Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Résumé

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Résumé

À l’état d’équilibre, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) restent en grande partie au repos et on pense qu’elles dépendent principalement de la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cependant, dans des conditions de stress telles qu’une infection ou une perte de sang, les CSH deviennent prolifératifs et produisent rapidement des cellules progénitrices en aval, qui à leur tour se différencient davantage, produisant finalement des cellules sanguines matures. Au cours de ce processus de transition et de différenciation, les CSH sortent de la quiescence et subissent rapidement un passage métabolique de la glycolyse à la phosphorylation oxydative (OxPHOS). Diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité, peuvent avoir un impact négatif sur la fonction mitochondriale et peuvent donc modifier la reprogrammation métabolique et la différenciation des CSH et des progéniteurs pendant l’hématopoïèse. Des informations précieuses sur les fonctions glycolytiques et mitochondriales des CSH et des progéniteurs dans des conditions normales et de stress peuvent être obtenues grâce à l’évaluation de leur taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et de leur taux de consommation d’oxygène (OCR), qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.

Ici, un protocole détaillé est fourni pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les populations de cellules de lignée négative dérivées de la moelle osseuse de souris, qui comprennent à la fois des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices primitives (HSPC), à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole décrit des approches pour isoler les cellules de lignée négative de la moelle osseuse de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de 2-désoxy-D-glucose (2-DG, un analogue du glucose qui inhibe la glycolyse) et de divers médicaments ciblant OxPHOS (oligomycine, FCCP, roténone et antimycine A) utilisés dans ces tests, et décrit les stratégies de traitement médicamenteux. Les paramètres clés du flux glycolytique, tels que la glycolyse, la capacité glycolytique et la réserve glycolytique, et les paramètres OxPHOS, tels que la respiration basale, la respiration maximale, la fuite de protons, la production d’ATP, la capacité respiratoire de rechange et l’efficacité du couplage, peuvent être mesurés dans ces essais. Ce protocole permet des mesures ECAR et OCR sur des HSPC non adhérents et peut être généralisé pour optimiser les conditions d’analyse pour tout type de cellules de suspension.

Introduction

L’hématopoïèse est le processus par lequel divers types de cellules sanguines matures ayant des fonctions hautement spécialisées sont formés à partir de^{CSH 1}. Les CSH sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en diverses populations progénitrices multipotentes et spécifiques à la lignée. Ces progéniteurs produisent finalement des cellules de lignées lymphoïdes, myéloïdes, érythroïdes et mégacarytaires. Pour maintenir leur capacité d’auto-renouvellement, les CSH restent en grande partie au repos et, comme d’autres cellules souches tissulaires, on pense qu’elles reposent sur la glycolyse plutôt que sur l’OxPHOS mitochondrial pour la production ^{d’ATP 2,3}. L’entrée dans le cycle cellulaire entraîne une amélioration de la respiration et de l’OxPHOS, ce qui entraîne des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui nuisent au maintien et à la fonction^{HSC 3}. Une division cellulaire répétée peut donc conduire à une réduction de la capacité d’auto-renouvellement des CSH et, finalement, à leur épuisement.

Dans l’hématopoïèse adulte, les CSH subissent principalement une division cellulaire asymétrique, au cours de laquelle l’une des cellules filles conserve le potentiel HSC et continue de dépendre du métabolisme glycolytique. L’autre cellule fille devient une cellule progénitrice primitive qui perd sa capacité d’auto-renouvellement mais prolifère et finit par donner naissance à des cellules hématopoïétiques fonctionnelles différenciées⁴. Lorsque les CSH se différencient pour produire des progéniteurs en aval, on pense qu’un passage de la glycolyse au métabolisme mitochondrial se produit pour fournir l’énergie et les blocs de construction nécessaires pour soutenir cette transition rapide⁵, comme le suggèrent les observations selon lesquelles les CSH possèdent une masse mitochondriale inactive ^6,7,8,9 . En revanche, l’activité mitochondriale (indiquée par les niveaux de ROS liés) est beaucoup plus élevée chez les progéniteurs engagés dans la lignée que dans les CSH ^9,10,11. Les changements métaboliques qui se produisent au cours de la première étape de l’hématopoïèse suggèrent donc un rôle direct et crucial des mitochondries dans la régulation du devenir du HSC.

Les mitochondries dysfonctionnelles présentes dans diverses conditions de stress, telles que le vieillissement, le cancer, le diabète et l’obésité¹², peuvent interférer avec la capacité d’auto-renouvellement des CSH, induisant un déséquilibre dans la différenciation des CSH / progéniteurs en produisant des quantités excessives de ROS, en altérant la production d’ATP et / ou en modifiant d’autres processus métaboliques ^9,12,13 . Les perturbations de l’homéostasie métabolique dans la différenciation HSC/progéniteur pourraient avoir un impact significatif sur l’hématopoïèse, contribuant potentiellement au développement d’anomalies hématologiques¹³. Compte tenu des influences critiques de la glycolyse et de l’OxPHOS mitochondrial sur la tige et la différenciation des CSH, il est intéressant d’étudier à la fois les paramètres métaboliques dans des conditions normales et de stress. Des informations précieuses sur la fonction glycolytique et mitochondriale des CSH et des cellules progénitrices peuvent être obtenues en évaluant leur ECAR et leur OCR, qui sont des indicateurs de la glycolyse cellulaire et de la respiration mitochondriale, respectivement.

L’analyseur de flux extracellulaire Seahorse est un appareil puissant équipé de deux sondes par puits pour mesurer simultanément l’ECAR et l’OCR dans les cellules vivantes et peut donc être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel, en réponse à divers substrats ou inhibiteurs. La cartouche de dosage utilisée avec l’analyseur contient des orifices d’injection pour contenir jusqu’à quatre médicaments pour injection automatisée pendant le test. Un schéma d’un test de stress typique de glycolyse est illustré à la figure 1A. Le test commence par la mesure de l’ECAR des cellules, incubées dans un milieu de test de stress de glycolyse contenant de la glutamine mais pas du glucose ou du pyruvate. Cela représente l’acidification due aux activités non glycolytiques des cellules et est rapporté comme une acidification non glycolytique. Ceci est suivi par l’injection de glucose à une concentration saturante. Par glycolyse, le glucose dans la cellule est converti en pyruvate, qui est ensuite métabolisé dans le cytoplasme pour produire du lactate, ou dans les mitochondries pour produire du CO₂ et de l’eau.

La conversion du glucose en lactate provoque une production nette et une libération ultérieure de protons dans le milieu extracellulaire, ce qui entraîne une augmentation rapide de l’ECAR 14,15,16. Ce changement stimulé par le glucose dans l’ECAR est rapporté comme glycolyse dans des conditions basales. La deuxième injection consiste en oligomycine (un inhibiteur de l’ATP synthase, alias complexe V¹⁷), qui inhibe la production mitochondriale d’ATP. Au cours de l’inhibition de l’OxPHOS médiée par l’oligomycine, les cellules régulent au maximum la glycolyse pour répondre à leurs besoins énergétiques. Cela provoque une augmentation supplémentaire de l’ECAR, révélant la capacité glycolytique maximale des cellules. La différence entre la capacité glycolytique maximale et la glycolyse basale est appelée réserve glycolytique. Enfin, le 2-DG est injecté, ce qui provoque une baisse significative de l’ECAR, généralement proche des niveaux d’acidification non glycolytique. Le 2-DG est un analogue du glucose qui se lie de manière compétitive à l’hexokinase, ce qui entraîne une inhibition de la glycolyse¹⁸. Ainsi, la diminution de l’ECAR induite par le 2-DG confirme en outre que la glycolyse est bien la source d’ECAR observée après des injections de glucose et d’oligomycine.

La figure 1B montre le schéma d’un test de stress mitochondrial typique. Le test commence par la mesure OCR de base des cellules, incubées dans un milieu de test de stress mitochondrial contenant du glucose, de la glutamine et du pyruvate. Après des mesures OCR basales, l’oligomycine est injectée dans ce test, qui inhibe le complexe V, réduisant ainsi le flux d’électrons à travers la chaîne de transport d’électrons (ETC)¹⁷. Par conséquent, l’OCR est réduite en réponse à l’injection d’oligomycine, et cette diminution de l’OCR est liée à la production mitochondriale d’ATP. La deuxième injection consiste en cyanure de carbonyle-4 (trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un protonophore et un découpleur d’OxPHOS¹⁷ mitochondrial. FccP effondre le gradient de protons mitochondriaux en permettant le flux de protons à travers la membrane interne mitochondriale. En raison de l’injection de FCCP, le flux d’électrons à travers l’ETC est déprimé et le complexe IV consomme de l’oxygène au niveau maximal. La différence entre l’OCR maximal et l’OCR basale est appelée capacité respiratoire de rechange, qui est une mesure de la capacité de la cellule à répondre à une demande d’énergie accrue dans des conditions de stress. Enfin, un mélange de deux inhibiteurs de l’ETC (roténone, un inhibiteur du complexe I, et antimycine A, un inhibiteur du complexe III¹⁷) est injecté, ce qui arrête complètement le flux d’électrons et l’OCR diminue à un faible niveau. L’OCR mesurée après injection de roténone et d’antimycine A correspond à l’OCR non mitochondriale entraînée par d’autres processus à l’intérieur des cellules. L’OCR non mitochondriale permet de calculer la respiration basale, la fuite de protons et la respiration maximale.

La respiration basale représente la différence entre l’OCR de base et l’OCR non mitochondriale. La fuite de protons fait référence à la différence entre l’OCR après injection d’oligomycine et l’OCR non mitochondriale. La respiration maximale représente la différence entre l’OCR après injection de FCCP et l’OCR non mitochondriale. L’efficacité du couplage est calculée comme le pourcentage du taux de production d’ATP au taux de respiration basale. Ce document de méthode fournit un protocole détaillé pour mesurer l’ECAR et l’OCR dans les HSPC à l’ordre négatif à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse XFe96. Ce protocole décrit les approches pour isoler les HSPC négatifs à la lignée de souris, explique l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des concentrations de divers médicaments utilisés dans les tests de flux extracellulaire et décrit les stratégies de traitement médicamenteux.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux vertébrés ont été approuvées et effectuées conformément aux règlements du Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université du Michigan.

1. Jour avant le test (Durée totale: ~ 10 min)

1. Hydratation de la cartouche du capteur (Temps de pas: ~ 10 min)
   1. Ouvrez le kit de dosage de flux extracellulaire et retirez la cartouche de capteur et la plaque utilitaire. Enregistrez les plats du guide de chargement pour les utiliser le lendemain.
   2. Séparez manuellement la cartouche du capteur (la partie verte supérieure avec couvercle) de la plaque utilitaire (microplaque inférieure de 96 puits) et placez-la à l’envers à côté de la plaque utilitaire.
   3. À l’aide d’une pipette multicanal, remplissez chaque puits de la plaque utilitaire avec 200 μL d’calibrant, inclus avec le kit de dosage de flux.
   4. Replacez la cartouche du capteur sur la plaque utilitaire, en vous assurant d’immerger complètement les capteurs dans le calibrant.
   5. Placez la cartouche de capteur et la plaque utilitaire assemblées avec calibrant dans un incubateur sans CO₂ 37 °C pendant la nuit. Pour éviter l’évaporation du calibrant, assurez-vous que l’incubateur est correctement humidifié. Si vous utilisez un incubateur de four ordinaire pour des incubations sans CO₂ 37 °C, placez un bécher ouvert contenant de l’eau à l’intérieur de l’incubateur pour l’humidifier. Si disponible, utilisez une station de préparation XF pour toutes les incubations sans CO₂ 37 °C.
      REMARQUE: Alternativement, la cartouche du capteur peut être hydratée pendant la nuit avec 200 μL par puits d’eau ultrapure stérile dans un incubateur sans CO₂ 37 °C. Remplacer l’eau par 200 μL par puits d’étrier préavertissé à 37 °C, au moins 45 à 60 min avant de charger les orifices d’injection le jour du dosage.

2. Jour du test (Durée totale: ~9 h 30 min)

REMARQUE : Le temps total indiqué ci-dessus comprend les durées cumulées des étapes 2.1 à 2.4 en plus de l’étape 2.5 ou de l’étape 2.6.

1. Préparation de microplaques revêtues d’adhésif cellulaire (Temps d’étape: ~ 1 h 30 min)
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans une armoire de biosécurité.
   1. Préparer 2,5 mL de la solution adhésive cellulaire (22,4 μg/mL, voir le tableau des matériaux) par microplaque de culture cellulaire à 96 puits en dissolvant 56 μg de l’adhésif cellulaire dans un volume approprié de bicarbonate de sodium de 0,1 M stérilisé par filtre (pH 8,0) et en ajoutant immédiatement 1 an d’hydroxyde de sodium à la moitié du volume de stock d’adhésif cellulaire utilisé. Vortex ou pipette de haut en bas pour mélanger.
   2. Ouvrez la microplaque de culture cellulaire à 96 puits (incluse avec le kit de dosage de flux) et distribuez 25 μL de la solution adhésive cellulaire préparée au fond de chaque puits. Couvrir la microplaque avec le couvercle et incuber pendant 30 min à température ambiante à l’intérieur de la hotte.
   3. Après l’incubation, retirez et jetez l’excès de solution adhésive cellulaire à l’aide d’une pipette ou d’un aspirateur multicanal, et lavez chaque puits deux fois avec 200 μL d’eau ultrapure stérile. Séchez la plaque à l’air libre, avec le couvercle retiré, à l’intérieur de la hotte pendant 30-45 min.
      REMARQUE: Les microplaques de culture cellulaire revêtues d’adhésif cellulaire peuvent être conservées jusqu’à une semaine à 4 ° C. Les microplaques pré-revêtues stockées à 4 °C doivent être laissées se réchauffer à température ambiante à l’intérieur de la hotte avant l’ensemencement des cellules.
2. Préparation du milieu d’essai (temps d’étape: ~ 30 min)
   1. Préparation du milieu d’essai de test de stress de glycolyse
      1. Compléter 100 mL de milieu de base (voir le tableau des matériaux) avec 1 mL de L-glutamine de 200 mM.
         REMARQUE: La concentration finale de L-glutamine dans le milieu d’essai est de 2 mM.
      2. Réchauffer le milieu supplémenté en L-glutamine à 37 °C au bain-marie.
      3. Ajuster le pH du milieu chaud à 7,4 avec 1 N NaOH.
      4. Filtrer-stériliser le milieu avec un filtre de 0,2 μm et le maintenir à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
   2. Préparation du milieu de test de stress mitochondrial
      1. Compléter 100 mL du milieu de base avec 0,45 g de glucose, 1 mL de L-glutamine de 200 mM et 1 mL de pyruvate de sodium de 100 mM.
         REMARQUE: Le milieu d’essai final contient 25 mM de glucose, 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium.
      2. Réchauffez le glucose, la L-glutamine et le milieu supplémenté en pyruvate de sodium jusqu’à 37 °C au bain-marie.
      3. Ajuster le pH du milieu chaud à 7,4 avec 1 N NaOH.
      4. Filtrer-stériliser le milieu avec un filtre de 0,2 μm et conserver à 37 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
3. Récolter des HSPC négatifs à la lignée de souris (Temps d’étape: ~ 3 h)
   1. Préparez le tampon d’essai en complétant la solution saline équilibrée de Hank avec 4% de sérum fœtal bovin. Préparer 1x tampon d’enrichissement en diluant le 5x bouillon avec de l’eau distillée stérile. Gardez les deux tampons sur la glace jusqu’à utilisation.
   2. Euthanasier sans cruauté les souris à l’aide de CO₂ suivi d’une luxation cervicale et enlever les membres postérieurs avec des ciseaux. Retirez soigneusement tous les tissus des os et coupez les extrémités des deux côtés du fémur et du tibia à l’aide de ciseaux. Éliminez les cellules de la moelle osseuse du fémur et du tibia à l’aide du tampon d’essai. Faire passer les cellules rincées à travers un filtre stérile de 70 μm, centrifuger le filtrat à 200 × g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.
   3. Lyser les globules rouges en resusmettant la pastille cellulaire dans 500 μL de tampon ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Après lyse pendant 1 min sur glace, laver les échantillons en ajoutant 1 mL de tampon d’essai et centrifuger à 200 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
   4. Après le lavage, incuber les échantillons avec un cocktail d’anticorps biotinylés dirigés contre CD2 (dilution 1:200), CD3 (dilution 1:200), CD5 (dilution 1:200), CD8 (dilution 1:200), Ter-119 (dilution 1:200), B220 (dilution 1:200) et Gr-1 (dilution 1:800) pendant 45 min sur glace dans un volume total de 500 μL de tampon d’essai.
   5. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’essai avec centrifugation comme ci-dessus.
   6. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’enrichissement 1x avec centrifugation comme ci-dessus.
   7. Incuber les échantillons avec 20 μL de nanobilles de streptavidine et 100 μL de tampon d’enrichissement 1x sur de la glace pendant 15 min.
   8. Laver les échantillons avec 1 mL de tampon d’enrichissement 1x avec centrifugation comme ci-dessus.
   9. Remettre les échantillons en suspension dans 2,5 mL de tampon d’enrichissement 1x. Placez-les sur un aimant de séparation pendant 5 min. Recueillir les surnageants séparément dans des tubes coniques de 15 mL.
   10. Remettez en suspension les échantillons séparés par aimant dans un tampon d’enrichissement supplémentaire de 2,5 mL 1x et replacez-les sur l’aimant de séparation pendant 5 min. Collectez et combinez les surnageants des collections précédentes dans des tubes coniques de 15 mL à partir de l’étape 2.3.9.
       REMARQUE: Les surnageants contiennent les fractions cellulaires de lignée négative.
   11. Centrifuger les tubes coniques de 15 mL contenant les cellules sélectionnées négativement pendant 5 min à 200 × g à 4 °C.
   12. Remettez en suspension les pastilles de cellules dans 1 mL de tampon d’essai et comptez le nombre de cellules à l’aide du bleu de trypan manuellement ou via un compteur de cellules automatisé tel qu’une comtesse 3.
       REMARQUE: Selon l’approche décrite ci-dessus, ~ 6 × 10⁶ HSPC de lignée négative doivent être facilement purifiés des membres postérieurs d’une seule souris. Si des réactifs, tels que le tampon d’essai, le tampon d’enrichissement 1x et le cocktail d’anticorps spécifiques à la lignée, sont préparés la veille de l’expérience, il faut environ 2,5 à 3 h pour enrichir les HSPC de 4 souris. Cela prendrait 10 minutes supplémentaires pour chaque souris au-delà de ce nombre.
4. Ensemencement de cellules dans des microplaques revêtues d’adhésif cellulaire (temps d’étape: ~ 1 h)
   1. Cellules de centrifugeuse de l’étape 2.3.12 à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu d’essai approprié (milieu de test de stress de glycolyse ou milieu de test de stress mitochondrial). Centrifuger à 200 × g pendant 5 min à température ambiante.
   3. Répétez l’étape 2.4.2. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans le milieu d’essai réchauffé approprié à la concentration de 2,5 × 10⁵ cellules par 50 μL ou 5 × 10^{à 6} par mL.
   4. Pipette 50 μL de la suspension cellulaire le long du côté de chaque puits de la microplaque de culture cellulaire à 96 puits revêtue d’adhésif cellulaire à température ambiante. Pipette 50 μL du milieu d’essai dans les puits de mesure de fond d’angle. Utilisez une pipette multicanal pour le placage des cellules afin d’assurer la cohérence.
   5. Créez une plaque d’équilibre de centrifugeuse en ajoutant 50 μL d’eau par puits d’une microplaque de culture cellulaire non revêtue de 96 puits.
   6. Centrifuger les cellules de la plaque à 200 × g pendant 1 min à température ambiante. N’appliquez pas le frein. Transférer la plaque dans un incubateur sans CO₂ 37 °C pendant 25-30 min pour s’assurer que les cellules sont complètement fixées. Confirmez visuellement au microscope que les cellules adhèrent de manière stable à la surface de la microplaque.
      REMARQUE: Comme ~ 6 × 10⁶ HSPC de lignée négative peuvent être récoltés à partir des membres postérieurs d’une seule souris, des HSPC isolés de 4 souris (~ 2,4 × 10⁷ cellules) sont nécessaires pour remplir une plaque entière de 96 puits si l’objectif est de dépister plusieurs interventions ex vivo en parallèle. Cependant, si l’objectif est d’étudier l’impact d’une altération génétique ou d’une intervention sur les paramètres métaboliques des HSPC in vivo, les HSPC isolés à partir de plusieurs paires de souris témoins et testées peuvent être analysés dans plusieurs répliques techniques en parallèle à l’aide d’une seule plaque.
5. Effectuer un test de stress de glycolyse à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Temps d’étape: ~ 3 h 30 min)
   1. Cartouche de capteur de chargement avec injection de composés
      1. Préparer des solutions de glucose de 100 mM, d’oligomycine de 20 μM et de 500 mM de 2-DG dans un milieu d’essai de test d’effort de glycolyse préavertissé (pH 7,4).
         REMARQUE: Toutes les solutions de composés injectables sont fabriquées à une concentration de 10x. Les concentrations finales dans le puits sont de 10 mM pour le glucose, de 2 μM pour l’oligomycine et de 50 mM pour le 2-DG (voir le tableau 1).
      2. Retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur sans CO₂ 37 °C de l’étape 1.1.5. Retirez les bulles d’air de l’étrier dans la plaque utilitaire en soulevant la cartouche du capteur hors de l’étrier et en la remplaçant sur la même plaque utilitaire que l’étrier.
      3. Placez le guide de chargement A/N à plat (inclus dans le kit de dosage de flux extracellulaire) sur le dessus de la cartouche du capteur, en l’orientant de manière à ce que la lettre « A » soit située dans le coin supérieur gauche pour vous assurer que seuls les ports A sont disponibles pour le chargement. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 20 μL de solution de glucose de 100 mM dans les orifices A.
      4. Remplacez le guide de chargement A/N à plat par le guide de chargement B/C à plat, en vous orientant de manière à ce que la lettre « B » soit située dans le coin supérieur gauche pour vous assurer que seuls les ports B sont disponibles pour le chargement. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuer 22 μL de solution d’oligomycine de 20 μM dans les orifices B.
      5. Réorientez le guide de chargement B/C à plat pour localiser la lettre « C » dans le coin supérieur gauche des ports de chargement C. À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 25 μL de solution 2-DG de 500 mM dans les ports C.
      6. Retirez et jetez les plats du guide de chargement.
         REMARQUE: Il est important que chaque série de ports des 96 puits, y compris ceux des puits de fond, soit chargée complètement avec le même volume du composé injectable.
   2. Création, étalonnage et mesures de modèles
      1. Créez ou chargez le modèle pour le test de contrainte de glycolyse sur le contrôleur. Entrez des détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser. Attribuez les 4 puits d’angle pour les mesures de fond.
      2. Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation .
      3. Pour la mesure de base et les mesures après chaque injection (glucose, oligomycine et 2-DG), définissez le nombre de cycles de mesure sur 3 et Mélangez - Attendez - Mesurez les temps à 3 min - 0 min - 3 min (voir tableau 2).
      4. Retirez le couvercle de la cartouche de capteur chargée et hydratée, immergée dans un calibrant dans la plaque utilitaire. Placez-le sur le plateau de travail de l’analyseur de flux extracellulaire et commencez la course.
         REMARQUE: La première étape est l’étalonnage, qui prend généralement ~ 20 min.
      5. Retirez la microplaque contenant les cellules de l’incubateur sans CO₂ 37 °C de l’étape 2.4.6 après 25 à 30 minutes d’incubation. Sans perturber les cellules, ajouter lentement 130 μL du milieu d’essai de stress de glycolyse préavertissé (pH 7,4) par puits pour augmenter le volume de milieu dans chaque puits à 180 μL et renvoyer la plaque à l’incubateur sans CO₂ 37 °C pendant 15 à 20 minutes supplémentaires.
         REMARQUE: Un temps d’incubation total de 45 à 60 minutes après la centrifugation est préférable.
      6. Une fois l’étalonnage terminé, remplacez la plaque utilitaire par la microplaque d’essai (sans couvercle) contenant les cellules. Appuyez sur la plaque de cellule de charge pour démarrer les mesures, ce qui prendra environ 1,5 h pour terminer le test.
      7. Une fois les mesures terminées, prélever la microplaque d’essai contenant les cellules et retirer le milieu d’essai sans perturber les cellules. Laver une fois doucement avec 250 μL de 1x solution saline tamponnée au phosphate sans déloger les cellules.
      8. Ajouter 10 μL de tampon de lyse RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 % NP-40, 0,5 % de désoxycholate de Na, dodécylsulfate de sodium à 0,1 %, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), complété par 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase, à chaque puits et agiter la plaque sur un agitateur pendant 10 min. Congeler toute la plaque à -80 °C.
      9. Décongelez la plaque et effectuez un test de mesure des protéines pour la normalisation des données en suivant les instructions du fabricant.
      10. Récupérez et analysez les données. Ouvrez le fichier de données à l’aide du logiciel Wave Desktop. Cliquez sur Normaliser et collez les valeurs de normalisation pour chaque puits. Cliquez sur Appliquer pour normaliser les données. Cliquez sur Exporter et sélectionnez générateur de rapports de test de stress de glycolyse pour exporter les données analysées vers un générateur de rapports. Vous pouvez également exporter les données vers une application externe.
          REMARQUE: Alternativement, la teneur totale en ADN nucléaire dans chaque puits peut être utilisée pour normaliser les données. Un colorant fluorescent, tel que CyQuant qui se lie à l’acide nucléique, peut être utilisé pour évaluer la teneur totale en ADN nucléaire par puits.
6. Réalisation d’un test de stress mitochondrial à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire (Temps d’étape: ~ 3 h 30 min)
   1. Cartouche de capteur de chargement avec injection de composés
      1. Préparer 20 μM d’oligomycine, 20 μM de FCCP et 5 μM de roténone + 5 μM d’antimycine A dans un milieu d’essai de stress mitochondrial préavertissé (pH 7,4).
         REMARQUE: Toutes les solutions de composés injectables sont fabriquées à une concentration de 10x. Les concentrations finales dans le puits sont de 2 μM pour l’oligomycine, de 2 μM pour le FCCP et de 0,5 μM chacune pour la roténone et l’antimycine A (voir le tableau 3).
      2. Retirez la cartouche de capteur hydratée de l’incubateur à 37 °C de l’étape 1.1.5 et retirez les bulles d’air comme décrit précédemment à l’étape 2.5.1.2.
      3. En suivant les étapes 2.5.1.3 à 2.5.1.6, distribuer 20 μL d’oligomycine de 20 μM dans les ports A, 22 μL de 20 μM FCCP dans les ports B et 25 μL d’un mélange de 5 μM de roténone et de 5 μM d’antimycine A dans les ports C.
         REMARQUE: Il est important que chaque série de ports des 96 puits, y compris ceux des puits de fond, soit chargée complètement avec le même volume de composé injectable.
   2. Création, étalonnage et mesures de modèles
      1. Créez ou chargez le modèle pour le test de stress mitochondrial sur le contrôleur. Entrez des détails concernant les stratégies d’injection, les conditions de traitement et les types de cellules, puis appuyez sur Générer des groupes. Allez sur la carte des plaques et attribuez des puits à chaque groupe à analyser. Attribuez les 4 puits d’angle pour les mesures de fond.
      2. Dans le protocole, assurez-vous que l’étalonnage et l’équilibrage sont vérifiés à l’étape d’initialisation.
      3. Pour la mesure initiale et les mesures après chaque injection (oligomycine, FCCP et roténone + antimycine A), définissez le nombre de cycles de mesure sur 3 et Mélangez - Attendez - Mesurez les temps à 3 min - 0 min - 3 min (voir tableau 4).
      4. Démarrez l’exécution pour effectuer l’étalonnage comme à l’étape 2.5.2.4.
      5. Ajouter 130 μL du milieu d’essai mitochondrial préavertissé (pH 7,4) par puits ainsi qu’à l’étape 2.5.2.5.
      6. Commencez les mesures; récupérer et analyser les données comme dans les étapes 2.5.2.6 à 2.5.2.10. Exportez les données analysées vers le générateur de rapports de test de stress mitochondrial ou une application externe.

Résultats

En utilisant ce protocole, le nombre de cellules et les concentrations de divers médicaments ciblant OxPHOS (utilisés dans les tests de flux extracellulaire) ont été optimisés pour mesurer l’ECAR et l’OCR des HSPC isolés chez des souris femelles C57BL/6 âgées de 24 semaines. Tout d’abord, le test de stress de glycolyse a été effectué pour optimiser le nombre de cellules et la concentration d’oligomycine. Un nombre variable de HSPC par puits allant de 5 × 10⁴ à 2,5 × 10⁵ ont ét...

Discussion

Cet article de méthode décrit un protocole optimisé pour l’évaluation de la bioénergétique cellulaire (glycolyse et OxPHOS) dans les HSPC de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire Seahorse. Cet appareil est un outil puissant qui mesure simultanément l’ECAR et l’OCR des cellules vivantes, qui sont des mesures de la glycolyse et de la respiration mitochondriale, respectivement. Ainsi, il peut être utilisé pour évaluer la bioénergétique cellulaire en temps réel. De plus, la plate-form...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate