى زيادة سريعة في ECAR14,15,16. تم الإبلاغ عن هذا التغيير الذي يحفز الجلوكوز في ECAR على أنه تحلل السكر في ظل الظروف القاعدية. تتكون الحقنة الثانية من oligomycin (مثبط ل ATP synthase ، المعروف أيضا باسم مجمع V17) ، والذي يمنع إنتاج ATP الميتوكوندريا. أثناء تثبيط OxPHOS بوساطة الأوليغومايسين ، تقوم الخلايا بتنظيم تحلل السكر إلى أقصى حد لتلبية متطلباتها النشطة. هذا يسبب زيادة أخرى في ECAR ، مما يكشف عن الحد الأقصى لقدرة تحلل السكر للخلايا. يشار إلى الفرق بين الحد الأقصى لقدرة تحلل السكر وانحلال السكر القاعدي باسم احتياطي تحلل السكر. أخيرا ، يتم حقن 2-DG ، مما يسبب انخفاضا كبيرا في ECAR ، وعادة ما يكون قريبا من مستويات التحمض غير المحلل. 2-DG هو تناظرية الجلوكوز التي ترتبط بشكل تنافسي إلى هيكسوكيناز ، مما يؤدي إلى تثبيط تحلل السكر18. وبالتالي ، فإن الانخفاض الناجم عن 2-DG في ECAR يؤكد أيضا أن تحلل السكر هو في الواقع مصدر ECAR الذي لوحظ بعد حقن الجلوكوز و oligomycin.

يعرض الشكل 1B المخطط لاختبار إجهاد الميتوكوندريا النموذجي. يبدأ الفحص بقياس OCR الأساسي للخلايا ، المحتضنة في وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا الذي يحتوي على الجلوكوز والجلوتامين والبيروفات. بعد قياسات التعرف الضوئي على الحروف القاعدية، يتم حقن الأوليغوميسين في هذا الفحص، الذي يمنع V المعقد، وبالتالي يقلل من تدفق الإلكترون عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC)17. وبالتالي ، يتم تقليل OCR استجابة لحقن oligomycin ، ويرتبط هذا الانخفاض في OCR بإنتاج ATP الميتوكوندريا. يتكون الحقن الثاني من سيانيد الكربونيل -4 (ثلاثي فلورو ميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، وهو بروتونوفور ومفكك من الميتوكوندريا OxPHOS17. ينهار FCCP تدرج بروتون الميتوكوندريا عن طريق السماح بتدفق البروتونات عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. بسبب حقن FCCP ، يتم تقليل تدفق الإلكترون عبر ETC ، ويستهلك IV المعقد الأكسجين عند المستوى الأقصى. يشار إلى الفرق بين الحد الأقصى من التعرف الضوئي على الحروف والتعرف الضوئي على الحروف القاعدي باسم القدرة التنفسية الاحتياطية ، وهو مقياس لقدرة الخلية على الاستجابة لزيادة الطلب على الطاقة في ظل ظروف الإجهاد. أخيرا ، يتم حقن خليط من اثنين من مثبطات ETC (الروتينون ، مثبط I المعقد ، ومضاد المايسين A ، مثبط III المعقد17) ، مما يؤدي إلى إيقاف تدفق الإلكترون تماما ، وينخفض OCR إلى مستوى منخفض. OCR يقاس بعد الروتينون ومضاد المايسين يتوافق حقن A مع OCR غير الميتوكوندريا مدفوعة بعمليات أخرى داخل الخلايا. يتيح التعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا حساب التنفس القاعدي وتسرب البروتون والتنفس الأقصى.

يمثل التنفس القاعدي الفرق بين OCR الأساسي و OCR غير الميتوكوندريا. يشير تسرب البروتون إلى الفرق بين التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن الأوليغوميسين والتعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا. يمثل التنفس الأقصى الفرق بين التعرف الضوئي على الحروف بعد حقن FCCP والتعرف الضوئي على الحروف غير الميتوكوندريا. يتم حساب كفاءة الاقتران كنسبة مئوية من معدل إنتاج ATP إلى معدل التنفس القاعدي. توفر ورقة الطريقة هذه بروتوكولا مفصلا لقياس ECAR و OCR في HSPCs سالبة النسب باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse XFe96. يصف هذا البروتوكول أساليب عزل HSPCs السلبية لسلالة الفئران ، ويشرح تحسين كثافة بذر الخلايا وتركيزات الأدوية المختلفة المستخدمة في اختبارات التدفق خارج الخلية ، ويصف استراتيجيات العلاج من تعاطي المخدرات.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الفقارية وتنفيذها وفقا للوائح لجنة جامعة ميشيغان المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها.

1. قبل يوم من الفحص (الوقت الإجمالي: ~ 10 دقائق)

  1. ترطيب خرطوشة المستشعر (وقت الخطوة: ~ 10 دقائق)
    1. افتح مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية وقم بإزالة خرطوشة المستشعر ومجموعة لوحات المرافق. احفظ شقق دليل التحميل لاستخدامها في اليوم التالي.
    2. افصل خرطوشة المستشعر يدويا (الجزء الأخضر العلوي مع الغطاء) عن لوحة الأداة المساعدة (اللوحة الدقيقة السفلية ذات ال 96 بئرا) وضعها رأسا على عقب بجوار لوحة الأداة المساعدة.
    3. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، املأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من المعايرة ، المضمنة في مجموعة فحص التدفق.
    4. ضع خرطوشة المستشعر مرة أخرى على لوحة الأداة المساعدة، مع التأكد من غمر المستشعرات بالكامل في المعايرة.
    5. ضع خرطوشة المستشعر المجمعة ولوحة المرافق مع العيار في حاضنة غير CO2 37 °C بين عشية وضحاها. لمنع تبخر العيار ، تأكد من ترطيب الحاضنة بشكل صحيح. إذا كنت تستخدم حاضنة فرن عادية لحضانات غير CO2 37 °C ، ضع دورقا مفتوحا يحتوي على الماء داخل الحاضنة لترطيبه. إذا كان ذلك متاحا، استخدم محطة إعداد XF لجميع الحضانات غير CO2 37 °C.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن ترطيب خرطوشة المستشعر بين عشية وضحاها باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من الماء المعقم فائق النقاء في حاضنة غير CO2 37 °C. استبدل الماء ب 200 ميكرولتر لكل بئر من عيار 37 درجة مئوية ، قبل 45-60 دقيقة على الأقل من تحميل منافذ الحقن في يوم الفحص.

2. يوم الفحص (الوقت الإجمالي: ~ 9 ساعة 30 دقيقة)

ملاحظة: يتضمن إجمالي الوقت المشار إليه أعلاه المدد التراكمية للخطوات 2.1-2.4 بالإضافة إلى الخطوة 2.5 أو الخطوة 2.6.

  1. تحضير الألواح الدقيقة المغلفة بمادة لاصقة للخلايا (وقت الخطوة: ~ 1 ساعة و 30 دقيقة)
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات في خزانة السلامة الأحيائية.
    1. قم بإعداد 2.5 مل من محلول لاصق الخلية (22.4 ميكروغرام / مل ، انظر جدول المواد) لكل صفيحة دقيقة لزراعة الخلايا 96 بئرا عن طريق إذابة 56 ميكروغرام من المادة اللاصقة للخلية في حجم مناسب من بيكربونات الصوديوم المعقمة بالمرشح 0.1 م (الرقم الهيدروجيني 8.0) وإضافة هيدروكسيد الصوديوم 1 N على الفور إلى نصف حجم مخزون لاصق الخلية المستخدم. دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا للخلط.
    2. افتح الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا (المضمنة في مجموعة فحص التدفق) وقم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول لاصق الخلية المحضر في أسفل كل بئر. قم بتغطية الصفيحة الدقيقة بالغطاء واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل الغطاء.
    3. بعد الحضانة ، قم بإزالة والتخلص من محلول لاصق الخلايا الزائد باستخدام ماصة متعددة القنوات أو شفاط ، واغسل كل بئر مرتين ب 200 ميكرولتر من الماء فائق النقاء المعقم. جفف اللوحة في الهواء ، مع إزالة الغطاء ، داخل الغطاء لمدة 30-45 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الصفائح الدقيقة لزراعة الخلايا المغلفة بالخلايا اللاصقة لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية. يجب السماح للألواح الدقيقة المطلية مسبقا المخزنة عند 4 درجات مئوية بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة داخل الغطاء قبل بذر الخلايا.
  2. إعداد وسائط الفحص (وقت الخطوة: ~ 30 دقيقة)
    1. إعداد اختبار إجهاد تحلل السكر متوسط الفحص
      1. تكملة 100 مل من الوسط الأساسي (انظر جدول المواد) مع 1 مل من 200 مللي متر L-الجلوتامين.
        ملاحظة: تركيز L-glutamine النهائي في وسط الفحص هو 2 mM.
      2. قم بتسخين L-glutamine المكمل بحرارة متوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
      3. اضبط الرقم الهيدروجيني للوسط الدافئ إلى 7.4 مع 1 N NaOH.
      4. قم بتعقيم الوسط بمرشح 0.2 ميكرومتر واحتفظ به عند 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    2. إعداد اختبار إجهاد الميتوكوندريا متوسط الفحص
      1. تكملة 100 مل من الوسط الأساسي مع 0.45 غرام من الجلوكوز ، 1 مل من 200 مللي متر L-الجلوتامين ، و 1 مل من 100 مللي متر بيروفات الصوديوم.
        ملاحظة: يحتوي وسط الفحص النهائي على 25 ملليمتر جلوكوز و 2 ملليمتر إل-جلوتامين و 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم.
      2. الجلوكوز الدافئ ، L-الجلوتامين ، ومكملات بيروفات الصوديوم متوسطة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
      3. اضبط الرقم الهيدروجيني للوسط الدافئ إلى 7.4 مع 1 N NaOH.
      4. قم بتصفية التعقيم المتوسط باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر واحفظه عند 37 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
  3. حصاد HSPCs سلالة الماوس السلبية (وقت الخطوة: ~ 3 ساعة)
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت للفحص عن طريق استكمال محلول الملح المتوازن من هانك بمصل بقري جنيني بنسبة 4٪. قم بإعداد مخزن مؤقت للتخصيب 1x عن طريق تخفيف مخزون 5x بالماء المقطر المعقم. احتفظ بكلا العازلين على الثلج حتى الاستخدام.
    2. القتل الرحيم للفئران إنسانيا باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 يليه خلع عنق الرحم وإزالة الأطراف الخلفية بالمقص. قم بإزالة جميع الأنسجة بعناية من العظام ، وقطع الأطراف من جانبي عظم الفخذ والساق باستخدام المقص. اطرد خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ والساق باستخدام المخزن المؤقت للفحص. مرر الخلايا المتدفقة من خلال مرشح معقم 70 ميكرومتر ، وقم بالطرد المركزي للترشيح عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من السوبرناتان.
    3. قم بتحليل خلايا الدم الحمراء عن طريق تعليق حبيبات الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ACK (150 mM NH4Cl ، 10 mM KHCO3 ، 0.1 mM EDTA ، الرقم الهيدروجيني 7.2). بعد التحلل لمدة دقيقة واحدة على الجليد ، اغسل العينات بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للفحص وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
    4. بعد الغسيل ، احتضن العينات بمزيج من الأجسام المضادة البيوتينيل الموجهة ضد CD2 (تخفيف 1:200) ، CD3 (تخفيف 1:200) ، CD5 (تخفيف 1:200) ، CD8 (تخفيف 1:200) ، Ter-119 (تخفيف 1:200) ، B220 (تخفيف 1:200) ، و Gr-1 (تخفيف 1:800) لمدة 45 دقيقة على الجليد في حجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمقايسة.
    5. اغسل العينات ب 1 مل من المخزن المؤقت للفحص باستخدام الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
    6. اغسل العينات باستخدام 1 مل من مخزن التخصيب العازل 1x مع الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
    7. احتضن العينات ب 20 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين النانوية و 100 ميكرولتر من مخزن التخصيب العازل 1x على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    8. اغسل العينات باستخدام 1 مل من مخزن التخصيب العازل 1x مع الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه.
    9. أعد تعليق العينات في 2.5 مل من مخزن التخصيب المخزن المؤقت 1x. ضعها على مغناطيس فصل لمدة 5 دقائق. جمع supernatants بشكل منفصل في أنابيب مخروطية 15 مل.
    10. أعد تعليق العينات المنفصلة مغناطيسيا في مخزن مؤقت إضافي للتخصيب 1x سعة 2.5 مل ، وضعها مرة أخرى على مغناطيس الفصل لمدة 5 دقائق. جمع ودمج supernatants إلى المجموعات السابقة في أنابيب مخروطية 15 مل من الخطوة 2.3.9.
      ملاحظة: تحتوي المواد الفائقة على كسور الخلايا سالبة النسب.
    11. الطرد المركزي للأنابيب المخروطية سعة 15 مل التي تحتوي على الخلايا المختارة سلبا لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند 4 درجات مئوية.
    12. أعد تعليق كريات الخلايا في 1 مل من المخزن المؤقت للفحص وقم بحساب رقم الخلية باستخدام التربان الأزرق يدويا أو عبر عداد خلية آلي مثل الكونتيسة 3.
      ملاحظة: باتباع النهج الموصوف أعلاه ، يجب تنقية ~ 6 × 106 HSPCs سلبية النسب بسهولة من الأطراف الخلفية لفأر واحد. إذا تم تحضير الكواشف ، مثل المخزن المؤقت للمقايسة ، ومخزن التخصيب 1x ، وكوكتيل الأجسام المضادة الخاصة بالسلالة ، في اليوم السابق للتجربة ، فإن الأمر يستغرق حوالي 2.5-3 ساعات لإثراء HSPCs من 4 فئران. سيستغرق الأمر 10 دقائق إضافية لكل ماوس يتجاوز هذا الرقم.
  4. خلايا البذر في الصفائح الدقيقة المغلفة بمادة لاصقة للخلايا (وقت الخطوة: ~ 1 ساعة)
    1. خلايا الطرد المركزي من الخطوة 2.3.12 عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق بيليه الخلية في وسط الفحص المناسب (وسط اختبار إجهاد تحلل السكر أو وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا). جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. كرر الخطوة 2.4.2. قم بإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في وسط الفحص الدافئ المناسب بتركيز 2.5 × 10 5 خلايا لكل 50 ميكرولتر أو5 × 106 لكل مل.
    4. ماصة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية على طول جانب كل بئر من microplate المغلفة بالمادة اللاصقة الخلوية المغلفة بطبقة 96 بئرا في درجة حرارة الغرفة. ماصة 50 ميكرولتر من وسط الفحص في آبار قياس خلفية الزاوية. استخدم ماصة متعددة القنوات لطلاء الخلايا لضمان الاتساق.
    5. قم بإنشاء صفيحة توازن أجهزة الطرد المركزي عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الماء لكل بئر من صفيحة صغيرة غير مغلفة من 96 بئرا لزراعة الخلايا.
    6. الطرد المركزي للخلايا في اللوحة عند 200 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا تستخدم الفرامل. انقل اللوحة إلى حاضنة غير CO2 37 °C لمدة 25-30 دقيقة لضمان توصيل الخلايا بالكامل. تأكد بصريا تحت المجهر من أن الخلايا ملتصقة بثبات بسطح الصفيحة الدقيقة.
      ملاحظة: نظرا لأن حوالي 6 × 106 يمكن حصاد HSPCs سلبية النسب من الأطراف الخلفية لفأر واحد ، هناك حاجة إلى HSPCs معزولة من 4 فئران (~ 2.4 × 107 خلايا) لملء لوحة كاملة من 96 بئرا إذا كان الهدف هو فحص تدخلات متعددة خارج الجسم الحي بالتوازي. ومع ذلك ، إذا كان الهدف هو التحقيق في تأثير تغيير جيني أو تدخل على المعلمات الأيضية ل HSPCs في الجسم الحي ، فيمكن تحليل HSPCs المعزولة من أزواج متعددة من فئران التحكم والاختبار في نسخ متماثلة تقنية متعددة بالتوازي باستخدام لوحة واحدة.
  5. إجراء اختبار إجهاد تحلل السكر باستخدام محلل التدفق خارج الخلية (وقت الخطوة: ~ 3 ساعات و 30 دقيقة)
    1. تحميل خرطوشة المستشعر مع مركبات الحقن
      1. تحضير 100 مللي متر الجلوكوز ، 20 ميكرومتر أوليغوميسين ، و 500 متر 2-DG حلول في وسط اختبار إجهاد تحلل السكر قبل الاحترار (درجة الحموضة 7.4).
        ملاحظة: يتم تصنيع جميع المحاليل المركبة عن طريق الحقن بتركيز 10x. تركيزات الآبار النهائية هي 10 mM للجلوكوز ، و 2 μM ل oligomycin، و 50 mM ل 2-DG (انظر الجدول 1).
      2. قم بإزالة خرطوشة المستشعر المائي من الحاضنة غير CO2 37 °C من الخطوة 1.1.5. قم بإزالة فقاعات الهواء من المعايرة الموجودة في لوحة الأداة المساعدة عن طريق رفع خرطوشة المستشعر من المعايرة واستبدالها بنفس لوحة الأداة المساعدة بالمعايرة.
      3. ضع دليل تحميل A/D مسطحا (مضمنا في مجموعة مقايسة التدفق خارج الخلية) في الجزء العلوي من خرطوشة المستشعر، وقم بتوجيهه بحيث يكون الحرف "A" موجودا في الزاوية العلوية اليسرى لضمان توفر المنافذ A فقط للتحميل. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من محلول الجلوكوز 100 mM في المنافذ A.
      4. استبدل دليل التحميل A/D المسطح بدليل تحميل B/C مسطحا، مع التوجيه بحيث يكون الحرف "B" موجودا في الزاوية العلوية اليسرى لضمان توفر المنافذ B فقط للتحميل. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتوزيع 22 ميكرولتر من محلول oligomycin 20 μM في المنافذ B.
      5. أعد توجيه دليل تحميل B/C بشكل مسطح لتحديد موقع الحرف "C" في الزاوية العلوية اليسرى لمنافذ التحميل C. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع 25 ميكرولتر من محلول 500 mM 2-DG في المنافذ C.
      6. قم بإزالة شقق دليل التحميل والتخلص منها.
        ملاحظة: من المهم أن يتم تحميل كل سلسلة منافذ من جميع الآبار البالغ عددها 96 بئرا، بما في ذلك آبار الآبار الخلفية، بالكامل بنفس حجم مركب الحقن.
    2. إنشاء القوالب ومعايرتها وقياساتها
      1. إنشاء أو تحميل القالب لاختبار إجهاد تحلل السكر على وحدة التحكم. أدخل التفاصيل المتعلقة باستراتيجيات الحقن وظروف العلاج وأنواع الخلايا، واضغط على إنشاء مجموعات. انتقل إلى خريطة اللوحة وقم بتعيين آبار لكل مجموعة ليتم تحليلها. قم بتعيين 4 آبار زاوية لقياسات الخلفية.
      2. في البروتوكول، تأكد من التحقق من المعايرة والتوازن في خطوة التهيئة .
      3. بالنسبة للقياس الأساسي والقياسات بعد كل حقنة (الجلوكوز ، الأوليغومايسين ، و 2-DG) ، اضبط عدد دورات القياس على 3 و Mix - Wait - Measure Times إلى 3 min - 0 min - 3 min (انظر الجدول 2).
      4. قم بإزالة الغطاء من خرطوشة المستشعر المحملة والمائية المحملة بالمركبات والمغمورة في العيار الموجود في لوحة المرافق. ضعه على صينية العمل الخاصة بمحلل التدفق خارج الخلية وابدأ التشغيل.
        ملاحظة: الخطوة الأولى هي المعايرة، والتي تستغرق عادة حوالي 20 دقيقة.
      5. أخرج الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على الخلايا من الحاضنة غير CO 2 37 °C من الخطوة 2.4.6 بعد انتهاء 25-30 دقيقة من الحضانة. دون إزعاج الخلايا ، أضف ببطء 130 ميكرولتر من متوسط اختبار إجهاد تحلل السكر المسخن مسبقا (الرقم الهيدروجيني 7.4) لكل بئر لتكوين الحجم المتوسط في كل بئر إلى 180 ميكرولتر وإعادة اللوحة إلى حاضنة غير CO2 37 °C لمدة 15-20 دقيقة إضافية.
        ملاحظة: يفضل أن يكون إجمالي وقت الحضانة 45-60 دقيقة بعد الطرد المركزي.
      6. بعد انتهاء المعايرة ، استبدل لوحة الأداة المساعدة بلوحة الفحص الدقيقة (بدون غطاء) التي تحتوي على الخلايا. اضغط على لوحة خلية التحميل لبدء القياسات ، والتي ستستغرق ~ 1.5 ساعة لإكمال الفحص.
      7. بعد انتهاء القياسات ، قم بجمع صفيحة الفحص الدقيقة التي تحتوي على الخلايا وإزالة وسط الفحص دون إزعاج الخلايا. اغسل مرة واحدة بلطف مع 250 ميكرولتر من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات دون إزاحة الخلايا.
      8. أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RIPA (50 mM Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، 1٪ NP-40 ، 0.5 ٪ Na deoxycholate ، 0.1٪ dodecylsulfate الصوديوم ، 150 mM NaCl ، 2 mM EDTA ، 50 mM NaF) ، مع كوكتيل مثبط للبروتياز 1x ، إلى كل بئر وتحريك اللوحة على شاكر لمدة 10 دقائق. تجميد اللوحة بأكملها في -80 درجة مئوية.
      9. قم بإذابة اللوحة، وقم بإجراء فحص قياس البروتين لتطبيع البيانات باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
      10. استرداد وتحليل البيانات. افتح ملف البيانات باستخدام برنامج Wave Desktop Software. انقر فوق تطبيع ولصق قيم التطبيع لكل بئر. انقر فوق تطبيق لتطبيع البيانات. انقر فوق تصدير وحدد مولد تقرير اختبار إجهاد تحلل السكر لتصدير البيانات التي تم تحليلها إلى مولد تقرير. بدلا من ذلك، قم بتصدير البيانات إلى تطبيق خارجي.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام إجمالي محتوى الحمض النووي النووي في كل بئر لتطبيع البيانات. يمكن استخدام صبغة الفلورسنت ، مثل CyQuant التي ترتبط بالحمض النووي ، لتقييم إجمالي محتوى الحمض النووي النووي لكل بئر.
  6. إجراء اختبار إجهاد الميتوكوندريا باستخدام محلل التدفق خارج الخلية (وقت الخطوة: ~ 3 ساعات و 30 دقيقة)
    1. تحميل خرطوشة المستشعر مع مركبات الحقن
      1. تحضير 20 ميكرومتر أوليغومايسين ، 20 ميكرومتر FCCP ، و 5 ميكرومتر روتينون + 5 ميكرومتر مضاد للمايسين A حلول في وسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا قبل السخونة (درجة الحموضة 7.4).
        ملاحظة: يتم تصنيع جميع المحاليل المركبة عن طريق الحقن بتركيز 10x. وتركيزات الآبار النهائية هي 2 ميكرومتر للأوليغومايسين، و2 ميكرومتر ل FCCP، و 0.5 ميكرومتر لكل من الروتينون ومضاد المايسين A (انظر الجدول 3).
      2. قم بإزالة خرطوشة المستشعر المائي من الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية من الخطوة 1.1.5 وقم بإزالة فقاعات الهواء كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.5.1.2.
      3. باتباع الخطوات من 2.5.1.3 إلى 2.5.1.6 ، قم بتوزيع 20 ميكرولتر من 20 ميكرومتر أوليغومايسين في المنافذ A ، و 22 ميكرولتر من 20 ميكرومتر FCCP في المنافذ B ، و 25 ميكرولتر من خليط من 5 ميكرومتر من الروتينون و 5 ميكرومتر مضاد للمايسين A في المنافذ C.
        ملاحظة: من المهم أن يتم تحميل كل سلسلة منافذ من جميع الآبار البالغ عددها 96 بئرا، بما في ذلك آبار الخلفية، بالكامل بنفس الحجم من مركب الحقن.
    2. إنشاء القوالب ومعايرتها وقياساتها
      1. إنشاء أو تحميل القالب لاختبار إجهاد الميتوكوندريا على وحدة التحكم. أدخل التفاصيل المتعلقة باستراتيجيات الحقن وظروف العلاج وأنواع الخلايا، واضغط على إنشاء مجموعات. انتقل إلى خريطة اللوحة وقم بتعيين آبار لكل مجموعة ليتم تحليلها. قم بتعيين 4 آبار زاوية لقياسات الخلفية.
      2. في البروتوكول، تأكد من التحقق من المعايرة والتوازن في خطوة التهيئة.
      3. بالنسبة للقياس الأساسي والقياسات بعد كل حقنة (oligomycin، FCCP، و rotenone + antimycin A)، اضبط عدد دورات القياس على 3 و Mix - Wait - Measure Times to 3 min - 0 min - 3 min (انظر الجدول 4).
      4. ابدأ التشغيل لإجراء المعايرة كما في الخطوة 2.5.2.4.
      5. أضف 130 ميكرولتر من متوسط اختبار إجهاد الميتوكوندريا المسخن مسبقا (الرقم الهيدروجيني 7.4) لكل بئر وكذلك في الخطوة 2.5.2.5.
      6. بدء القياسات. استرداد البيانات وتحليلها كما في الخطوات من 2.5.2.6 إلى 2.5.2.10. تصدير البيانات التي تم تحليلها إلى مولد تقرير اختبار إجهاد الميتوكوندريا أو تطبيق خارجي.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحسين عدد الخلايا وتركيزات الأدوية المختلفة التي تستهدف OxPHOS (المستخدمة في اختبارات التدفق خارج الخلية) لقياس ECAR و OCR من HSPCs المعزولة من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 24 أسبوعا. أولا ، تم إجراء اختبار إجهاد تحلل السكر لتحسين عدد الخلايا وتركيز oligomycin. تم استخدام ع?...

Discussion

تصف ورقة الطريقة هذه بروتوكولا محسنا لتقييم الطاقة الحيوية الخلوية (تحلل السكر و OxPHOS) في HSPCs للفأر باستخدام محلل التدفق خارج الخلية Seahorse. هذا الجهاز هو أداة قوية تقيس في وقت واحد ECAR و OCR للخلايا الحية ، والتي هي مقاييس تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا ، على التوالي. وبالتالي ، يمكن استخدامه لت...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يتم دعم العمل في مختبر لومبارد من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIGMS R01GM101171 و NIEHS R21ES032305) ووزارة الدفاع (CA190267 و CA170628 و NF170044 و ME200030) ومؤسسة غلين للبحوث الطبية. يتم دعم العمل في مختبر Li من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NHLBI 5R01HL150707).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 μm filterCorning430626Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvateLife Technologies11360-070Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubesCorning352096Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamineLife Technologies25030-081Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)Sigma-AldrichD83753rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)Biolegend480017Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-3Component of ACK lysis buffer
Antimycin ASigma-AldrichA86743rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kitBio-Rad500-0112Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)Sigma-AldrichC29202nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-TakCorning354240Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell CounterThermoFisher ScientificFor cell counting
EDTAFisher ScientificO2793-500Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filterFisher Scientific08-771-2Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)Fisher Scientific26400044Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSSFisher Scientific14175095Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
GlucoseSigma-AldrichG7528Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
OligomycinSigma-AldrichO48762nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBSLife Technologies10010-049Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)Fisher ScientificP235-500Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Roche11836170001Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2Biolegend103203Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5Biolegend100103Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2Biolegend100243Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3Biolegend100603Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7Biolegend100703Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5Biolegend108403Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119Biolegend116203Used for lineage depletion during HSPCs harvest
RotenoneSigma-AldrichR88753rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzerSeahorse Biosciences now AgilentFor ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)FisherBP358Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)Sigma-AldrichS7920Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS8045Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)Biolegend480015Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HClFisherBP153Component of RIPA lysis buffer
XF base mediumAgilent102353-100base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep stationSeahorse BiosciencesUsed for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPakAgilent102416-100 or 102601-100Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading
drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate

References

  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250 (2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J., Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics, Fourth Edition. , 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918 (2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved