세포외 플럭스 분석기를 사용한 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포의 세포 생체 에너지 평가

요약

여기에 제시된 방법은 HSPC의 세포외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비 속도 (OCR)를 실시간으로 측정하기 위해 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 비 부착성 마우스 조혈 줄기 및 원시 전구 세포 (HSPCs)에서 세포 생물 에너지를 평가하기위한 최적화 된 프로토콜을 요약합니다.

초록

정상 상태에서 조혈 줄기 세포 (HSCs)는 크게 정지 상태로 유지되며 에너지 요구를 충족시키기 위해 주로 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 그러나 감염이나 혈액 손실과 같은 스트레스 조건 하에서, HSC는 증식 성이되어 하류 전구 세포를 빠르게 생산하여 차례로 분화되어 궁극적으로 성숙한 혈액 세포를 생산합니다. 이 전이 및 분화 과정 동안 HSC는 정지에서 빠져 나와 글리코 분해에서 산화 인산화 (OxPHOS)로 대사 전환을 빠르게 겪습니다. 노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 상태는 미토콘드리아 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 조혈 중 HSC 및 선조의 대사 재 프로그래밍 및 분화를 변화시킬 수 있습니다. 정상 및 스트레스 조건 하에서 HSC와 선조의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당 분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 및 산소 소비율 (OCR)의 평가를 통해 얻을 수 있습니다.

여기서, 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 조혈 줄기 및 원시전구 세포(HSPCs)를 모두 포함하는 마우스 골수 유래 혈통-음성 세포 집단에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 마우스 골수로부터 혈통 음성 세포를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포 시딩 밀도 및 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG, 당분해를 억제하는 글루코스 유사체) 및 이러한 분석에 사용되는 다양한 OxPHOS 표적 약물(올리고마이신, FCCP, 로테논 및 안티마이신 A)의 농도 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다. 당분해, 글리콜 용량 및 글리콜 보유량과 같은 글리콜 플럭스의 주요 파라미터, 및 OxPHOS 파라미터, 예컨대 기저 호흡, 최대 호흡, 양성자 누출, ATP 생산, 예비 호흡 용량 및 커플링 효율은 이들 분석에서 측정될 수 있다. 이 프로토콜은 비부착성 HSPC에 대한 ECAR 및 OCR 측정을 허용하며 모든 유형의 현탁액 셀에 대한 분석 조건을 최적화하도록 일반화할 수 있습니다.

서문

조혈은 고도로 전문화 된 기능을 가진 다양한 유형의 성숙한 혈액 세포가 HSC¹에서 형성되는 과정입니다. HSC는 자기 갱신 및 다양한 다능성 및 혈통 특이적 선조 집단으로 분화 할 수 있습니다. 이 선조는 궁극적으로 림프구, 골수성, 에리스로이드 및 거핵구 혈통의 세포를 생산합니다. 자기 재생 능력을 유지하기 위해 HSC는 크게 정지 상태로 유지되며 다른 조직 줄기 세포와 마찬가지로 ATP 생산 ^2,3을 위해 미토콘드리아 OxPHOS보다는 당분해에 의존하는 것으로 여겨집니다. 세포 주기로의 진입은 향상된 호흡 및 OxPHOS로 이어지고, 그 결과 HSC 유지 및 기능³에 해로운 반응성 산소 종(ROS)의 수준이 상승한다. 따라서 반복되는 세포 분열은 HSC의 자기 재생 능력을 감소시키고 궁극적으로 고갈로 이어질 수 있습니다.

성인 조혈에서 HSC는 주로 비대칭 세포 분열을 겪으며, 그 동안 딸 세포 중 하나가 HSC 잠재력을 유지하고 글리콜 대사에 계속 의존합니다. 다른 딸 세포는 자기 재생 능력을 잃지만 증식하고 결국 분화 된 기능적 조혈 세포를 일으키는 원시적 인 전구 세포가됩니다⁴. HSC가 하류 선조를 생산하기 위해 분화 할 때, HSC 가 비활성 미토콘드^{리아 질량을} 가지고 있다는 관찰에 의해 제안 된 바와 같이이 급속한 전이를 지원하는 데 필요한 에너지와 빌딩 블록을 공급하기 위해 글리코 분해에서 미토콘드리아 대사로의 전환이 발생하는 것으로 생각됩니다 ⁵ . 대조적으로, 미토콘드리아 활성(연결된 ROS 수준으로 나타냄)은 HSC ^9,10,11에서보다 혈통-헌신적 선조에서 훨씬 더 높다. 따라서 조혈의 초기 단계에서 발생하는 대사 변화는 HSC 운명을 조절하는 데 미토콘드리아의 직접적이고 중요한 역할을 제안합니다.

노화, 암, 당뇨병 및 비만과 같은 다양한 스트레스 조건 하에서 존재하는 기능 장애 미토콘드리아는 HSC 자기 재생 능력을 방해하여 과도한 양의 ROS를 생산하고 ATP 생산을 저해하거나 다른 대사 과정을 변경함으로써 HSC / 선조 분화의 불균형을 유발할 수 있습니다^9,12,13 . HSC / 선조 분화에서 대사 항상성의 교란은 조혈에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 혈액 학적 이상¹³의 발달에 기여할 수 있습니다. HSC 줄기 및 분화에 대한 글리코 분해 및 미토콘드리아 OxPHOS의 중요한 영향을 감안할 때, 정상 및 스트레스 조건 하에서 대사 매개 변수를 모두 조사하는 것이 중요합니다. HSCs 및 전구 세포의 글리콜 및 미토콘드리아 기능에 대한 귀중한 통찰력은 각각 세포 당분해 및 미토콘드리아 호흡의 지표 인 ECAR 및 OCR을 평가함으로써 얻을 수 있습니다.

Seahorse 세포외 플럭스 분석기는 살아있는 세포에서 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하기 위해 웰 당 두 개의 프로브가 장착 된 강력한 장치이므로 다양한 기질 또는 억제제에 반응하여 실시간으로 세포 생물 에너지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 분석기와 함께 사용되는 분석 카트리지에는 분석 중에 자동 주입을 위해 최대 네 개의 약물을 보유하는 주입 포트가 포함되어 있습니다. 전형적인 당분해 스트레스 시험의 반응식은 도 1A에 도시되어 있다. 상기 분석은 세포의 ECAR의 측정으로 시작하여, 글루타민을 함유하지만 글루코스 또는 피루베이트는 함유하지 않는 당분해 스트레스 시험 배지에서 배양한다. 이것은 세포의 비 글리콜 성 활성으로 인해 발생하는 산성화를 나타내며 비 글리콜 성 산성화로보고됩니다. 이것은 포화 농도에서 포도당의 주입으로 이어진다. 당분해를 통해 세포 내의 포도당은 피루베이트로 전환되며, 이는 세포질에서 추가로 대사되어 젖산을 생산하거나 미토콘드리아에서_CO2 및 물을 생산합니다.

포도당을 젖산으로 전환시키는 것은 순 생산과 양성자의 세포외 배지로의 후속 방출을 유발하여 ECAR^14,15,16의 급속한 증가를 초래합니다. ECAR의 이러한 글루코스-자극된 변화는 기저 조건하에서 글리코분해로서 보고된다. 두 번째 주사는 미토콘드리아 ATP 생산을 억제하는 올리고마이신 (ATP 합성 효소의 억제제, 일명 복합체 V¹⁷)으로 구성됩니다. 올리고마이신 매개 OxPHOS 억제 동안, 세포는 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위해 당분해를 최대로 상향조절한다. 이것은 ECAR의 추가 증가를 일으켜 세포의 최대 글리콜 용량을 드러냅니다. 최대 글리콜 용량과 기저 글리코 분해 사이의 차이는 글리콜 보유량이라고합니다. 마지막으로, 2-DG가 주입되어 ECAR이 크게 떨어지며 일반적으로 비 글리콜 성 산성화 수준에 가깝습니다. 2-DG는 헥소키나제에 경쟁적으로 결합하는 글루코스 유사체로, 글리코분해^억제(18)를 초래한다. 따라서, ECAR의 2-DG-유도된 감소는 글루코스 및 올리고마이신 주사 후에 관찰된 ECAR의 공급원이 실제로 당분해임을 추가로 확인시켜준다.

도 1B는 전형적인 미토콘드리아 스트레스 테스트에 대한 개략도를 표시한다. 상기 분석은 세포의 기준선 OCR 측정으로 시작하여, 글루코스, 글루타민 및 피루베이트를 함유하는 미토콘드리아 스트레스 시험 배지에서 인큐베이션한다. 기초 OCR 측정 후, 올리고마이신이 이 분석법에 주입되어 복합체 V를 억제하여 전자 수송 사슬(ETC)¹⁷을 통한 전자 흐름을 감소시킨다. 결과적으로, OCR은 올리고마이신 주사에 반응하여 감소되고, OCR의 이러한 감소는 미토콘드리아 ATP 생산과 관련이 있다. 두 번째 주사는 카르보닐 시아나이드-4 (트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP), 프로토노포어 및 미토콘드리아 OxPHOS¹⁷의 언커플러로 구성된다. FCCP는 미토콘드리아 내막을 가로지르는 양성자의 흐름을 허용함으로써 미토콘드리아 양성자 구배를 붕괴시킨다. FCCP 주입으로 인해 ETC를 통한 전자 흐름이 억제되고 복합 IV는 최대 수준에서 산소를 소비합니다. 최대 OCR과 기저 OCR의 차이는 예비 호흡 용량이라고하며, 이는 스트레스 조건 하에서 증가 된 에너지 수요에 대응하는 세포의 능력을 측정합니다. 마지막으로, 두 개의 ETC 억제제 (로테논, 콤플렉스 I 억제제 및 안티마이신 A, 콤플렉스 III 억제제¹⁷)의 혼합물이 주입되어 전자 흐름을 완전히 차단하고 OCR은 낮은 수준으로 감소합니다. 로테논 및 안티마이신 A 주사 후 측정된 OCR은 세포 내부의 다른 과정에 의해 구동되는 비미토콘드리아 OCR에 상응한다. 비 미토콘드리아 OCR은 기저 호흡, 양성자 누출 및 최대 호흡의 계산을 가능하게합니다.

기저 호흡은 기준선 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 양성자 누출은 올리고마이신 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR의 차이를 의미한다. 최대 호흡은 FCCP 주사 후 OCR과 비미토콘드리아 OCR 사이의 차이를 나타낸다. 커플링 효율은 기초 호흡률에 대한 ATP 생산 속도의 백분율로서 계산된다. 이 방법 논문은 Seahorse XFe96 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 계보 음성 HSPC에서 ECAR 및 OCR을 측정하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 마우스 혈통 음성 HSPC를 분리하는 접근법을 설명하고, 세포외 플럭스 분석에 사용되는 다양한 약물의 세포 시딩 밀도 및 농도의 최적화를 설명하고, 약물 치료 전략을 설명합니다.

프로토콜

모든 척추동물 실험은 미시간 대학교 동물 사용 및 관리 위원회의 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다.

1. 분석 전날 (총 시간 : ~ 10 분)

1. 센서 카트리지의 수화 (스텝 타임: ~10분)
   1. 세포외 플럭스 분석 키트를 열고 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트 어셈블리를 분리합니다. 다음날 사용할 수 있도록 적재 가이드 플랫을 저장하십시오.
   2. 센서 카트리지(뚜껑이 있는 상단 녹색 부분)를 유틸리티 플레이트(하부 96웰 마이크로플레이트)에서 수동으로 분리하고 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
   3. 다중 채널 피펫을 사용하여, 유틸리티 플레이트의 각 웰을 플럭스 분석 키트에 포함된 200μL의 캘리브란트로 채운다.
   4. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 올려 놓고 센서를 캘리브란트에 완전히 잠기십시오.
   5. 조립된 센서 카트리지 및 유틸리티 플레이트를 교정제와 함께 비_CO2 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓는다. 캘리브란트의 증발을 방지하려면 인큐베이터가 제대로 가습되었는지 확인하십시오. 비_CO2 37°C 인큐베이션을 위해 규칙적인 오븐 인큐베이터를 사용하는 경우, 물을 함유하는 개방된 비커를 인큐베이터 내부에 배치하여 가습시킨다. 이용 가능한 경우, 모든 비_CO2 37°C 인큐베이션을 위해 XF 준비 스테이션을 사용한다.
      참고: 대안적으로, 센서 카트리지는 비CO2 37°C 인큐베이터에서 웰 당₂₀₀ μL의 멸균 초순수로 밤새 수화될 수 있다. 분석 당일에 주입 포트를 로딩하기 최소 45-60분 전에 37°C의 예열 교정제의 웰 당 200 μL로 물을 교체한다.

2. 분석의 날 (총 시간 : ~ 9 시간 30 분)

참고: 위에 표시된 총 시간에는 2.5단계 또는 2.6단계 외에 2.1-2.4단계의 누적 기간이 포함됩니다.

1. 세포 접착제 코팅 마이크로플레이트의 제조 (단계 시간: ∼1 h 30 분)
   주: 생물 안전 캐비닛의 모든 단계를 수행하십시오.
   1. 96웰 세포 배양 마이크로플레이트당 2.5 mL의 세포 접착제 용액(22.4 μg/mL, 표 참조)을 준비하여 세포 접착제 56 μg을 적절한 부피의 필터-멸균된 0.1 M 중탄산나트륨(pH 8.0)에 용해시키고 즉시 사용된 세포 접착제 스톡의 부피의 절반에 1N 수산화나트륨을 첨가한다. 소용돌이 또는 피펫을 위아래로 섞어서 혼합하십시오.
   2. 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트(플럭스 분석 키트와 함께 포함됨)를 열고 제조된 세포 접착 용액 25 μL를 각 웰의 바닥에 분주한다. 마이크로플레이트를 뚜껑으로 덮고 후드 내부의 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
   3. 배양 후, 다채널 피펫 또는 흡인물을 이용하여 과량의 세포 접착 용액을 제거하고 버리고, 200 μL의 멸균 초순수로 각 웰을 두 번 세척한다. 뚜껑을 제거한 상태에서 플레이트를 후드 내부에서 30-45 분 동안 공기 건조시킵니다.
      참고: 세포-접착제-코팅된 세포 배양 마이크로플레이트는 4°C에서 최대 일주일 동안 저장될 수 있다. 4°C에 보관된 예비코팅된 마이크로플레이트는 세포를 시딩하기 전에 후드 내부의 실온으로 가온되도록 허용되어야 한다.
2. 분석 매질의 제조 (단계 시간: ∼30 분)
   1. 당분해 스트레스 시험 분석 배지의 제조
      1. 100 mL의 기본 배지 ( 물질 표 참조)를 1 mL의 200 mM L-글루타민으로 보충하십시오.
         참고: 분석 배지 내의 최종 L-글루타민 농도는 2mM이다.
      2. L-글루타민이 보충된 배지를 수조에서 37°C로 따뜻하게 한다.
      3. 따뜻한 배지의 pH를 1 N NaOH로 7.4로 조정한다.
      4. 필터-멸균된 배지를 0.2 μm 필터로 세척하고 사용할 준비가 될 때까지 37°C에서 보관한다.
   2. 미토콘드리아 스트레스 시험 분석 배지의 제조
      1. 기본 배지 100 mL를 0.45 g의 포도당, 1 mL의 200 mM L-글루타민 및 100 mM 나트륨 피루베이트 1 mL로 보충하십시오.
         참고: 최종 분석 배지는 25 mM 글루코스, 2 mM L-글루타민 및 1 mM 소듐 피루베이트를 함유한다.
      2. 따뜻한 글루코스, L-글루타민, 및 소듐 피루베이트-보충된 배지를 수조에서 37°C로 한다.
      3. 따뜻한 배지의 pH를 1 N NaOH로 7.4로 조정한다.
      4. 멸균 배지를 0.2 μm 필터로 필터-멸균하고 사용 준비가 될 때까지 37°C에서 유지한다.
3. 수확 마우스 계보 음성 HSPC (단계 시간 : ~ 3 시간)
   1. 행크의 균형 잡힌 소금 용액에 4% 소 태아 혈청을 보충하여 분석 완충액을 준비합니다. 5x 스톡을 멸균 증류수로 희석하여 1x 농축 완충액을 준비합니다. 사용할 때까지 두 버퍼를 얼음 위에 보관하십시오.
   2. CO2를 사용하여 마우스를 인도적으로 안락사시킨 다음 자궁 경부 탈구하고 가위로 뒷다리를 제거하십시오. 조심스럽게 뼈에서 모든 조직을 제거하고 가위를 사용하여 대퇴골과 경골의 양쪽에서 끝을 자릅니다. 분석 버퍼를 사용하여 대퇴골과 경골에서 골수 세포를 플러시하십시오. 플러싱된 세포를 멸균된 70 μm 필터에 통과시키고, 여액을 200 × g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 폐기한다.
   3. 세포 펠릿을 500 μL의 ACK 완충액 (150 mM_NH4Cl, 10 mM_KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7.2)에 재현탁시켜 적혈구를 용해시킨다. 얼음 상에서 1분 동안 용해시킨 후, 1 mL의 분석 완충액을 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리하여 샘플을 세척한다. 상층액을 버리십시오.
   4. 세척 후, 샘플을 CD2 (1:200 희석), CD3 (1:200 희석), CD5 (1:200 희석), CD8 (1:200 희석), Ter-119 (1:200 희석), B220 (1:200 희석), 및 Gr-1 (1:800 희석)에 대해 지시된 비오티닐화 항체의 칵테일과 함께 500 μL의 총 부피의 분석 완충액에서 얼음 상에서 45분 동안 인큐베이션한다.
   5. 위와 같이 원심분리로 1 mL의 분석 완충액으로 샘플을 세척한다.
   6. 위와 같이 원심분리로 1 mL의 1x 농축 완충액으로 샘플을 세척한다.
   7. 샘플을 20 μL의 스트렙타비딘 나노비드 및 100 μL의 1x 농축 완충액과 함께 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
   8. 위와 같이 원심분리로 1 mL의 1x 농축 완충액으로 샘플을 세척한다.
   9. 샘플을 2.5 mL의 1x 농축 완충액에 재현탁시킨다. 5 분 동안 분리 자석에 놓습니다. 상청액을 15 mL 원뿔형 튜브에 별도로 수집하십시오.
   10. 자석으로 분리된 샘플을 추가로 2.5 mL의 1x 농축 완충액에 재현탁시키고, 이를 다시 분리자석 상에 5분 동안 놓는다. 상청액을 수집하고 단계 2.3.9에서 15 mL 원뿔형 튜브에서 이전 수집에 결합한다.
       참고: 상청액은 혈통-음성 세포 분획을 함유한다.
   11. 음으로 선택된 세포를 함유하는 15 mL 원뿔형 튜브를 4°C에서 200 × g 에서 5분 동안 원심분리한다.
   12. 세포 펠릿을 1mL의 분석 완충액에 재현탁하고 트립판 블루를 사용하여 수동으로 또는 Countess 3과 같은 자동화된 세포 카운터를 통해 세포 수를 계수합니다.
       참고 : 위에서 설명한 접근법에 따라 ~ 6 × 10⁶ 혈통 음성 HSPC는 단일 마우스의 뒷다리에서 쉽게 정제되어야합니다. 분석 완충액, 1x 농축 완충액 및 혈통특이적 항체 칵테일과 같은 시약이 실험 전날 제조되는 경우, 4마리의 마우스로부터 HSPC를 풍부하게 하는 데 약 2.5-3시간이 소요된다. 이 숫자를 초과하는 각 마우스에 대해 추가로 10 분이 걸릴 것입니다.
4. 세포 접착제 코팅 마이크로플레이트에 세포 시딩 (단계 시간: ~1 h)
   1. 세포를 단계 2.3.12에서 200 × g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다.
   2. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 적절한 분석 배지(글리코분해 스트레스 시험 배지 또는 미토콘드리아 스트레스 시험 배지)에 재현탁시켰다. 실온에서 5분 동안 200 × g 에서 원심분리한다.
   3. 2.4.2단계를 반복합니다. 상청액을 제거하고 세포를 적절한 가온된 분석 배지에 재현탁시켜 50 μL 당 2.5 × 10⁵ 세포 또는 5 × 10^{mL 당 6} 세포의 농도로 재현탁시킨다.
   4. 50 μL의 세포 현탁액을 상온 세포-접착제가 코팅된 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 각 웰의 측면을 따라 피펫한다. 50 μL의 분석 배지를 코너 배경 측정 웰에 피펫한다. 일관성을 보장하기 위해 셀 도금을 위해 다중 채널 피펫을 사용하십시오.
   5. 코팅되지 않은 96-웰 세포 배양 마이크로플레이트의 웰 당 50 μL의 물을 첨가하여 원심분리 밸런스 플레이트를 생성한다.
   6. 플레이트 내의 세포를 200 × g 에서 실온에서 1분 동안 원심분리한다. 브레이크를 적용하지 마십시오. 플레이트를_{CO2가 아닌 37} °C 인큐베이터로 25-30분 동안 옮겨 세포가 완전히 부착되었는지 확인한다. 현미경으로 세포가 마이크로플레이트 표면에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인한다.
      참고 : 단일 마우스의 뒷다리에서 ~ 6 개×⁶ 개의 혈통 음성 HSPC를 수확 할 수 있으므로 4 마리의 마우스 (~ 2.4 × 10⁷ 개 세포)에서 분리 된 HSPC가 생체 외 다중 개입을 병렬로 스크리닝하는 것이 목표라면 전체 96 웰 플레이트를 채우기 위해 필요합니다. 그러나 유전자 변형 또는 개입이 생체 내에서 HSPC의 대사 매개 변수에 미치는 영향을 조사하는 것이 목적이라면 여러 쌍의 대조군 및 테스트 마우스에서 분리 된 HSPC를 단일 플레이트를 사용하여 여러 기술 복제본에서 병렬로 분석 할 수 있습니다.
5. 세포외 플럭스 분석기를 이용한 당분해 스트레스 테스트 수행(스텝 타임: ∼3시간 30분)
   1. 화합물을 주입하는 센서 카트리지 로딩
      1. 100 mM 글루코스, 20 μM 올리고마이신 및 500 mM 2-DG 용액을 예열된 당분해 스트레스 시험 분석 배지 (pH 7.4)에서 준비한다.
         참고 : 모든 주입 화합물 용액은 10x 농도로 만들어집니다. 최종 웰 농도는 글루코스의 경우 10mM, 올리고마이신의 경우 2μM, 2-DG의 경우 50mM이다( 표 1 참조).
      2. 수화된 센서 카트리지를 단계 1.1.5로부터 비_CO2 37°C 인큐베이터로부터 제거한다. 센서 카트리지를 교정기에서 들어올려 교정기가 있는 동일한 유틸리티 플레이트로 교체하여 유틸리티 플레이트의 교정기에서 기포를 제거합니다.
      3. A/D 로딩 가이드를 센서 카트리지 상단에 플랫(세포외 플럭스 분석 키트에 포함)에 놓고 문자 'A'가 왼쪽 위 모서리에 위치하도록 방향을 지정하여 포트 A만 로드할 수 있도록 합니다. 다채널 피펫을 사용하여, 포트 A에 20 μL의 100 mM 글루코스 용액을 분주한다.
      4. A/D 로딩 가이드 플랫을 B/C 로딩 가이드 플랫으로 교체하고, 문자 'B'가 왼쪽 상단 모서리에 위치하도록 방향을 지정하여 포트 B만 적재할 수 있도록 합니다. 다채널 피펫을 사용하여, 22 μL의 20 μM 올리고마이신 용액을 포트 B에 분주한다.
      5. B/C 로딩 가이드 플랫의 방향을 재조정하여 포트 C를 로딩하기 위한 왼쪽 상단 모서리에 문자 'C'를 찾습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 포트 C에 500mM 2-DG 솔루션 25μL를 분배합니다.
      6. 적재 가이드 플랫을 제거하고 버립니다.
         참고: 배경 웰을 포함한 모든 96개 웰의 각 포트 시리즈는 주입 화합물의 동일한 부피로 완전히 로드되는 것이 중요합니다.
   2. 템플릿 작성, 교정 및 측정
      1. 컨트롤러에서 글리코분해 스트레스 테스트를 위한 템플릿을 만들거나 로드합니다. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 생성 그룹을 누릅니다. 플레이트 맵 으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다. 배경 측정을 위해 4개의 모서리 웰을 할당합니다.
      2. 프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 확인되었는지 확인합니다.
      3. 각 주사 후의 기준선 측정 및 측정(글루코스, 올리고마이신 및 2-DG)의 경우, 측정 주기 수를 3으로 설정하고 믹스-대기 - 측정 시간을 3분 - 0분 - 3분으로 설정한다(표 2 참조).
      4. 컴파운드가 로딩되고 수화된 센서 카트리지에서 뚜껑을 분리하고 유틸리티 플레이트의 교정기에 잠겨 있습니다. 세포외 플럭스 분석기의 작업 트레이에 놓고 실행을 시작하십시오.
         참고: 첫 번째 단계는 교정이며, 보통 ~20분이 소요됩니다.
      5. 세포를 포함하는 마이크로플레이트를 단계 2.4.6으로부터 37°C 인큐베이터로부터 비CO2 꺼내어 25-30분 동안 인큐베이션이 끝난 후 한다. 세포를 교란시키지 않고, 웰 당 130 μL의 미리 가온된 당분해 스트레스 시험 검정 배지 (pH 7.4)를 천천히 첨가하여 각 웰에서 배지 부피를 180 μL로 구성하고, 플레이트를 추가의 15-20분 동안 비_CO2 37°C 인큐베이터로 복귀시킨다.
         참고: 원심분리 후 45-60분의 총 배양 시간이 바람직하다.
      6. 교정이 끝난 후, 유틸리티 플레이트를 세포를 포함하는 분석 마이크로플레이트(뚜껑 없이)로 교체한다. 로드 세포 플레이트를 눌러 측정을 시작하고, 분석 완료를 위해 ~1.5시간이 소요됩니다.
      7. 측정이 끝난 후, 세포를 함유하는 분석 마이크로플레이트를 수집하고 세포를 교란시키지 않고 분석 배지를 제거한다. 세포를 분산시키지 않고 250 μL의 1x 포스페이트 완충 식염수로 1회 부드럽게 세척한다.
      8. 10 μL의 RIPA 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.5% Na 데옥시콜레이트, 0.1% 소듐 도데실설페이트, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF)을 첨가하고, 1x 프로테아제 억제제 칵테일로 보충하여, 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 진탕기 상에서 10분 동안 교반시킨다. 전체 플레이트를 -80°C에서 동결시킨다.
      9. 플레이트를 해동하고, 제조자의 지시에 따라 데이터 정규화를 위한 단백질 측정 분석을 수행한다.
      10. 데이터를 검색하고 분석합니다. Wave 데스크탑 소프트웨어를 사용하여 데이터 파일을 엽니다. 정규화 를 클릭하고 각 웰에 대한 정규화 값을 붙여 넣습니다. 적용 을 클릭하여 데이터를 정규화하십시오. 내보내기 를 클릭하고 당분해 스트레스 테스트 보고서 생성기를 선택하여 분석된 데이터를 보고서 생성기로 내보냅니다. 또는 데이터를 외부 응용 프로그램으로 내보냅니다.
          참고: 대안적으로, 각 웰의 총 핵 DNA 함량은 데이터를 정규화하는데 사용될 수 있다. 핵산에 결합하는 CyQuant와 같은 형광 염료를 사용하여 웰 당 총 핵 DNA 함량을 평가할 수 있습니다.
6. 세포외 플럭스 분석기를 이용한 미토콘드리아 스트레스 테스트 수행(스텝 타임: ∼3시간 30분)
   1. 화합물을 주입하는 센서 카트리지 로딩
      1. 20 μM 올리고마이신, 20 μM FCCP, 및 5 μM 로테논 + 5 μM 안티마이신 A 용액을 예열 미토콘드리아 스트레스 시험 배지 (pH 7.4)에서 제조하였다.
         참고 : 모든 주입 화합물 용액은 10x 농도로 만들어집니다. 최종 웰 농도는 올리고마이신에 대해 2 μM, FCCP에 대해 2 μM, 로테논 및 안티마이신 A에 대해 각각 0.5 μM이다( 표 3 참조).
      2. 수화된 센서 카트리지를 단계 1.1.5로부터 37°C 인큐베이터로부터 분리하고, 단계 2.5.1.2에서 앞서 설명된 바와 같이 기포를 제거한다.
      3. 단계 2.5.1.3 내지 2.5.1.6에 이어서, 포트 A에 20 μL의 20 μL의 올리고마이신을, 22 μL의 20 μM FCCP를 포트 B에 분주하고, 25 μL의 5 μM 로테논 및 5 μM 안티마이신 A의 혼합물을 포트 C에 분주한다.
         참고: 배경 웰을 포함한 모든 96개 웰의 각 포트 시리즈가 동일한 양의 주입 화합물로 완전히 로드되는 것이 중요합니다.
   2. 템플릿 작성, 교정 및 측정
      1. 컨트롤러에서 미토콘드리아 스트레스 테스트를 위한 템플릿을 만들거나 로드합니다. 주사 전략, 치료 조건 및 세포 유형에 대한 세부 정보를 입력하고 생성 그룹을 누릅니다. 플레이트 맵 으로 이동하여 분석할 각 그룹에 웰을 할당합니다. 배경 측정을 위해 4개의 모서리 웰을 할당합니다.
      2. 프로토콜에서 초기화 단계에서 교정 및 평형화가 확인되었는지 확인합니다.
      3. 각 주사 후 기준선 측정 및 측정치(올리고마이신, FCCP, 및 로테논+안티마이신 A)의 경우, 측정 주기 수를 3으로 설정하고 믹스-대기 - 측정 시간을 3분 - 0분 - 3분으로 설정한다(표 4 참조).
      4. 2.5.2.4단계에서와 같이 교정을 수행하기 위해 실행을 시작합니다.
      5. 단계 2.5.2.5에서와 마찬가지로 예열된 미토콘드리아 스트레스 시험 검정 배지 (pH 7.4) 당 130 μL를 첨가한다.
      6. 측정을 시작하십시오. 2.5.2.6 ~ 2.5.2.10 단계와 같이 데이터를 검색하고 분석합니다. 분석된 데이터를 미토콘드리아 스트레스 테스트 보고서 생성기 또는 외부 애플리케이션으로 내보냅니다.

결과

이 프로토콜을 사용하여, 다양한 OxPHOS 표적 약물의 세포 수 및 농도(세포외 플럭스 분석에 사용됨)를 최적화하여 24주령의 암컷 C57BL/6 마우스로부터 분리된 HSPC의 ECAR 및 OCR을 측정하였다. 먼저, 세포 수 및 올리고마이신 농도를 최적화하기 위해 당분해 스트레스 시험을 수행하였다. 웰당 5 내지 10⁴ 내지 2.5 × 10,5 범위의 다양한 수의 HSPCs^가 이 검정× 사용되었다. 도 2A...

토론

이 방법 논문은 Seahorse 세포외 플럭스 분석기를 사용하는 마우스 HSPCs에서 세포 생물에너지학(당분해 및 OxPHOS)의 평가를 위한 최적화된 프로토콜을 기술한다. 이 장치는 각각 글리코 분해 및 미토콘드리아 호흡의 메트릭 인 살아있는 세포의 ECAR 및 OCR을 동시에 측정하는 강력한 도구입니다. 따라서, 세포 생물에너지를 실시간으로 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 96웰 마이크로플레이트 기반 플랫...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm filter	Corning	430626	Used to filter-sterilize the assay media
100 mM sodium pyruvate	Life Technologies	11360-070	Component of mitochondrial stress test assay medium
15 mL conical Falcon tubes	Corning	352096	Used during HSPCs harvest and to prepare assay drug solutions
200 mM L-glutamine	Life Technologies	25030-081	Component of glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)	Sigma-Aldrich	D8375	3rd drug injection during glycolysis stress test
5x Enrichment buffer (MojoSort)	Biolegend	480017	Used for washings during HSPCs harvest
Ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-3	Component of ACK lysis buffer
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Bio-Rad DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112	Used as per manufacturer's instructions
Carbonyl cyanide-4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920	2nd drug injection during mitochondrial stress test
Cell-Tak	Corning	354240	Cell adhesive. Used for coating cell microplates
Countes 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific		For cell counting
EDTA	Fisher Scientific	O2793-500	Component of ACK lysis buffer and RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filter	Fisher Scientific	08-771-2	Used as cells strainer during HSPCs harvest
Gibco Fetal bovine serum (FBS)	Fisher Scientific	26400044	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Gibco HBSS	Fisher Scientific	14175095	Used to prepare assay buffer during HSPCs harvest
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528	Component of mitochondrial stress test assay medium and first injection of glycolysis stress test
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876	2nd drug injection during glycolysis stress test and 1st drug injection during mitochondrial stress test
PBS	Life Technologies	10010-049	Used to wash cells after assay for protein quantification
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Fisher Scientific	P235-500	Component of ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)	Roche	11836170001	Supplied as tablets. One tablet was dissolved in 10 mL of RIPA buffer to make 1x PIC.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2	Biolegend	103203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5	Biolegend	100103	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2	Biolegend	100243	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3	Biolegend	100603	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7	Biolegend	100703	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5	Biolegend	108403	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119	Biolegend	116203	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	3rd drug injection during mitochondrial stress test
Seahorse XFe96 extracellular flux analyzer	Seahorse Biosciences now Agilent		For ECAR and OCR measurments in real time.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Used to make Cell-adhesive solution for microplate coating
Sodium chloride (NaCl)	Fisher	BP358	Component of RIPA lysis buffer
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Component of RIPA lysis buffer
Sodium Fluoride (NaF)	Sigma-Aldrich	S7920	Component of RIPA lysis buffer
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045	Prepared 1 N solution. Used for pH normalization
Streptavidin Nanobeads (MojoSort)	Biolegend	480015	Used for lineage depletion during HSPCs harvest
Tris-HCl	Fisher	BP153	Component of RIPA lysis buffer
XF base medium	Agilent	102353-100	base medium used to prepare glycolysis stress test and mitochondrial stress test assay media
XF prep station	Seahorse Biosciences		Used for non-CO2 37 °C incubations
XFe96 extracellular FluxPak	Agilent	102416-100 or 102601-100	Includes assay cartridges with utility plates, loading guide flats for loading drugs onto the assay cartridge, XF calibrant solution, and XF cell culture microplate