הערכה של ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים ובתאי אב פרימיטיביים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי

Summary

השיטה המוצגת כאן מסכמת פרוטוקולים ממוטבים להערכת ביו-אנרגיה תאית בגזע המטופויאטי של עכברים שאינם דבקים ובתאי אב פרימיטיביים (HSPCs) תוך שימוש במנתח השטף החוץ-תאי כדי למדוד את קצב ההחמצה החוץ-תאית (ECAR) ואת קצב צריכת החמצן (OCR) של HSPCs בזמן אמת.

Abstract

במצב יציב, תאי גזע המטופויאטיים (HSCs) נשארים במידה רבה שקטים ומאמינים שהם מסתמכים בעיקר על גליקוליזה כדי לענות על הצרכים האנרגטיים שלהם. עם זאת, בתנאי עקה כגון זיהום או אובדן דם, HSCs מתרבים ומייצרים במהירות תאי אב במורד הזרם, אשר בתורם מתמיינים עוד יותר, ובסופו של דבר מייצרים תאי דם בוגרים. במהלך תהליך המעבר וההתמיינות הזה, HSCs יוצאים מ-quiescence ועוברים במהירות מעבר מטבולי מגליקוליזה לזרחון חמצוני (OxPHOS). מצבי עקה שונים, כגון הזדקנות, סרטן, סוכרת והשמנת יתר, יכולים להשפיע לרעה על תפקוד המיטוכונדריה ולכן יכולים לשנות את התכנות מחדש וההבחנה המטבולית של HSCs ואבות קדמונים במהלך hematopoiesis. תובנות חשובות על תפקודים גליקוליטיים ומיטוכונדריים של HSCs ואבות אבות בתנאים רגילים ובתנאים של לחץ ניתן להשיג באמצעות הערכת קצב ההחמצה החוץ-תאית שלהם (ECAR) וקצב צריכת החמצן (OCR), שהם אינדיקטורים לגליקוליזה תאית ולנשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה.

כאן, פרוטוקול מפורט מסופק למדידת ECAR ו- OCR באוכלוסיות תאים שליליות ממח עצם עכבר, הכוללות הן גזע המטופויאטי והן תאי אב פרימיטיביים (HSPCs), באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי. פרוטוקול זה מתאר גישות לבידוד תאים שליליים לשושלת ממח העצם של העכבר, מסביר אופטימיזציה של צפיפות זריעת תאים וריכוזים של 2-דאוקסי-D-גלוקוז (2-DG, אנלוגי גלוקוז המעכב גליקוליזה) ותרופות שונות ממוקדות OxPHOS (אוליגומיצין, FCCP, רוטנון ואנטימיצין A) המשמשות במבחנים אלה, ומתאר אסטרטגיות טיפול תרופתיות. ניתן למדוד פרמטרים מרכזיים של שטף גליקוליטי, כגון גליקוליזה, קיבולת גליקוליטית ורזרבה גליקוליטית, ופרמטרים של OxPHOS, כגון נשימה בסיסית, נשימה מקסימלית, דליפת פרוטונים, ייצור ATP, קיבולת נשימתית רזרבית ויעילות צימוד. פרוטוקול זה מאפשר מדידות ECAR ו- OCR על HSPCs שאינם דבקים וניתן להכליל אותו כדי למטב את תנאי הניתוח עבור כל סוג של תאי השעיה.

Introduction

Hematopoiesis הוא התהליך שבו סוגים שונים של תאי דם בוגרים עם פונקציות מיוחדות מאוד נוצרים מ HSCs¹. HSCs מסוגלים להתחדשות עצמית והתמיינות לאוכלוסיות אבות רב-תכליתיות וספציפיות שונות. אבות אלה מייצרים בסופו של דבר תאים של שושלות לימפואידיות, מיאלואידיות, אריתרואידיות ומגקריוציטים. כדי לשמור על יכולת ההתחדשות העצמית שלהם, HSCs נשארים שקטים במידה רבה, וכמו תאי גזע אחרים ברקמות, מאמינים שהם מסתמכים על גליקוליזה ולא על OxPHOS מיטוכונדריאלי לייצור ATP ^2,3. כניסה למחזור התאים מובילה לנשימה מוגברת ול-OxPHOS, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של מיני חמצן תגובתי (ROS), המזיקים לתחזוקת HSC ולתפקוד³. חלוקה חוזרת ונשנית של התאים עשויה אפוא להוביל לירידה ביכולת ההתחדשות העצמית של HSCs ובסופו של דבר לתשישותם.

בהמטופואיזיס בוגר, HSCs עוברים בעיקר חלוקת תאים אסימטרית, שבמהלכה אחד מתאי הבת שומר על פוטנציאל HSC וממשיך להסתמך על חילוף החומרים הגליקוליטי. תא הבת השני הופך לתא אב פרימיטיבי שמאבד את יכולת ההתחדשות העצמית אך מתרבה ובסופו של דבר יוצר תאים המטופויאטיים תפקודיים מתמיינים⁴. כאשר HSCs מתמיינים כדי לייצר אבות במורד הזרם, מעריכים כי מעבר מגליקוליזה לחילוף חומרים מיטוכונדריאלי מתרחש כדי לספק את האנרגיה ואבני הבניין הדרושות כדי לתמוך במעבר מהיר זה⁵, כפי שהוצע על ידי התצפיות כי HSCs הם בעלי מסה מיטוכונדריאלית לא פעילה ^6,7,8,9 . לעומת זאת, פעילות מיטוכונדריאלית (המסומנת על ידי רמות ROS מקושרות) גבוהה בהרבה אצל אבות המחויבים לשושלת מאשר ב-HSCs ^9,10,11. שינויים מטבוליים המתרחשים במהלך השלב המוקדם ביותר של hematopoiesis ולכן מציעים תפקיד ישיר וחיוני של המיטוכונדריה בוויסות גורל HSC.

מיטוכונדריה לא מתפקדת הקיימת בתנאי עקה שונים, כגון הזדקנות, סרטן, סוכרת והשמנת יתר¹², עלולה להפריע ליכולת ההתחדשות העצמית של HSC, ולגרום לחוסר איזון בהתמיינות HSC/אבות על ידי ייצור כמויות מופרזות של ROS, פגיעה בייצור ATP ו/או על ידי שינוי תהליכים מטבוליים אחרים ^9,12,13 . הפרעות בהומאוסטזיס מטבולי ב-HSC/התמיינות אבות עלולות להשפיע באופן משמעותי על ההמטופואיזיס, מה שעשוי לתרום להתפתחות הפרעות המטולוגיות¹³. בהתחשב בהשפעות הקריטיות של הגליקוליזה והמיטוכונדריאלית OxPHOS על גזע והבחנה של HSC, מעניין לחקור הן פרמטרים מטבוליים בתנאי שגרה והן בתנאי לחץ. ניתן לקבל תובנות חשובות על התפקוד הגליקוליטי והמיטוכונדריאלי של HSCs ותאי אב על ידי הערכת ה-ECAR וה-OCR שלהם, שהם אינדיקטורים לגליקוליזה תאית ולנשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה.

מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים הוא מנגנון רב עוצמה המצויד בשתי בדיקות לכל באר כדי למדוד בו זמנית ECAR ו- OCR בתאים חיים ולכן ניתן להשתמש בו כדי להעריך ביו-אנרגיה תאית בזמן אמת, בתגובה למצעים או מעכבים שונים. מחסנית הבדיקה המשמשת את המנתח מכילה יציאות הזרקה להחזקת עד ארבע תרופות להזרקה אוטומטית במהלך הבדיקה. סכימה של בדיקת מאמץ טיפוסית לגליקוליזה מוצגת באיור 1A. הבדיקה מתחילה במדידת ECAR של תאים, דגירה במדיום בדיקת מאמץ גליקוליזה המכיל גלוטמין אך לא גלוקוז או פירובט. הדבר מייצג החמצה המתרחשת עקב פעילות לא גליקוליטית של התאים ומדווחת כהחמצה לא גליקוליטית. זה ואחריו הזרקת גלוקוז בריכוז רווי. באמצעות גליקוליזה, גלוקוז בתא מומר לפירובט, אשר עובר מטבוליזם נוסף בציטופלסמה כדי לייצר לקטט, או במיטוכונדריה כדי לייצר CO₂ ומים.

המרה של גלוקוז לקטט גורמת לייצור נטו ולשחרור נוסף של פרוטונים לתוך המדיום החוץ-תאי, וכתוצאה מכך לעלייה מהירה ב-ECAR 14,15,16. שינוי זה המעורר גלוקוז ב-ECAR מדווח כגליקוליזה בתנאים בסיסיים. הזריקה השנייה מורכבת מאוליגומיצין (מעכב של ATP סינתאז, א.ק.א. קומפלקס V¹⁷), המעכב ייצור ATP מיטוכונדריאלי. במהלך עיכוב OxPHOS בתיווך אוליגומיצין, התאים מווסתים את הגליקוליזה באופן מרבי כדי לענות על הדרישות האנרגטיות שלהם. זה גורם לעלייה נוספת ב- ECAR, וחושף את הקיבולת הגליקוליטית המרבית של התאים. ההבדל בין הקיבולת הגליקוליטית המרבית לבין הגליקוליזה הבסיסית מכונה עתודה גליקוליטית. לבסוף, 2-DG מוזרק, מה שגורם לירידה משמעותית ב- ECAR, בדרך כלל קרוב לרמות החמצה לא גליקוליטיות. 2-DG הוא אנלוגי לגלוקוז שנקשר באופן תחרותי להקסוקינאז, וכתוצאה מכך מעכב את הגליקוליזה¹⁸. לפיכך, הירידה המושרה על ידי 2-DG ב-ECAR מאשרת עוד יותר כי הגליקוליזה היא אכן המקור ל-ECAR שנצפה לאחר זריקות גלוקוז ואוליגומיצין.

איור 1B מציג את הסכימה עבור מבחן מאמץ מיטוכונדריאלי טיפוסי. הבדיקה מתחילה במדידת OCR בסיסית של התאים, תוך דגירה במדיום בדיקת דחק מיטוכונדריאלי המכיל גלוקוז, גלוטמין ופירובט. לאחר מדידות OCR בסיסיות, אוליגומיצין מוזרק במבחן זה, אשר מעכב V מורכב, ובכך מפחית את זרימת האלקטרונים דרך שרשרת הובלת האלקטרונים (ETC)¹⁷. כתוצאה מכך, OCR מופחת בתגובה להזרקת אוליגומיצין, וירידה זו ב- OCR קשורה לייצור ATP מיטוכונדריאלי. הזריקה השנייה מורכבת מקרבוניל ציאניד-4 (טריפלואורומתוקסי) פניל הידרזון (FCCP), פרוטונופור ובלתי מתמצא של OxPHOS¹⁷ מיטוכונדריאלי. FCCP מכווץ את שיפוע הפרוטונים המיטוכונדריאליים בכך שהוא מאפשר זרימה של פרוטונים על פני הממברנה הפנימית המיטוכונדרית. בגלל הזרקת FCCP, זרימת האלקטרונים דרך ה- ETC היא derepressed, ו- IV מורכב צורך חמצן ברמה המקסימלית. ההבדל בין OCR מקסימלי לבין OCR בסיסי מכונה קיבולת הנשימה הרזרבית, שהיא מדד ליכולתו של התא להגיב לביקוש מוגבר לאנרגיה בתנאי עקה. לבסוף, מוזרקת תערובת של שני מעכבי ETC (רוטנון, מעכב I מורכב, ואנטימיצין A, מעכב III^{מורכב 17}), מה שמכבה לחלוטין את זרימת האלקטרונים, ו- OCR יורד לרמה נמוכה. זיהוי תווים אופטי (OCR) שנמדד לאחר הזרקת רוטנון ואנטי-מיצין A מתאים ל-OCR שאינו מיטוכונדריאלי המונע על-ידי תהליכים אחרים בתוך התאים. זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי מאפשר חישוב של נשימה בסיסית, דליפת פרוטונים ונשימה מקסימלית.

נשימה בסיסית מייצגת את ההבדל בין זיהוי תווים אופטי (OCR) בסיסי לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. דליפת פרוטון מתייחסת להבדל בין OCR לאחר הזרקת אוליגומיצין לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. נשימה מקסימלית מייצגת את ההבדל בין OCR לאחר הזרקת FCCP לבין זיהוי תווים אופטי (OCR) שאינו מיטוכונדריאלי. יעילות הצימוד מחושבת כאחוז מקצב הייצור של ATP לשיעור הנשימה הבסיסי. מאמר שיטה זה מספק פרוטוקול מפורט למדידת ECAR ו- OCR ב- HSPCs שליליים לשושלת באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים XFe96. פרוטוקול זה מתאר גישות לבידוד HSPCs שליליים לשושלת עכברים, מסביר את האופטימיזציה של צפיפות זריעת התאים וריכוזים של תרופות שונות המשמשות בבדיקות שטף חוץ-תאיות, ומתאר אסטרטגיות לטיפול תרופתי.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חוליות אושרו על ידי ובוצעו בהתאם לתקנות הוועדה לשימוש וטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.

1. יום לפני הבדיקה (סה"כ זמן: ~ 10 דקות)

1. הידרציה של מחסנית החיישן (זמן צעד: ~ 10 דקות)
   1. פתחו את ערכת בדיקת השטף החוץ-תאי והסירו את מחסנית החיישן ואת מכלול לוחית השירות. שמור דירות מדריך טעינה לשימוש למחרת.
   2. הפרד ידנית את מחסנית החיישן (החלק הירוק העליון עם המכסה) מלוח השירות (מיקרו-פלטה תחתונה של 96 בארות) והנח אותה במהופך ליד לוחית השירות.
   3. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מלאו כל באר של צלחת השירות ב-200 μL של קליברנט, כלול בערכת בדיקת שטף.
   4. הניחו את מחסנית החיישן בחזרה על לוחית השירות, והקפידו להטביע לחלוטין את החיישנים בקליברנט.
   5. הניחו את מחסנית החיישן המורכבת ואת לוחית השירות עם קליברנט באינקובטור שאינו CO₂ 37 °C למשך הלילה. כדי למנוע אידוי של הקליברנט, ודא כי האינקובטור הוא לח כראוי. אם משתמשים בחממת תנור רגילה עבור דגירות שאינן CO₂ 37 °C, הניחו פתוחה המכילה מים בתוך האינקובטור כדי לחות אותה. אם זמין, השתמש בתחנת הכנה XF עבור כל הדגירות שאינן CO₂ 37 °C.
      הערה: לחלופין, מחסנית החיישן יכולה להיות hydrated לילה עם 200 μL לכל באר של מים אולטרה-פור סטריליים באינקובטור שאינו CO₂ 37 °C. החלף מים עם 200 μL לכל באר של 37 °C קליברנט מחומם מראש, לפחות 45-60 דקות לפני טעינת יציאות ההזרקה ביום הבדיקה.

2. יום הבדיקה (סה"כ זמן: ~ 9 שעות 30 דקות)

הערה: הזמן הכולל שצוין לעיל כולל משכי זמן מצטברים של שלבים 2.1-2.4 בנוסף לשלב 2.5 או שלב 2.6.

1. הכנת מיקרו-לוחות מצופים דבק-תאים (שלב זמן: כשעה 1 30 דקות)
   הערה: בצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגית.
   1. הכן 2.5 מ"ל של תמיסת דבק התא (22.4 מיקרוגרם /מ"ל, ראה טבלת החומרים) לכל מיקרו-פלטה של תרבית תאים של 96 בארות על-ידי המסת 56 מיקרוגרם של דבק התא בנפח מתאים של 0.1 M עיקור של נתרן ביקרבונט (pH 8.0) ומיד הוספת 1 N נתרן הידרוקסיד במחצית מנפח מלאי דבק התאים שבו נעשה שימוש. מערבולת או פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
   2. פתחו את המיקרו-פלטה של תרביות תאים בנות 96 בארות (הכלולה בערכת בדיקת השטף) והוציאו 25 μL של תמיסת דבק התא המוכנה בתחתית כל באר. מכסים את המיקרו-פלטה במכסה ודגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע.
   3. לאחר הדגירה, הסר והשליכו תמיסת דבק תאים עודפת באמצעות פיפטה רב-ערוצית או שאיפה, ושטפו כל באר פעמיים עם 200 μL של מים אולטרה-פורים סטריליים. לייבש את הצלחת באוויר, עם המכסה הוסר, בתוך מכסה המנוע במשך 30-45 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן מיקרו-לוחות תרבית תאים מצופים דבק תאים למשך עד שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש לאפשר למיקרו-לוחות מוכנים מראש המאוחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להתחמם לטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע לפני זריעת תאים.
2. הכנת מדיית בדיקה (שלב זמן: ~ 30 דקות)
   1. הכנת מדיום בדיקת מאמץ של גליקוליזה
      1. תוסף 100 מ"ל של מדיום בסיס (ראה טבלת החומרים) עם 1 מ"ל של 200 mM L-גלוטמין.
         הערה: הריכוז הסופי של L-גלוטמין במדיום הבדיקה הוא 2 mM.
      2. מחממים את תוספת ה-L-גלוטמין הבינונית ל-37 מעלות צלזיוס באמבטיית מים.
      3. התאם את ה- pH של המדיום החם ל- 7.4 עם 1 N NaOH.
      4. מסנן-מעקר את המדיום עם מסנן 0.2 מיקרומטר ושמור אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לשימוש.
   2. הכנת מדיום בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלי
      1. תוסף 100 מ"ל של מדיום הבסיס עם 0.45 גרם של גלוקוז, 1 מ"ל של 200 mM L-גלוטמין, ו 1 מ"ל של 100 mM נתרן פירובט.
         הערה: מדיום הבדיקה הסופי מכיל 25 mM גלוקוז, 2 mM L-גלוטמין, ו 1 mM נתרן פירובט.
      2. גלוקוז חם, L-גלוטמין, ותוסף נתרן פירובט בינוני עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
      3. התאם את ה- pH של המדיום החם ל- 7.4 עם 1 N NaOH.
      4. מסנן-מעקר מדיום עם מסנן 0.2 מיקרומטר ושומר על 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש.
3. שושלת עכבר קציר שלילית HSPCs (זמן צעד: ~ 3 שעות)
   1. הכינו את מאגר הבדיקה על ידי השלמה של תמיסת המלח המאוזנת של האנק עם 4% סרום בקר עוברי. הכינו חיץ העשרה פי 1 על ידי דילול המלאי פי 5 במים מזוקקים סטריליים. יש לשמור את שני המאגרים על הקרח עד לשימוש.
   2. המתת עכברים באופן הומאני באמצעות CO₂ ולאחר מכן נקע צוואר הרחם והסרת החלק האחורי עם מספריים. יש להסיר בזהירות את כל הרקמות מהעצמות, ולחתוך את הקצוות משני צידי עצם הירך והטיביה באמצעות מספריים. יש לשטוף את תאי מח העצם מעצם הירך והטיביה באמצעות מאגר הבדיקה. מעבירים את התאים הסמוקים דרך מסנן סטרילי של 70 מיקרומטר, מצנטריפוגים את התסיס ב-200 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ומשליכים את ה-supernatant.
   3. להפוך את תאי הדם האדומים על ידי החייאה של גלולת התא ב-500 μL של חיץ ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA, pH 7.2). לאחר lysis במשך דקה אחת על קרח, לשטוף את הדגימות על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ בדיקה וצנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (64 °F). השליכו את הסופרנאטנט.
   4. לאחר הכביסה, דגירו את הדגימות עם קוקטייל של נוגדנים שעברו ביוטינילציה המכוונים נגד CD2 (דילול 1:200), CD3 (דילול 1:200), CD5 (דילול 1:200), CD8 (דילול 1:200), Ter-119 (דילול 1:200), B220 (דילול 1:200) ו-Gr-1 (דילול של 1:800) במשך 45 דקות על קרח בנפח כולל של 500 מיקרול' של מאגר בדיקה.
   5. שטפו את הדגימות עם 1 מ"ל של מאגר בדיקה עם צנטריפוגה כנ"ל.
   6. לשטוף את הדגימות עם 1 מ"ל של 1x חיץ העשרה עם צנטריפוגה כנ"ל.
   7. הדגירה של הדגימות עם 20 μL של ננו-ביצות סטרפטווידין ו-100 μL של חיץ העשרה פי 1 על קרח למשך 15 דקות.
   8. לשטוף את הדגימות עם 1 מ"ל של 1x חיץ העשרה עם צנטריפוגה כנ"ל.
   9. בצעו שימוש חוזר בדגימות ב-2.5 מ"ל של מאגר העשרה פי 1. הניחו אותם על מגנט הפרדה למשך 5 דקות. לאסוף את supernatants בנפרד בצינורות חרוטיים 15 מ"ל.
   10. דגימות המופרדות על ידי מגנט Resuspend ב-2.5 מ"ל נוספים של חיץ העשרה פי 1, והניחו אותן שוב על מגנט ההפרדה למשך 5 דקות. לאסוף ולשלב סופרנאטים לאוספים הקודמים בצינורות חרוטיים של 15 מ"ל משלב 2.3.9.
       הערה: הסופרנאטנטים מכילים את שברי התאים השליליים לשושלת.
   11. צנטריפוגה צינורות חרוטיים 15 מ"ל המכילים את התאים שנבחרו באופן שלילי במשך 5 דקות ב 200 × גרם ב 4 °C (74 °F).
   12. בצעו שימוש חוזר בכדורי התאים ב-1 מ"ל של מאגר בדיקה וספרו את מספר התא באמצעות כחול טריפאן באופן ידני או באמצעות מונה תאים אוטומטי כגון רוזנת 3.
       הערה: בעקבות הגישה שתוארה לעיל, ~ 6 × 10⁶ HSPCs שליליים לשושלת צריכים להיות מטוהרים בקלות מהחלק האחורי של עכבר יחיד. אם מכינים ריאגנטים, כגון מאגר בדיקה, מאגר העשרה פי 1 וקוקטייל נוגדנים ספציפי לשושלת, ביום שלפני הניסוי, לוקח בערך 2.5-3 שעות להעשיר HSPCs מ-4 עכברים. זה ייקח 10 דקות נוספות עבור כל עכבר מעבר למספר זה.
4. זריעת תאים במיקרו-לוחות מצופים דבק-תאים (זמן צעד: כ-1 שעות)
   1. תאי צנטריפוגה משלב 2.3.12 ב-200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא במדיום הבדיקה המתאים (מדיום בדיקת מאמץ גליקוליזה או מדיום בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלית). צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. חזור על שלב 2.4.2. מוציאים את הסופרנאטנט ומחזירים את התאים במדיום הבדיקה המחומם המתאים לריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים ל-50 μL או 5 × 10⁶ ל-mL.
   4. פיפטה 50 μL של תרחיף התא לאורך הצד של כל באר של מיקרו-פלטת תרבית תאים מצופה 96 בארות מצופה בתאים בטמפרטורת החדר. פיפטה 50 μL של מדיום הבדיקה לתוך בארות מדידת הרקע הפינתיות. השתמש בפיפטה רב-ערוצית לציפוי תאים כדי להבטיח עקביות.
   5. צור לוחית איזון צנטריפוגה על ידי הוספת 50 μL של מים לכל באר של מיקרו-פלטת תרבית תאים שאינה מצופה בת 96 בארות.
   6. צנטריפוגה של התאים בצלחת ב 200 × גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. אין להפעיל בלם. העבר את הצלחת לחממה שאינה CO₂ 37 °C למשך 25-30 דקות כדי לוודא שהתאים מחוברים לחלוטין. יש לאשר באופן חזותי תחת מיקרוסקופ שהתאים דבקים ביציבות בפני השטח של המיקרו-לוחיות.
      הערה: מכיוון שניתן לקצור ~ 6 × 10^{6 6} HSPCs שליליים לשושלת מהחלק האחורי של עכבר יחיד, HSPCs המבודדים מ -4 עכברים (~ 2.4 × 10⁷ תאים) נדרשים כדי למלא צלחת שלמה של 96 בארות אם המטרה היא לסנן התערבויות מרובות ex vivo במקביל. עם זאת, אם המטרה היא לחקור את ההשפעה של שינוי גנטי או התערבות על הפרמטרים המטבוליים של HSPCs in vivo, אז HSPCs מבודדים ממספר זוגות של עכברי בקרה ובדיקה יכולים להיות מנותחים במספר שכפולים טכניים במקביל באמצעות צלחת אחת.
5. ביצוע בדיקת מאמץ של גליקוליזה באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי (שלב זמן: ~3 שעות 30 דקות)
   1. מחסנית חיישן טעינה עם תרכובות הזרקה
      1. הכינו 100 mM גלוקוז, 20 μM אוליגומיצין, ו-500 mM תמיסות 2-DG במדיום בדיקת מאמץ של גליקוליזה מתוכננת מראש (pH 7.4).
         הערה: כל תמיסות תרכובת ההזרקה מיוצרות בריכוז של פי 10. ריכוזי הבאר הסופיים הם 10 mM עבור גלוקוז, 2 μM עבור אוליגומיצין, ו-50 mM עבור 2-DG (ראה טבלה 1).
      2. הסר את מחסנית החיישן הלחה מהחממה שאינה CO₂ 37 °C משלב 1.1.5. הסר בועות אוויר מהקליברנט בלוח השירות על ידי הרמת מחסנית החיישן מהקליברנט והחלפתה באותה צלחת שירות עם הקליברנט.
      3. מקם את מדריך הטעינה של A/D שטוח (הכלול בערכת בדיקת השטף החוץ-תאית) בחלק העליון של מחסנית החיישן, והכוונן אותה כך שהאות 'A' ממוקמת בפינה השמאלית העליונה כדי להבטיח שרק יציאות A יהיו זמינות לטעינה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מחלקים 20 μL של תמיסת גלוקוז של 100 mM ביציאות A.
      4. החלף את מדריך הטעינה של A/D שטוח במדריך הטעינה של B/C שטוח, תוך כיוון כך שהאות 'B' ממוקמת בפינה השמאלית העליונה כדי להבטיח שרק יציאות B יהיו זמינות לטעינה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, יש לחלק 22 μL של תמיסת אוליגומיצין 20 μM ביציאות B.
      5. כיוון מחדש את מדריך הטעינה של B/C שטוח כדי לאתר את האות 'C' בפינה השמאלית העליונה לטעינת יציאות C. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, תחלק 25 μL של פתרון 2-DG של 500 mM ביציאות C.
      6. הסר והשלך את משטחי מדריך הטעינה.
         הערה: חשוב שכל סדרת יציאות של כל 96 הבארות, כולל אלה של בארות הרקע, תיטען לחלוטין באותו נפח של תרכובת ההזרקה.
   2. יצירת תבניות, כיול ומדידות
      1. צור או טען את התבנית לבדיקת הלחץ של הגליקוליזה בבקר. הזן פרטים לגבי אסטרטגיות הזרקה, מצבי טיפול וסוגי תאים, ולחץ על קבוצות יצירה. עבור אל מפת הצלחת והקצה בארות לכל קבוצה לניתוח. הקצה את 4 הבארות הפינתיות למדידות רקע.
      2. בפרוטוקול, ודא שהכיול והשיווי משקל נבדקים בשלב האתחול.
      3. למדידה ומדידות בסיסיות לאחר כל זריקה (גלוקוז, אוליגומיצין ו-2-DG), הגדירו את מספר מחזורי המדידה ל-3 ו-Mix - Wait - מדדו את הזמנים ל-3 דקות - 0 דקות - 3 דקות (ראו טבלה 2).
      4. הסר את המכסה ממחסנית החיישן הטעונה והלחה של התרכובות, השקועה בקליברנט בלוח השירות. הניחו אותו על מגש העבודה של מנתח השטף החוץ-תאי והתחילו את הריצה.
         הערה: הצעד הראשון הוא הכיול, אשר בדרך כלל לוקח ~ 20 דקות.
      5. הוציאו את המיקרו-פלטה המכילה את התאים מהחממה שאינה CO₂ 37 °C משלב 2.4.6 לאחר 25-30 דקות של דגירה הסתיימה. מבלי להפריע לתאים, הוסיפו באיטיות 130 μL של מדיום בדיקת הלחץ של הגליקוליזה שתוכננה מראש (pH 7.4) לכל באר כדי לפצות על הנפח הבינוני בכל באר ל-180 μL והחזירו את הצלחת לחממה שאינה CO₂ 37 °C למשך 15-20 דקות נוספות.
         הערה: עדיף זמן דגירה כולל של 45-60 דקות לאחר צנטריפוגה.
      6. לאחר סיום הכיול, החליפו את לוחית השירות במיקרו-לוחית הבדיקה (ללא מכסה) המכילה את התאים. לחץ על לוח תא העומס כדי להתחיל את המדידות, שייקח ~ 1.5 שעות להשלמת הבדיקה.
      7. לאחר סיום המדידות, אספו את המיקרו-פלטה של הבדיקה המכילה את התאים והסירו את מדיום הבדיקה מבלי להפריע לתאים. יש לשטוף פעם אחת בעדינות עם 250 μL של 1x מלוחים עם מאגר פוספט מבלי לנתק את התאים.
      8. הוסיפו 10 μL של מאגר ליזיס RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.5 % Na deoxycholate, 0.1% נתרן דודצילסולפט, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), בתוספת קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x, לכל באר והתסיסו את הצלחת על שייקר במשך 10 דקות. הקפיאו את כל הצלחת בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
      9. להפשיר את הצלחת, ולבצע בדיקת מדידת חלבון לצורך נורמליזציה של נתונים בהתאם להוראות היצרן.
      10. אחזור וניתוח הנתונים. פתח את קובץ הנתונים באמצעות תוכנת שולחן העבודה של Wave. לחץ על נרמל והדבק את ערכי הנורמליזציה עבור כל באר. לחץ על החל כדי לנרמל את הנתונים. לחץ על ייצוא ובחר מחולל דוחות בדיקת מאמץ של גליקוליזה כדי לייצא את הנתונים שנותחו למחולל דוחות. לחלופין, ייצא את הנתונים ליישום חיצוני.
          הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בתכולת הדנ"א הגרעיני הכוללת בכל באר כדי לנרמל את הנתונים. ניתן להשתמש בצבע פלואורסצנטי, כגון CyQuant הנקשר לחומצת גרעין, כדי להעריך את תכולת הדנ"א הגרעיני הכוללת לכל באר.
6. ביצוע בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלית באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי (שלב זמן: ~ 3 שעות 30 דקות)
   1. מחסנית חיישן טעינה עם תרכובות הזרקה
      1. הכן 20 μM אוליגומיצין, 20 μM FCCP, ו 5 μM רוטנון + 5 μM אנטימיצין A תמיסות במדיום בדיקת מאמץ מיטוכונדריאלית מראש (pH 7.4).
         הערה: כל תמיסות תרכובת ההזרקה מיוצרות בריכוז של פי 10. ריכוזי הבאר הסופיים הם 2 μM עבור אוליגומיצין, 2 μM עבור FCCP, ו-0.5 μM כל אחד עבור רוטנון ואנטימיצין A (ראה טבלה 3).
      2. הסר את מחסנית החיישן הלחה מהחממה של 37 °C משלב 1.1.5 והסר בועות אוויר כמתואר קודם לכן בשלב 2.5.1.2.
      3. על ידי ביצוע שלבים 2.5.1.3 עד 2.5.1.6, מחלקים 20 μL של 20 μM אוליגומיצין ביציאות A, 22 μL של 20 μM FCCP ביציאות B, ו-25 μL של תערובת של 5 μM רוטנון ו-5 μM אנטימיצין A ביציאות C.
         הערה: חשוב שכל סדרת יציאות של כל 96 הבארות, כולל אלה של בארות הרקע, תיטען לחלוטין באותו נפח של תרכובת הזרקה.
   2. יצירת תבניות, כיול ומדידות
      1. צור או טען את התבנית עבור מבחן הלחץ המיטוכונדריאלי בבקר. הזן פרטים לגבי אסטרטגיות הזרקה, מצבי טיפול וסוגי תאים, ולחץ על קבוצות יצירה. עבור אל מפת הצלחת והקצה בארות לכל קבוצה לניתוח. הקצה את 4 הבארות הפינתיות למדידות רקע.
      2. בפרוטוקול, ודא שהכיול והשיווי משקל נבדקים בשלב האתחול.
      3. עבור מדידה ומדידות בסיסיות לאחר כל הזרקה (אוליגומיצין, FCCP ורוטנון + אנטימיצין A), הגדר את מספר מחזורי המדידה ל - 3 ו - Mix - Wait - מדידת זמנים ל - 3 דקות - 0 דקות - 3 דקות (ראה טבלה 4).
      4. התחל את הריצה כדי לבצע את הכיול כמו בשלב 2.5.2.4.
      5. הוסיפו 130 μL של מדיום בדיקת הלחץ המיטוכונדריאלי המחומל מראש (pH 7.4) לכל טוב וכן בשלב 2.5.2.5.
      6. התחל את המדידות; לאחזר ולנתח את הנתונים כמו בשלבים 2.5.2.6 עד 2.5.2.10. ייצא את הנתונים שנותחו למחולל דוחות בדיקת הלחץ המיטוכונדריה או ליישום חיצוני.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, מספר התא והריכוזים של תרופות שונות המכוונות ל-OxPHOS (המשמשות במבחני השטף החוץ-תאי) הותאמו למדידת ECAR ו-OCR של HSPCs שבודדו מנקבות עכברי C57BL/6 בנות 24 שבועות. ראשית, בדיקת הלחץ של הגליקוליזה בוצעה כדי לייעל את מספר התא ואת ריכוז האוליגומיצין. מספר משתנה של HSPCs לכל באר הנע בין 5 × 10

Discussion

מאמר שיטה זה מתאר פרוטוקול ממוטב להערכת ביו-אנרגיה תאית (גליקוליזה ו-OxPHOS) ב-HSPCs של עכברים באמצעות מנתח השטף החוץ-תאי של סוסון הים. מכשיר זה הוא כלי רב עוצמה המודד בו זמנית את ה- ECAR וה- OCR של תאים חיים, שהם מדדים של גליקוליזה ונשימה מיטוכונדריאלית, בהתאמה. לפיכך, ניתן להשתמש בו כדי להעריך את הביו-...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate