Оценка клеточной биоэнергетики в гемопоэтических стволовых клетках мыши и примитивных клетках-предшественниках с помощью анализатора внеклеточного потока

Резюме

Метод, представленный здесь, обобщает оптимизированные протоколы оценки клеточной биоэнергетики в неадгезивных гемопоэтических стволовых и примитивных клетках-предшественниках (HSPCs) с использованием внеклеточного анализатора потоков для измерения скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) HSPC в режиме реального времени.

Аннотация

В установившемся состоянии гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) остаются в значительной степени покоящимися и, как полагают, преимущественно зависят от гликолиза для удовлетворения своих энергетических потребностей. Однако в стрессовых условиях, таких как инфекция или кровопотеря, ГСК становятся пролиферативными и быстро производят клетки-предшественники, которые, в свою очередь, дополнительно дифференцируются, в конечном итоге производя зрелые клетки крови. Во время этого процесса перехода и дифференцировки ГСК выходят из покоя и быстро подвергаются метаболическому переходу от гликолиза к окислительному фосфорилированию (OxPHOS). Различные стрессовые состояния, такие как старение, рак, диабет и ожирение, могут негативно влиять на функцию митохондрий и, таким образом, могут изменить метаболическое перепрограммирование и дифференцировку ГСК и предшественников во время кроветворения. Ценная информация о гликолитических и митохондриальных функциях ГСК и предшественников в нормальных и стрессовых условиях может быть получена путем оценки их скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR), которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно.

Здесь представлен подробный протокол для измерения ECAR и OCR в популяциях клеток, полученных из костного мозга мыши, которые включают как гемопоэтические стволовые, так и примитивные клетки-предшественники (HSPC), с использованием анализатора внеклеточного потока. Этот протокол описывает подходы к выделению линейно-отрицательных клеток из костного мозга мыши, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG, аналог глюкозы, который ингибирует гликолиз) и различных OxPHOS-таргетных препаратов (олигомицин, FCCP, ротенон и антимицин А), используемых в этих анализах, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами. Ключевые параметры гликолитического потока, такие как гликолиз, гликолитическая емкость и гликолитический резерв, а также параметры OxPHOS, такие как базальное дыхание, максимальное дыхание, утечка протонов, производство АТФ, резервная дыхательная способность и эффективность связи, могут быть измерены в этих анализах. Этот протокол позволяет проводить измерения ECAR и OCR на неадгезивных HSPC и может быть обобщен для оптимизации условий анализа для любого типа суспензионных клеток.

Введение

Кроветворение – это процесс, посредством которого из ГСК 1 образуются различные типы зрелых клеток крови с узкоспециализированными^{функциями}. ГСК способны к самообновлению и дифференциации в различные мультипотентные и родословные популяции-прародители. Эти предшественники в конечном итоге продуцируют клетки лимфоидных, миелоидных, эритроидных и мегакариоцитарных линий. Чтобы сохранить свою способность к самообновлению, ГСК остаются в значительной степени спокойными и, как и другие тканевые стволовые клетки, полагаются на гликолиз, а не на митохондриальный OxPHOS для производства АТФ ^2,3. Вступление в клеточный цикл приводит к усилению дыхания и OxPHOS, что приводит к повышенным уровням активных форм кислорода (АФК), которые наносят ущерб поддержанию HSC и функции³. Повторное деление клеток, таким образом, может привести к снижению самообновляющейся способности ГСК и, в конечном счете, к их истощению.

При взрослом кроветворении ГСК в первую очередь подвергаются асимметричному делению клеток, в ходе которого одна из дочерних клеток сохраняет потенциал ГСК и продолжает полагаться на гликолитический метаболизм. Другая дочерняя клетка становится примитивной клеткой-предшественником, которая теряет способность к самообновлению, но размножается и в конечном итоге приводит к дифференцированным функциональным кроветворным клеткам⁴. Когда ГСК дифференцируются для производства последующих предшественников, считается, что происходит переход от гликолиза к митохондриальному метаболизму для снабжения энергией и строительными блоками, необходимыми для поддержки этого быстрого перехода⁵, как показывают наблюдения, что ГСК обладают неактивной митохондриальной массой ^6,7,8,9 . Напротив, митохондриальная активность (обозначенная связанными уровнями АФК) намного выше у прародителей, зафиксированных линией, чем у ГСК ^9,10,11. Метаболические изменения, которые происходят на самом раннем этапе кроветворения, таким образом, предполагают прямую и решающую роль митохондрий в регулировании судьбы ГСК.

Дисфункциональные митохондрии, присутствующие в различных стрессовых условиях, таких как старение, рак, диабет и ожирение¹², могут мешать способности к самообновлению HSC, вызывая дисбаланс в дифференциации HSC / прародителя путем производства чрезмерного количества АФК, нарушения производства АТФ и / или путем изменения других метаболических процессов ^9,12,13 . Возмущения метаболического гомеостаза при дифференцировке ГСК/предшественника могут существенно влиять на кроветворение, потенциально способствуя развитию гематологических аномалий¹³. Учитывая критическое влияние гликолиза и митохондриального OxPHOS на стволовость и дифференцировку HSC, представляет интерес исследование как метаболических параметров в нормальных, так и в стрессовых условиях. Ценную информацию о гликолитической и митохондриальной функции ГСК и клеток-предшественников можно получить, оценив их ECAR и OCR, которые являются показателями клеточного гликолиза и митохондриального дыхания соответственно.

Внеклеточный анализатор потока Seahorse представляет собой мощный аппарат, оснащенный двумя зондами на скважину для одновременного измерения ECAR и OCR в живых клетках и, таким образом, может использоваться для оценки клеточной биоэнергетики в режиме реального времени в ответ на различные субстраты или ингибиторы. Пробирный картридж, используемый с анализатором, содержит инъекционные порты для удержания до четырех препаратов для автоматической инъекции во время анализа. Схема типичного гликолизного стресс-теста показана на фиг.1А. Анализ начинается с измерения ECAR клеток, инкубированных в среде гликолизного стресс-теста, содержащей глютамин, но не глюкозу или пируват. Это представляет собой подкисление, происходящее из-за негликолитической активности клеток, и сообщается как негликолитическое подкисление. За этим следует инъекция глюкозы в насыщенной концентрации. Посредством гликолиза глюкоза в клетке превращается в пируват, который далее метаболизируется в цитоплазме с образованием лактата или в митохондриях для производства CO₂ и воды.

Превращение глюкозы в лактат вызывает чистую выработку и последующее высвобождение протонов во внеклеточную среду, что приводит к быстрому увеличению ECAR 14,15,16. Это стимулируемое глюкозой изменение ECAR сообщается как гликолиз в базальных условиях. Вторая инъекция состоит из олигомицина (ингибитор АТФ-синтазы, также известного как комплекс V¹⁷), который ингибирует выработку митохондриальной АТФ. Во время олигомицин-опосредованного ингибирования OxPHOS клетки максимально усиливают гликолиз для удовлетворения своих энергетических потребностей. Это вызывает дальнейшее увеличение ECAR, выявляя максимальную гликолитическую емкость клеток. Разница между максимальной гликолитической емкостью и базальным гликолизом называется гликолитическим резервом. Наконец, вводится 2-DG, что вызывает значительное падение ECAR, обычно близкое к уровням негликолитического подкисления. 2-DG является аналогом глюкозы, который конкурентно связывается с гексокиназой, что приводит к ингибированию гликолиза¹⁸. Таким образом, 2-DG-индуцированное снижение ECAR еще раз подтверждает, что гликолиз действительно является источником ECAR, наблюдаемым после инъекций глюкозы и олигомицина.

На рисунке 1B показана схема типичного митохондриального стресс-теста. Анализ начинается с базового измерения OCR клеток, инкубированных в митохондриальной стресс-тестовой среде, содержащей глюкозу, глютамин и пируват. После базальных измерений OCR в этот анализ вводится олигомицин, который ингибирует комплекс V, тем самым уменьшая поток электронов через цепь переноса электронов (ETC)¹⁷. Следовательно, OCR снижается в ответ на инъекцию олигомицина, и это снижение OCR связано с митохондриальной продукцией АТФ. Вторая инъекция состоит из карбонильного цианида-4 (трифторметокси) фенилгидразона (FCCP), протонофора и разъединителя митохондриального OxPHOS¹⁷. FCCP разрушает митохондриальный протонный градиент, позволяя потоку протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Из-за впрыска FCCP поток электронов через внеземные цивилизации дерепрессируется, и комплекс IV потребляет кислород на максимальном уровне. Разница между максимальным OCR и базальным OCR называется запасной дыхательной способностью, которая является мерой способности клетки реагировать на повышенную потребность в энергии в условиях стресса. Наконец, вводится смесь двух ингибиторов ETC (ротенон, ингибитор комплекса I, и антимицин А, комплексный ингибитор III¹⁷), который полностью отключает поток электронов, и OCR снижается до низкого уровня. OCR, измеренный после инъекции ротенона и антимицина А, соответствует немитохондриальному OCR, вызванному другими процессами внутри клеток. Немитохондриальный OCR позволяет рассчитать базальное дыхание, утечку протонов и максимальное дыхание.

Базальное дыхание представляет собой разницу между базовым OCR и немитохондриальным OCR. Протонная утечка относится к разнице между OCR после инъекции олигомицина и немитохондриальной OCR. Максимальное дыхание представляет собой разницу между OCR после инъекции FCCP и немитохондриальным OCR. Эффективность соединения рассчитывается как процентное отношение скорости производства АТФ к скорости базального дыхания. В этом методе представлен подробный протокол измерения ECAR и OCR в отрицательных HSPC с использованием внеклеточного анализатора потока Seahorse XFe96. Этот протокол описывает подходы к выделению мышиных линионно-отрицательных HSPC, объясняет оптимизацию плотности посева клеток и концентраций различных препаратов, используемых во внеклеточных анализах потока, и описывает стратегии лечения лекарственными средствами.

протокол

Все эксперименты с позвоночными на животных были одобрены и выполнены в соответствии с правилами Комитета Мичиганского университета по использованию и уходу за животными.

1. За день до анализа (Общее время: ~10 мин)

1. Гидратация картриджа датчика (время шага: ~10 мин)
   1. Откройте комплект для анализа внеклеточного флюса и извлеките картридж датчика и узел полезной пластины. Сохраните погрузочно-разгрузочные квартиры для использования на следующий день.
   2. Вручную отделите картридж датчика (верхняя зеленая часть с крышкой) от вспомогательной пластины (нижняя 96-луночная микроплита) и поместите его вверх ногами рядом с полезной пластиной.
   3. Используя многоканальную пипетку, заполните каждую скважину полезной пластины калибром 200 мкл, входящим в комплект для анализа потока.
   4. Поместите картридж датчика обратно на полезную пластину, убедившись, что датчики полностью погружены в калибрант.
   5. Поместите собранный картридж датчика и пластину с калибром в инкубатор без CO₂ 37 °C на ночь. Чтобы предотвратить испарение калибранта, убедитесь, что инкубатор должным образом увлажнен. Если вы используете обычный инкубатор для инкубации без CO₂ 37 °C, поместите открытый стакан, содержащий воду, внутри инкубатора, чтобы увлажнить его. Если доступно, используйте станцию подготовки XF для всех инкубаций без CO₂ 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, картридж датчика может быть гидратирован в течение ночи с 200 мкл на лунку стерильной сверхчистой воды в инкубаторе без CO₂ 37 °C. Замените воду на 200 мкл на скважину с предваренным калибрантом 37 °C, по крайней мере, за 45-60 минут до загрузки инжекционных отверстий в день анализа.

2. День анализа (Общее время: ~9 ч 30 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время, указанное выше, включает совокупную продолжительность этапов 2.1-2.4 в дополнение к этапу 2.5 или этапу 2.6.

1. Приготовление микропластин с клеточным адгезионным покрытием (время шага: ~1 ч 30 мин)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги в шкафу биобезопасности.
   1. Готовят 2,5 мл клеточного адгезивного раствора (22,4 мкг/мл, см. Таблицу материалов) на 96-луночную микропластинку клеточной культуры, растворяя 56 мкг клеточного клея в соответствующем объеме стерилизованного фильтром 0,1 М бикарбоната натрия (рН 8,0) и сразу добавляя 1 Н гидроксида натрия в половину объема используемого клеточного клеевого материала. Вихрь или пипетка вверх и вниз для смешивания.
   2. Откройте микропластину клеточной культуры из 96 лунок (входит в комплект для анализа потока) и дозируйте 25 мкл подготовленного клеточного адгезивного раствора на дне каждой лунки. Накройте микропластин крышкой и высиживайте в течение 30 мин при комнатной температуре внутри вытяжки.
   3. После инкубации удалите и выбросьте избыток клеточного клеевого раствора с помощью многоканальной пипетки или аспиратора и дважды промыть каждую лунку 200 мкл стерильной сверхчистой воды. Высушите пластину на воздухе, со снятой крышкой, внутри вытяжки в течение 30-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микропластины клеточных культур с клеточным адгезионным покрытием могут храниться до одной недели при температуре 4 °C. Предварительно покрытым микропластинкам, хранящимся при температуре 4 °C, необходимо дать нагреться до комнатной температуры внутри вытяжки перед посевом клеток.
2. Подготовка пробирной среды (Время шага: ~30 мин)
   1. Подготовка среды для анализа гликолизного стресс-теста
      1. Дополнить 100 мл базовой среды (см. Таблицу материалов) 1 мл 200 мМ L-глутамина.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация L-глутамина в пробирной среде составляет 2 мМ.
      2. Нагрейте L-глютаминовую среду до 37 °C на водяной бане.
      3. Отрегулируйте рН теплой среды до 7,4 с 1 Н NaOH.
      4. Фильтруйте и стерилизуйте среду фильтром 0,2 мкм и держите ее при температуре 37 °C до готовности к использованию.
   2. Подготовка среды для анализа митохондриального стресс-теста
      1. Дополнить 100 мл базовой среды 0,45 г глюкозы, 1 мл 200 мМ L-глутамина и 1 мл 100 мМ пирувата натрия.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная среда для анализа содержит 25 мМ глюкозы, 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия.
      2. Теплая глюкоза, L-глютамин и среда, дополненная пируватом натрия, до 37 °C на водяной бане.
      3. Отрегулируйте рН теплой среды до 7,4 с 1 Н NaOH.
      4. Фильтрующую стерилизующую среду с фильтром 0,2 мкм и выдерживайте при температуре 37 °C до готовности к использованию.
3. Сбор отрицательной линии мыши HSPCs (время шага: ~3 ч)
   1. Подготовьте буфер анализа, дополнив сбалансированный солевой раствор Хэнка 4% фетальной бычьей сывороткой. Приготовьте 1-кратный буфер обогащения, разбавив 5-кратный бульон стерильной дистиллированной водой. Держите оба буфера на льду до использования.
   2. Гуманно усыпляйте мышей с помощью CO₂ с последующим вывихом шейки матки и удаляйте задние конечности ножницами. Аккуратно извлеките все ткани из костей, а концы с обеих сторон бедренной и большеберцовой костей обрежьте ножницами. Вымывайте клетки костного мозга из бедренной и большеберцовой костей с помощью буфера анализа. Пропустите промытые клетки через стерильный фильтр 70 мкм, центрифугируйте фильтрат при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C и выбросьте супернатант.
   3. Лизируют эритроциты путем повторного использования клеточной гранулы в 500 мкл буфера ACK (150 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,2). После лизиса в течение 1 мин на льду промыть образцы, добавив 1 мл пробного буфера и центрифуги при 200 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
   4. После промывки инкубируют образцы коктейлем из биотинилированных антител, направленных против CD2 (разведение 1:200), CD3 (разведение 1:200), CD5 (разведение 1:200), CD8 (разведение 1:200), Ter-119 (разведение 1:200), B220 (разведение 1:200) и Gr-1 (разведение 1:800) в течение 45 мин на льду в общем объеме 500 мкл пробного буфера.
   5. Промывайте образцы 1 мл пробного буфера центрифугированием, как указано выше.
   6. Промыть образцы 1 мл 1x буфера обогащения центрифугированием, как указано выше.
   7. Инкубируйте образцы с 20 мкл наношарик стрептавидина и 100 мкл 1x обогащения буфера на льду в течение 15 мин.
   8. Промыть образцы 1 мл 1x буфера обогащения центрифугированием, как указано выше.
   9. Повторное суспендирование образцов в 2,5 мл 1-кратного буфера обогащения. Поместите их на разделительный магнит на 5 мин. Соберите супернатанты отдельно в конические пробирки по 15 мл.
   10. Повторно суспендируйте образцы, разделенные магнитами, в дополнительные 2,5 мл 1-кратного буфера обогащения и поместите их снова на разделительный магнит в течение 5 минут. Собирайте и комбинируйте супернатанты с предыдущими коллекциями в конических трубках по 15 мл с этапа 2.3.9.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатанты содержат линейно-отрицательные клеточные фракции.
   11. Центрифугируют конические трубки объемом 15 мл, содержащие отрицательно отобранные клетки, в течение 5 мин при 200 × г при 4 °С.
   12. Повторно суспендируйте гранулы клеток в 1 мл буфера анализа и подсчитайте номер ячейки с помощью трипан-синего вручную или с помощью автоматизированного счетчика клеток, такого как Countess 3.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Следуя вышеописанному подходу, ~6 × 10⁶ отрицательных по линии HSPC должны быть легко очищены от задних конечностей одной мыши. Если реагенты, такие как буфер анализа, 1-кратный буфер обогащения и коктейль из специфических для линии антител, приготовлены за день до эксперимента, для обогащения HSPC у 4 мышей требуется примерно 2,5-3 ч. Это займет дополнительные 10 минут для каждой мыши сверх этого числа.
4. Посев клеток в микропластинках с клеевым покрытием (время шага: ~1 ч)
   1. Центрифужные ячейки со стадии 2.3.12 при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующей пробирной среде (среде для гликолизного стресс-теста или митохондриальной стресс-тестовой среде). Центрифуга по 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Повторите шаг 2.4.2. Удаляют надосадочную массу и повторно суспендируют клетки в соответствующей подогретой пробирной среде до концентрации 2,5 × 10⁵ клеток на 50 мкл или 5 × 10⁶ на мл.
   4. Пипетка 50 мкл клеточной суспензии вдоль боковой стороны каждой лунки микропластины клеточной культуры с клеевым покрытием комнатной температуры. Пипетка 50 мкл пробирной среды в угловые фоновые измерительные колодцы. Используйте многоканальную пипетку для покрытия ячеек для обеспечения согласованности.
   5. Создайте балансовую пластину центрифуги, добавив 50 мкл воды на лунку микропластины культуры клеток без покрытия из 96 лунок.
   6. Центрифугируют ячейки в пластине при 200 × г в течение 1 мин при комнатной температуре. Не применяйте тормоза. Переложите пластину в инкубатор без CO₂ 37 °C в течение 25-30 минут, чтобы убедиться, что клетки полностью прикреплены. Визуально подтвердить под микроскопом, что клетки стабильно прилипают к поверхности микропластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ~6 × 10⁶ отрицательных по линии HSPC могут быть собраны из задних конечностей одной мыши, HSPC, выделенные из 4 мышей (~ 2,4 × 10⁷ клеток), необходимы для заполнения всей 96-луночной пластины, если цель состоит в том, чтобы экранировать несколько вмешательств ex vivo параллельно. Однако, если цель состоит в том, чтобы исследовать влияние генетического изменения или вмешательства на метаболические параметры HSPC in vivo, то HSPC, выделенные из нескольких пар контрольных и тестовых мышей, могут быть проанализированы в нескольких технических репликах параллельно с использованием одной пластины.
5. Выполнение гликолизного стресс-теста с использованием внеклеточного анализатора потока (время шага: ~3 ч 30 мин)
   1. Картридж с датчиком загрузки с инжекторными составами
      1. Приготовьте 100 мМ глюкозы, 20 мкМ олигомицина и 500 мМ 2-DG растворов в предварительной гликолизной стресс-тестовой среде (рН 7,4).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекционные растворы соединений изготавливаются в 10-кратной концентрации. Конечные концентрации в скважине составляют 10 мМ для глюкозы, 2 мкМ для олигомицина и 50 мМ для 2-ДГ (см. Таблицу 1).
      2. Извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора без CO₂ 37 °C на этапе 1.1.5. Удалите пузырьки воздуха из калибранта в вспомогательной пластине, подняв картридж датчика из калибранта и заменив его на ту же полезную пластину с калибрантом.
      3. Поместите направляющую A/D заряжания плоской (входит в комплект для анализа внеклеточного потока) в верхней части картриджа датчика, ориентируя ее так, чтобы буква «A» располагалась в верхнем левом углу, чтобы обеспечить доступ только порты A для загрузки. Используя многоканальную пипетку, дозируют 20 мкл раствора глюкозы 100 мМ в портах А.
      4. Замените направляющую загрузки A/D плоской на плоскую направляющую загрузки B/C, ориентируясь таким образом, чтобы буква «B» располагалась в верхнем левом углу, чтобы обеспечить наличие для погрузки только портов B. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 22 мкл раствора олигомицина 20 мкМ в портах B.
      5. Переориентируйте направляющую загрузки B/C, чтобы найти букву «C» в верхнем левом углу для портов загрузки C. Используя многоканальную пипетку, дозируйте 25 мкл 500 мМ раствора 2-DG в портах C.
      6. Снимите и выбросьте плоские направляющие погрузки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы каждая портовая серия всех 96 скважин, включая фоновые скважины, была полностью загружена одним и тем же объемом закачиваемого соединения.
   2. Создание, калибровка и измерения шаблонов
      1. Создайте или загрузите шаблон для нагрузочного теста гликолиза на контроллере. Введите подробную информацию о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а также нажмите создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа. Назначьте 4 угловых колодца для фоновых измерений.
      2. В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации .
      3. Для исходных измерений и измерений после каждой инъекции (глюкоза, олигомицин и 2-ДГ) установите число циклов измерения равным 3 и Mix - Wait - Measure times до 3 мин - 0 мин - 3 мин (см. Таблицу 2).
      4. Снимите крышку с нагруженного и гидратированного картриджа датчика, погруженного в калибр в полезную пластину. Поместите его на рабочий лоток внеклеточного анализатора потока и начните запуск.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Первым шагом является калибровка, которая обычно занимает ~ 20 минут.
      5. Извлеките микропластину, содержащую клетки, из инкубатора без CO₂ 37 °C со стадии 2.4.6 после окончания 25-30 мин инкубации. Не нарушая работу клеток, медленно добавляют 130 мкл предварительной гликолизной стресс-тестовой среды (рН 7,4) на лунку, чтобы восполнить объем среды в каждой лунке до 180 мкл и вернуть пластину в инкубатор без CO₂ 37 °C в течение дополнительных 15-20 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно общее время инкубации 45-60 мин после центрифугирования.
      6. После завершения калибровки замените полезную пластину на микропластинку анализа (без крышки), содержащую ячейки. Нажмите на пластину тензодатчика, чтобы начать измерения, которые займут ~1,5 ч для завершения анализа.
      7. После того, как измерения завершены, соберите микропластинку анализа, содержащую клетки, и удалите среду анализа, не нарушая клетки. Один раз осторожно промыть 250 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора без смещения клеток.
      8. Добавьте 10 мкл буфера лизиса RIPA (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5 % Na дезоксихолата, 0,1% додецилсульфата натрия, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ NaF), дополненного коктейлем ингибитора протеазы по 1x, и перемешайте пластину на шейкере в течение 10 мин. Заморозьте всю пластину при -80 °C.
      9. Разморозьте пластину и выполните анализ измерения белка для нормализации данных в соответствии с инструкциями производителя.
      10. Извлеките и проанализируйте данные. Откройте файл данных с помощью программного обеспечения Wave Desktop. Нажмите « Нормализовать» и вставьте значения нормализации для каждой скважины. Нажмите кнопку Применить , чтобы нормализовать данные. Нажмите « Экспорт» и выберите генератор отчетов о нагрузочных тестах на гликолиз , чтобы экспортировать проанализированные данные в генератор отчетов. Кроме того, можно экспортировать данные во внешнее приложение.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, общее содержание ядерной ДНК в каждой скважине может быть использовано для нормализации данных. Флуоресцентный краситель, такой как CyQuant, который связывается с нуклеиновой кислотой, может быть использован для оценки общего содержания ядерной ДНК в лунке.
6. Выполнение митохондриального стресс-теста с использованием анализатора внеклеточного потока (время шага: ~3 ч 30 мин)
   1. Картридж с датчиком загрузки с инжекторными составами
      1. Приготовьте 20 мкМ олигомицина, 20 мкМ FCCP и 5 мкМ растворов ротенона + 5 мкМ антимицина А в предварительной митохондриальной среде для анализа стресса (рН 7,4).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекционные растворы соединений изготавливаются в 10-кратной концентрации. Конечные концентрации в скважине составляют 2 мкМ для олигомицина, 2 мкМ для FCCP и по 0,5 мкМ для ротенона и антимицина А (см. таблицу 3).
      2. Извлеките гидратированный картридж датчика из инкубатора с температурой 37 °C на этапе 1.1.5 и удалите пузырьки воздуха, как описано ранее на этапе 2.5.1.2.
      3. Выполнив этапы 2.5.1.3-2.5.1.6, дозируют 20 мкл 20 мкМ олигомицина в портах А, 22 мкл 20 мкМ FCCP в портах В и 25 мкл смеси ротенона 5 мкМ и антимицина А 5 мкМ в портах С.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы каждая портовая серия всех 96 скважин, включая скважины фоновых скважин, была полностью загружена одинаковым объемом нагнетательного соединения.
   2. Создание, калибровка и измерения шаблонов
      1. Создайте или загрузите шаблон для митохондриального стресс-теста на контроллере. Введите подробную информацию о стратегиях инъекций, условиях лечения и типах клеток, а также нажмите создать группы. Перейдите к карте плит и назначьте скважины каждой группе для анализа. Назначьте 4 угловых колодца для фоновых измерений.
      2. В протоколе убедитесь, что калибровка и уравновешивание проверены на этапе инициализации.
      3. Для исходных измерений и измерений после каждой инъекции (олигомицин, FCCP и ротенон + антимицин А) установите число циклов измерения равным 3 и Mix - Wait - Время измерения до 3 мин - 0 мин - 3 мин (см. Таблицу 4).
      4. Запустите запуск для выполнения калибровки, как показано в шаге 2.5.2.4.
      5. Добавьте 130 мкл предварительной митохондриальной среды для анализа стресса (рН 7,4) на шаг 2.5.2.5.
      6. Начните измерения; извлекать и анализировать данные, как указано в шагах 2.5.2.6-2.5.2.10. Экспортируйте проанализированные данные в генератор отчетов о митохондриальном стресс-тесте или во внешнее приложение.

Результаты

Используя этот протокол, количество клеток и концентрации различных препаратов, нацеленных на OxPHOS (используемых во внеклеточных анализах потока), были оптимизированы для измерения ECAR и OCR HSPC, выделенных у 24-недельных самок мышей C57BL/6. Во-первых, был проведен гликолизный стресс-тест для о...

Обсуждение

В данной методической работе описан оптимизированный протокол оценки клеточной биоэнергетики (гликолиз и OxPHOS) в мышиных HSPCs с использованием анализатора внеклеточного потока Seahorse. Это устройство является мощным инструментом, который одновременно измеряет ECAR и OCR живых клеток, которые...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate