Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Özet

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Özet

Kararlı durum altında, hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) büyük ölçüde sessiz kalır ve enerjik ihtiyaçlarını karşılamak için ağırlıklı olarak glikolize bağımlı olduklarına inanılmaktadır. Bununla birlikte, enfeksiyon veya kan kaybı gibi stres koşulları altında, HSC'ler proliferatif hale gelir ve hızla aşağı akış progenitör hücreleri üretir, bu da daha da farklılaşır ve sonuçta olgun kan hücreleri üretir. Bu geçiş ve farklılaşma işlemi sırasında, HSC'ler sessizlikten çıkar ve hızla glikolizden oksidatif fosforilasyona (OxPHOS) metabolik bir geçişe uğrar. Yaşlanma, kanser, diyabet ve obezite gibi çeşitli stres koşulları, mitokondriyal fonksiyonu olumsuz yönde etkileyebilir ve böylece hematopoez sırasında HSC'lerin ve progenitörlerin metabolik yeniden programlamasını ve farklılaşmasını değiştirebilir. HSC'lerin ve progenitörlerin normal ve stres koşulları altında glikolitik ve mitokondriyal fonksiyonları hakkında değerli bilgiler, sırasıyla hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunumun göstergeleri olan hücre dışı asitleşme hızlarının (ECAR) ve oksijen tüketim oranlarının (OCR) değerlendirilmesi yoluyla elde edilebilir.

Burada, hücre dışı akı analizörü kullanılarak hem hematopoetik kök hem de ilkel progenitör hücreleri (HSPC'ler) içeren fare kemik iliği kaynaklı soy-negatif hücre popülasyonlarında ECAR ve OCR'yi ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Bu protokol, soy-negatif hücreleri fare kemik iliğinden izole etme yaklaşımlarını açıklar, hücre tohumlama yoğunluğunun optimizasyonunu ve 2-deoksi-D-glikoz (2-DG, glikolizi inhibe eden bir glikoz analoğu) ve bu tahlillerde kullanılan çeşitli OxPHOS hedefli ilaçların (oligomisin, FCCP, rotenon ve antimisin A) konsantrasyonlarını açıklar ve ilaç tedavi stratejilerini açıklar. Bu testlerde glikoliz, glikolitik kapasite ve glikolitik rezerv gibi glikolitik akının anahtar parametreleri ve bazal solunum, maksimal solunum, proton sızıntısı, ATP üretimi, yedek solunum kapasitesi ve kuplajın verimliliği gibi OxPHOS parametreleri ölçülebilir. Bu protokol, yapışkan olmayan HSPC'lerde ECAR ve OCR ölçümlerine izin verir ve her türlü süspansiyon hücresi için analiz koşullarını optimize etmek üzere genelleştirilebilir.

Giriş

Hematopoez, HSC'lerden^1'den son derece uzmanlaşmış fonksiyonlara sahip çeşitli olgun kan hücrelerinin oluşturulduğu süreçtir. HSC'ler kendini yenileme ve çeşitli multipotent ve soya özgü progenitör popülasyonlara farklılaşma yeteneğine sahiptir. Bu progenitörler nihayetinde lenfoid, miyeloid, eritroid ve megakaryosit soylarının hücrelerini üretir. Kendini yenileme kapasitelerini korumak için, HSC'ler büyük ölçüde sessiz kalır ve diğer doku kök hücreleri gibi, ATP üretimi için mitokondriyal OxPHOS yerine glikolize dayandığına inanılmaktadır ^2,3. Hücre döngüsüne giriş, gelişmiş solunum ve OxPHOS'a yol açarak, HSC bakımı ve işlevi^3'e zarar veren yüksek reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerine neden olur. Bu nedenle tekrarlanan hücre bölünmesi, HSC'lerin kendini yenileme kapasitesinin azalmasına ve nihayetinde tükenmelerine neden olabilir.

Erişkin hematopoezde, HSC'ler öncelikle asimetrik hücre bölünmesine uğrar, bu sırada yavru hücrelerden biri HSC potansiyelini korur ve glikolitik metabolizmaya güvenmeye devam eder. Diğer yavru hücre, kendini yenileme kapasitesini kaybeden ancak çoğalan ve sonunda farklılaşmış fonksiyonel hematopoetik hücrelere yol açan ilkel bir progenitör hücre haline gelir⁴. HSC'ler aşağı akış progenitörleri üretmek için farklılaştığında, HSC'lerin inaktif mitokondriyal kütleye sahip olduğu gözlemleriyle önerildiği gibi, bu hızlı geçişi desteklemek için gereken enerjiyi ve yapı taşlarını sağlamak için glikolizden mitokondriyal metabolizmaya geçişin gerçekleştiği düşünülmektedir⁵ 6,7,8,9 . Buna karşılık, mitokondriyal aktivite (bağlı ROS seviyeleri ile gösterilir), soy bağlantılı progenitörlerde HSC'lerden ^9,10,11'den çok daha yüksektir. Bu nedenle, hematopoezin en erken basamağında meydana gelen metabolik değişiklikler, HSC kaderinin düzenlenmesinde mitokondrinin doğrudan ve önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir.

Yaşlanma, kanser, diyabet ve obezite¹² gibi çeşitli stres koşulları altında ortaya çıkan işlevsiz mitokondri, HSC'nin kendini yenileme kapasitesine müdahale edebilir, aşırı miktarda ROS üreterek, ATP üretimini bozarak ve / veya diğer metabolik süreçleri değiştirerek HSC / progenitör farklılaşmasında dengesizliğe neden olabilir ^9,12,13 . HSC/progenitör farklılaşmasında metabolik homeostazdaki pertürbasyonlar hematopoezi önemli ölçüde etkileyerek hematolojik anormalliklerin gelişimine potansiyel olarak katkıda bulunabilir¹³. Glikoliz ve mitokondriyal OxPHOS'un HSC saplılığı ve farklılaşması üzerindeki kritik etkileri göz önüne alındığında, hem normal hem de stres koşulları altında metabolik parametrelerin araştırılması ilgi çekicidir. HSC'lerin ve progenitör hücrelerin glikolitik ve mitokondriyal fonksiyonlarına ilişkin değerli bilgiler, sırasıyla hücresel glikoliz ve mitokondriyal solunumun göstergeleri olan ECAR ve OCR'lerini değerlendirerek kazanılabilir.

Denizatı hücre dışı akı analizörü, canlı hücrelerde ECAR ve OCR'yi aynı anda ölçmek için kuyu başına iki prob ile donatılmış güçlü bir cihazdır ve bu nedenle çeşitli substratlara veya inhibitörlere yanıt olarak hücresel biyoenerjetik maddeleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Analizör ile birlikte kullanılan tahlil kartuşu, tahlil sırasında otomatik enjeksiyon için dört adede kadar ilacı tutacak enjeksiyon portları içerir. Tipik bir glikoliz stres testinin şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Tahlil, glutamin içeren ancak glikoz veya piruvat içermeyen glikoliz stres test ortamında inkübe edilen hücrelerin ECAR'ının ölçülmesiyle başlar. Bu, hücrelerin glikolitik olmayan aktiviteleri nedeniyle meydana gelen asitleşmeyi temsil eder ve glikolitik olmayan asitleşme olarak rapor edilir. Bunu doygun bir konsantrasyonda glikoz enjeksiyonu izler. Glikoliz yoluyla, hücredeki glikoz, laktat üretmek için sitoplazmada veya CO₂ ve su üretmek için mitokondride metabolize edilen piruvat'a dönüştürülür.

Glikozun laktata dönüştürülmesi, net üretime ve ardından protonların hücre dışı ortama salınmasına neden olur ve ECAR ^14,15,16'da hızlı bir artışa neden olur. ECAR'daki bu glukoz uyarıcı değişiklik, bazal koşullar altında glikoliz olarak bildirilmektedir. İkinci enjeksiyon, mitokondriyal ATP üretimini inhibe eden oligomisin'den (ATP sentazının bir inhibitörü, diğer adıyla kompleks V¹⁷) oluşur. Oligomisin aracılı OxPHOS inhibisyonu sırasında, hücreler enerjik taleplerini karşılamak için glikolizi maksimum düzeyde düzenler. Bu, ECAR'da daha fazla artışa neden olur ve hücrelerin maksimum glikolitik kapasitesini ortaya çıkarır. Maksimum glikolitik kapasite ile bazal glikoliz arasındaki fark glikolitik rezerv olarak adlandırılır. Son olarak, ECAR'da genellikle glikolitik olmayan asitleşme seviyelerine yakın önemli bir düşüşe neden olan 2-DG enjekte edilir. 2-DG, hekzokinaz'a rekabetçi bir şekilde bağlanan ve glikoliz^18'in inhibisyonu ile sonuçlanan bir glikoz analoğudur. Bu nedenle, ECAR'daki 2-DG kaynaklı azalma, glikolizin gerçekten glikoz ve oligomisin enjeksiyonlarından sonra gözlenen ECAR'ın kaynağı olduğunu doğrulamaktadır.

Şekil 1B , tipik bir mitokondriyal stres testinin şemasını göstermektedir. Tahlil, glikoz, glutamin ve piruvat içeren mitokondriyal stres test ortamında inkübe edilen hücrelerin temel OCR ölçümü ile başlar. Bazal OCR ölçümlerini takiben, oligomisin bu teste enjekte edilir, bu da kompleks V'yi inhibe eder, böylece elektron taşıma zinciri (ETC) boyunca elektron akışını ^azaltır17. Sonuç olarak, oligomisin enjeksiyonuna yanıt olarak OCR azalır ve OCR'deki bu azalma mitokondriyal ATP üretimi ile bağlantılıdır. İkinci enjeksiyon, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP), bir protonofor ve mitokondriyal OxPHOS^17'nin bir unkuplöründen oluşur. FCCP, mitokondriyal iç zar boyunca protonların akışına izin vererek mitokondriyal proton gradyanını çökertir. FCCP enjeksiyonu nedeniyle, ETC'den elektron akışı bastırılır ve kompleks IV maksimum seviyede oksijen tüketir. Maksimum OCR ve bazal OCR arasındaki fark, hücrenin stres koşulları altında artan enerji talebine cevap verme yeteneğinin bir ölçüsü olan yedek solunum kapasitesi olarak adlandırılır. Son olarak, iki ETC inhibitörünün (rotenon, bir kompleks I inhibitörü ve antimisin A, bir kompleks III inhibitörü¹⁷) bir karışımı enjekte edilir, bu da elektron akışını tamamen kapatır ve OCR düşük bir seviyeye düşer. Rotenon ve antimisin A enjeksiyonundan sonra ölçülen OCR, hücrelerin içindeki diğer işlemler tarafından yönlendirilen mitokondriyal olmayan OCR'ye karşılık gelir. Mitokondriyal olmayan OCR, bazal solunum, proton sızıntısı ve maksimum solunumun hesaplanmasını sağlar.

Bazal solunum, bazal OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı temsil eder. Proton sızıntısı, oligomisin enjeksiyonundan sonraki OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı ifade eder. Maksimum solunum, FCCP enjeksiyonundan sonraki OCR ile mitokondriyal olmayan OCR arasındaki farkı temsil eder. Kaplin verimliliği, ATP üretim hızının bazal solunum hızına yüzdesi olarak hesaplanır. Bu yöntem belgesi, Seahorse XFe96 hücre dışı akı analizörünü kullanarak soy negatif HSPC'lerde ECAR ve OCR'yi ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, fare soyu negatif HSPC'leri izole etme yaklaşımlarını açıklar, hücre dışı akı tahlillerinde kullanılan çeşitli ilaçların hücre tohumlama yoğunluğunun ve konsantrasyonlarının optimizasyonunu açıklar ve ilaç tedavi stratejilerini açıklar.

Protokol

Tüm omurgalı hayvan deneyleri, Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi düzenlemeleri tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir.

1. Tahlilden önceki gün (Toplam süre: ~10 dakika)

1. Sensör kartuşunun hidrasyonu (Adım süresi: ~10 dakika)
   1. Hücre dışı akı testi kitini açın ve sensör kartuşunu ve yardımcı plaka aksamını çıkarın. Yükleme kılavuzlu daireleri ertesi gün kullanmak üzere saklayın.
   2. Sensör kartuşunu (kapaklı üst yeşil kısım) yardımcı plakadan (alt 96 delikli mikro plaka) manuel olarak ayırın ve yardımcı plakanın yanına baş aşağı yerleştirin.
   3. Çok kanallı pipet kullanarak, yardımcı plakanın her bir kuyuğunu akı tahlil kitiyle birlikte verilen 200 μL kalibrant ile doldurun.
   4. Sensör kartuşunu tekrar yardımcı plakaya yerleştirin ve sensörleri kalibrant içine tamamen batırdığınızdan emin olun.
   5. Birleştirilmiş sensör kartuşunu ve kalibrantlı yardımcı plakayı gece boyunca CO₂ 37 °C olmayan bir inkübatöre yerleştirin. Kalibrantın buharlaşmasını önlemek için, inkübatörün uygun şekilde nemlendirildiğinden emin olun. CO₂ 37 °C olmayan inkübasyonlar için normal bir fırın inkübatörü kullanıyorsanız, nemlendirmek için inkübatörün içine su içeren açık bir kap yerleştirin. Varsa, CO₂ 37 °C olmayan tüm inkübasyonlar için bir XF hazırlık istasyonu kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, sensör kartuşu CO 2 37 °C olmayan bir inkübatörde kuyucuk başına₂₀₀ μL steril ultra saf su ile gece boyunca nemlendirilebilir. Suyu, 37 °C önceden ısıtılmış kalibrant kuyusu başına 200 μL ile değiştirin, tahlil gününde enjeksiyon portlarını yüklemeden en az 45-60 dakika önce.

2. Tahlil günü (Toplam süre: ~9 saat 30 dk.)

NOT: Yukarıda belirtilen toplam süre, adım 2.5 veya adım 2.6'ya ek olarak adım 2.1-2.4'ün kümülatif sürelerini içerir.

1. Hücre yapışkan kaplı mikro plakaların hazırlanması (Adım süresi: ~1 saat 30 dk.)
   NOT: Bir biyogüvenlik kabinindeki tüm adımları uygulayın.
   1. 96 kuyucuklu hücre kültürü mikroplakası başına 2,5 mL hücre yapıştırıcı çözeltisi (22,4 μg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın, 56 μg hücre yapıştırıcısını uygun bir filtre sterilize edilmiş 0,1 M sodyum bikarbonat (pH 8,0) hacminde çözün ve hemen kullanılan hücre yapışkan stoğunun hacminin yarısına 1 N sodyum hidroksit ekleyin. Vorteks veya pipet yukarı ve aşağı karıştırılır.
   2. 96 delikli hücre kültürü mikroplakasını açın (akı testi kiti ile birlikte verilir) ve hazırlanan hücre yapışkan çözeltisinin 25 μL'sini her bir kuyucuğun dibine dağıtın. Mikro plakayı kapakla örtün ve davlumbazın içindeki oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Kuluçkadan sonra, çok kanallı bir pipet veya aspiratör kullanarak fazla hücre yapışkan çözeltisini çıkarın ve atın ve her bir oyuğun 200 μL steril ultra saf su ile iki kez yıkayın. Kapağı çıkarılmış olarak plakayı, kaputun içinde 30-45 dakika boyunca hava ile kurulayın.
      NOT: Hücre yapışkanı kaplı hücre kültürü mikroplakaları 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir. 4 °C'de saklanan önceden kaplanmış mikro plakaların, hücreleri tohumlamadan önce davlumbazın içindeki oda sıcaklığına ısınmasına izin verilmelidir.
2. Tahlil ortamının hazırlanması (Adım süresi: ~30 dk.)
   1. Glikoliz stres testi test ortamının hazırlanması
      1. 100 mL baz ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL 200 mM L-glutamin ile tamamlayın.
         NOT: Tahlil ortamındaki son L-glutamin konsantrasyonu 2 mM'dir.
      2. L-glutamin takviyeli ortamı bir su banyosunda 37 ° C'ye ısıtın.
      3. Sıcak ortamın pH'ını 1 N NaOH ile 7.4'e ayarlayın.
      4. Ortamı 0,2 μm'lik bir filtreyle filtreleyerek sterilize edin ve kullanıma hazır olana kadar 37 °C'de tutun.
   2. Mitokondriyal stres testi test ortamının hazırlanması
      1. Baz ortamın 100 mL'sini 0.45 g glikoz, 1 mL 200 mM L-glutamin ve 1 mL 100 mM sodyum piruvat ile destekleyin.
         NOT: Son tahlil ortamı 25 mM glikoz, 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat içerir.
      2. Sıcak glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat takviyeli ortam bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar.
      3. Sıcak ortamın pH'ını 1 N NaOH ile 7.4'e ayarlayın.
      4. Ortamı 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin ve kullanıma hazır olana kadar 37 °C'de tutun.
3. Fare soyu negatif HSPC'leri hasat edin (Adım süresi: ~3 saat)
   1. Hank'in dengeli tuz çözeltisini% 4 fetal sığır serumu ile destekleyerek tahlil tamponunu hazırlayın. 5x stoğu steril damıtılmış suyla seyrelterek 1x zenginleştirme tamponu hazırlayın. Her iki tamponu da kullanana kadar buz üzerinde tutun.
   2. CO₂ kullanarak fareleri insani olarak ötenazi yapın, ardından servikal çıkık ve arka bacakları makasla çıkarın. Tüm dokuları kemiklerden dikkatlice çıkarın ve makas kullanarak femur ve tibianın her iki tarafındaki uçları kesin. Tahlil tamponunu kullanarak kemik iliği hücrelerini femur ve tibiadan temizleyin. Yıkanmış hücreleri steril bir 70 μm filtreden geçirin, filtrazı 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
   3. Hücre peletini 500 μL ACK tamponunda (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.2) yeniden askıya alarak kırmızı kan hücrelerini lize edin. Buz üzerinde 1 dakika boyunca lizis işleminden sonra, numuneleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da 1 mL tahlil tamponu ve santrifüj ekleyerek yıkayın. Süper natantı atın.
   4. Yıkadıktan sonra, numuneleri CD2 (1:200 seyreltme), CD3 (1:200 seyreltme), CD5 (1:200 seyreltme), CD8 (1:200 seyreltme), Ter-119 (1:200 seyreltme), B220 (1:200 seyreltme) ve Gr-1'e (1:800 seyreltme) karşı yönlendirilmiş biyotinile antikorlardan oluşan bir kokteyl ile toplam 500 μL tahlil tamponu hacminde buz üzerinde 45 dakika boyunca inkübe edin.
   5. Numuneleri yukarıdaki gibi santrifüjleme ile 1 mL tahlil tamponu ile yıkayın.
   6. Numuneleri yukarıdaki gibi santrifüjleme ile 1 mL 1x zenginleştirme tamponu ile yıkayın.
   7. Numuneleri 15 dakika boyunca buz üzerinde 20 μL streptavidin nanoboncuk ve 100 μL 1x zenginleştirme tamponu ile inkübe edin.
   8. Numuneleri yukarıdaki gibi santrifüjleme ile 1 mL 1x zenginleştirme tamponu ile yıkayın.
   9. Numuneleri 2,5 mL 1x zenginleştirme tamponunda yeniden askıya alın. Onları 5 dakika boyunca bir ayırma mıknatısına yerleştirin. Süpernatantları 15 mL konik tüplerde ayrı ayrı toplayın.
   10. Mıknatısla ayrılmış numuneleri ilave 2,5 mL 1x zenginleştirme tamponunda yeniden askıya alın ve 5 dakika boyunca tekrar ayırma mıknatısına yerleştirin. Süpernatantları 2.3.9 adımından itibaren 15 mL konik tüplerde önceki koleksiyonlara toplayın ve birleştirin.
       NOT: Süpernatantlar soy-negatif hücre fraksiyonlarını içerir.
   11. Negatif seçilmiş hücreleri içeren 15 mL konik tüpleri 4 °C'de 200 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   12. Hücre peletlerini 1 mL tahlil tamponunda yeniden askıya alın ve tripan mavisini manuel olarak kullanarak veya Kontes 3 gibi otomatik bir hücre sayacı aracılığıyla hücre numarasını sayın.
       NOT: Yukarıda açıklanan yaklaşımı takiben, ~6 × 10⁶ soy negatif HSPC'ler, tek bir farenin arka bacaklarından kolayca arındırılmalıdır. Deneyden önceki gün tahlil tamponu, 1x zenginleştirme tamponu ve soya özgü antikor kokteyli gibi reaktifler hazırlanırsa, HSPC'leri 4 fareden zenginleştirmek yaklaşık 2.5-3 saat sürer. Bu sayının ötesindeki her fare için ek 10 dakika sürer.
4. Hücre yapışkan kaplı mikroplakalardaki tohumlama hücreleri (Adım süresi: ~1 saat)
   1. 2.3.12 adımındaki hücreleri 200 × g'da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini uygun tahlil ortamında (glikoliz stres testi ortamı veya mitokondriyal stres testi ortamı) yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj.
   3. 2.4.2 adımını yineleyin. Süpernatantı çıkarın ve uygun ısıtılmış tahlil ortamındaki hücreleri, 50 μL başına 2.5 × 10⁵ hücre veya mL başına 5 × 10⁶ konsantrasyonuna kadar yeniden askıya alın.
   4. Pipet, 50 μL'lik hücre süspansiyonunun her bir kuyucuğunun yan tarafı boyunca oda sıcaklığındaki hücre yapışkanı kaplı 96 delikli hücre kültürü mikroplakasıdır. Pipet, 50 μL'lik tahlil ortamının köşe arka plan ölçüm kuyularına girer. Tutarlılığı sağlamak amacıyla hücre kaplaması için çok kanallı pipet kullanın.
   5. Kaplanmamış 96 delikli hücre kültürü mikroplakasının kuyusuna 50 μL su ekleyerek bir santrifüj denge plakası oluşturun.
   6. Plakadaki hücreleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin. Fren uygulamayın. Hücrelerin tamamen yapıştığından emin olmak için plakayı CO₂ 37 °C olmayan bir inkübatöre 25-30 dakika boyunca aktarın. Mikroskop altında, hücrelerin mikroplaka yüzeyine sabit bir şekilde yapıştığını görsel olarak onaylayın.
      NOT: ~6 × 10⁶ soy negatif HSPC'ler tek bir farenin arka bacaklarından toplanabildiğinden, amaç birden fazla müdahaleyi paralel olarak ex vivo olarak taramaksa, 4 fareden (~ 2.4 × 10⁷ hücre) izole edilmiş HSPC'lere ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, amaç genetik bir değişikliğin veya bir müdahalenin HSPC'lerin metabolik parametreleri üzerindeki etkisini in vivo olarak araştırmaksa, çoklu kontrol ve test faresi çiftlerinden izole edilen HSPC'ler, tek bir plaka kullanılarak paralel olarak birden fazla teknik kopyada analiz edilebilir.
5. Hücre dışı akı analizörü kullanılarak glikoliz stres testinin yapılması (Adım süresi: ~3 saat 30 dakika)
   1. Enjeksiyon bileşikleri içeren yükleme sensörü kartuşu
      1. Önceden ısıtılmış glikoliz stres testi ortamında (pH 7.4) 100 mM glikoz, 20 μM oligomisin ve 500 mM 2-DG çözeltileri hazırlayın.
         NOT: Tüm enjeksiyon bileşik çözeltileri 10x konsantrasyonda yapılır. Son kuyu konsantrasyonları glikoz için 10 mM, oligomisin için 2 μM ve 2-DG için 50 mM'dir (bakınız Tablo 1).
      2. Hidratlanmış sensör kartuşunu CO₂ 37 °C olmayan inkübatörden adım 1.1.5'ten çıkarın. Sensör kartuşunu kalibrandan çıkarıp kalibranla aynı yardımcı plakaya yerleştirerek yardımcı plakadaki kalibrandan hava kabarcıklarını çıkarın.
      3. A/D yükleme kılavuzunu düz bir şekilde (hücre dışı akı testi kitine dahildir) sensör kartuşunun üstüne yerleştirin ve yükleme için yalnızca A bağlantı noktalarının kullanılabilir olduğundan emin olmak için sol üst köşede 'A' harfi bulunacak şekilde yönlendirin. Çok kanallı pipet kullanarak, A bağlantı noktalarına 20 μL 100 mM glikoz çözeltisi dağıtın.
      4. A/D yükleme kılavuzunu düz bir şekilde B/C yükleme kılavuzu ile değiştirin ve yükleme için yalnızca B bağlantı noktalarının kullanılabildiğinden emin olmak için 'B' harfi sol üst köşede yer alacak şekilde yönlendirin. Çok kanallı pipet kullanarak B bağlantı noktalarına 22 μL 20 μM oligomisin çözeltisi dağıtın.
      5. Yükleme portları için sol üst köşedeki 'C' harfini bulmak üzere B/C yükleme kılavuzunu düz bir şekilde yeniden yönlendirin C. Çok kanallı bir pipet kullanarak, C bağlantı noktalarına 25 μL 500 mM 2-DG çözeltisi dağıtın.
      6. Yükleme kılavuzu dairelerini çıkarın ve atın.
         NOT: Arka plan kuyularınınkiler de dahil olmak üzere 96 kuyucuğun her bir port serisinin, enjekte eden bileşiğin aynı hacmi ile tamamen yüklenmesi önemlidir.
   2. Şablon oluşturma, kalibrasyon ve ölçümler
      1. Glikoliz stres testi için şablonu denetleyicide oluşturun veya yükleyin. Enjeksiyon stratejileri, tedavi koşulları ve hücre tipleri ile ilgili ayrıntıları girin ve gruplar oluşturmaya basın. Plaka haritasına gidin ve analiz edilecek her gruba kuyular atayın. Arka plan ölçümleri için 4 köşe kuyucuğu atayın.
      2. Protokolde, başlatma adımında kalibrasyon ve dengenin kontrol edildiğinden emin olun.
      3. Her enjeksiyondan sonra (glikoz, oligomisin ve 2-DG) temel ölçüm ve ölçümler için, ölçüm döngülerinin sayısını 3 ve Karıştır - Bekle - Ölç sürelerini 3 dakika - 0 dakika - 3 dakika olarak ayarlayın (bkz. Tablo 2).
      4. Kapağı, yardımcı plakadaki kalibranta batırılmış yüklü ve hidratlanmış sensör kartuşundan çıkarın. Hücre dışı akı analizörünün çalışma tepsisine yerleştirin ve çalıştırmaya başlayın.
         NOT: İlk adım, genellikle ~ 20 dakika süren kalibrasyondur.
      5. Hücreleri içeren mikroplakayı CO 2 37 °C olmayan inkübatörden 25-30 dakikalık inkübasyon bittikten sonra adım 2.4.6'dan çıkarın. Hücreleri rahatsız etmeden, her bir kuyucuktaki orta hacmi 180 μL'ye kadar oluşturmak için kuyucuk başına önceden ısıtılmış glikoliz stres testi test ortamından (pH 7.4) yavaşça 130 μL ekleyin ve plakayı CO₂ 37 ° C olmayan inkübatöre 15-20 dakika daha geri koyun.
         NOT: Santrifüjleme sonrası toplam 45-60 dakikalık bir inkübasyon süresi tercih edilir.
      6. Kalibrasyon bittikten sonra, yardımcı plakayı hücreleri içeren tahlil mikroplakası (kapaksız) ile değiştirin. Ölçümleri başlatmak için Yük hücre plakasına basın, bu da tahlilin tamamlanması için ~ 1,5 saat sürecektir.
      7. Ölçümler bittikten sonra, hücreleri içeren tahlil mikroplakasını toplayın ve hücreleri rahatsız etmeden tahlil ortamını çıkarın. Hücreleri yerinden çıkarmadan 250 μL 1x fosfat tamponlu salin ile bir kez nazikçe yıkayın.
      8. Her bir oyuğa 1x proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiş 10 μL RIPA lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4,% 1 NP-40,% 0,5 Na deoksikolat,% 0,1 sodyum dodesilsülfat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF) ekleyin ve plakayı 10 dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Tüm plakayı -80 °C'de dondurun.
      9. Plakayı çözün ve üreticinin talimatlarını izleyerek veri normalleştirme için bir protein ölçüm testi yapın.
      10. Verileri alın ve analiz edin. Veri dosyasını Wave Desktop Software'i kullanarak açın. Normalleştir'e tıklayın ve her bir kuyucuk için normalleştirme değerlerini yapıştırın. Verileri normalleştirmek için uygula'ya tıklayın. Dışa Aktar'a tıklayın ve analiz edilen verileri bir rapor üreticisine aktarmak için glikoliz stres testi raporu üretecini seçin. Alternatif olarak, verileri harici bir uygulamaya verin.
          NOT: Alternatif olarak, her bir kuyudaki toplam nükleer DNA içeriği, verileri normalleştirmek için kullanılabilir. Nükleik aside bağlanan CyQuant gibi bir floresan boya, kuyu başına toplam nükleer DNA içeriğini değerlendirmek için kullanılabilir.
6. Hücre dışı akı analizörü kullanılarak mitokondriyal stres testi yapılması (Adım süresi: ~3 saat 30 dakika)
   1. Enjeksiyon bileşikleri içeren yükleme sensörü kartuşu
      1. Önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi test ortamında (pH 7.4) 20 μM oligomisin, 20 μM FCCP ve 5 μM rotenon + 5 μM antimisin A çözeltileri hazırlayın.
         NOT: Tüm enjeksiyon bileşik çözeltileri 10x konsantrasyonda yapılır. Son kuyu konsantrasyonları oligomisin için 2 μM, FCCP için 2 μM ve rotenon ve antimisin A için her biri 0.5 μM'dir (bkz. Tablo 3).
      2. Hidratlanmış sensör kartuşunu 37 °C inkübatörden adım 1.1.5'ten çıkarın ve daha önce adım 2.5.1.2'de açıklandığı gibi hava kabarcıklarını çıkarın.
      3. 2.5.1.3 ila 2.5.1.6 arasındaki adımları izleyerek, A bağlantı noktalarında 20 μL 20 μM oligomisin, B bağlantı noktalarında 22 μL 20 μM FCCP ve C bağlantı noktalarında 5 μM rotenon ve 5 μM antimisin A karışımından 25 μL dağıtın.
         NOT: Arka plan kuyuları da dahil olmak üzere 96 kuyunun tümünün her port serisinin, aynı hacimdeki enjeksiyon bileşiği ile tamamen yüklenmesi önemlidir.
   2. Şablon oluşturma, kalibrasyon ve ölçümler
      1. Kontrol cihazında mitokondriyal stres testi için şablon oluşturun veya yükleyin. Enjeksiyon stratejileri, tedavi koşulları ve hücre tipleri ile ilgili ayrıntıları girin ve gruplar oluşturmaya basın. Plaka haritasına gidin ve analiz edilecek her gruba kuyular atayın. Arka plan ölçümleri için 4 köşe kuyucuğu atayın.
      2. Protokolde, başlatma adımında kalibrasyon ve dengenin kontrol edildiğinden emin olun.
      3. Her enjeksiyondan sonra (oligomisin, FCCP ve rotenon + antimisin A) temel ölçüm ve ölçümler için, ölçüm döngülerinin sayısını 3'e ve Karıştır - Bekle - Ölçüm sürelerini 3 dakika - 0 dakika - 3 dakika olarak ayarlayın (bkz. Tablo 4).
      4. Adım 2.5.2.4'teki gibi kalibrasyonu gerçekleştirmek için çalıştırmayı başlatın.
      5. Önceden ısıtılmış mitokondriyal stres testi test ortamının (pH 7.4) 130 μL'sini ve adım 2.5.2.5'te ekleyin.
      6. Ölçümleri başlatın; verileri 2.5.2.6 ila 2.5.2.10 arasındaki adımlarda olduğu gibi alın ve analiz edin. Analiz edilen verileri mitokondriyal stres testi raporu üretecine veya harici bir uygulamaya aktarın.

Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak, hücre numarası ve çeşitli OxPHOS hedefleme ilaçlarının konsantrasyonları (hücre dışı akı tahlillerinde kullanılan), 24 haftalık dişi C57BL / 6 farelerinden izole edilen HSPC'lerin ECAR ve OCR'sini ölçmek için optimize edilmiştir. İlk olarak, hücre sayısını ve oligomisin konsantrasyonunu optimize etmek için glikoliz stres testi yapıldı. Bu tahlilde kuyu başına 5 × 10⁴ ila 2,5 × 10⁵ arasında değişen sayıda HSPC kullanılmıştır.

Tartışmalar

Bu yöntem makalesi, Seahorse hücre dışı akı analizörü kullanılarak fare HSPC'lerinde hücresel biyoenerjetik (glikoliz ve OxPHOS) değerlendirilmesi için optimize edilmiş bir protokolü açıklamaktadır. Bu cihaz, sırasıyla glikoliz ve mitokondriyal solunum ölçümleri olan canlı hücrelerin ECAR ve OCR'sini aynı anda ölçen güçlü bir araçtır. Böylece, hücresel biyoenerjetik değerleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, 96 delikli mikroplaka tabanlı platform,...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate