كسر عرضي لعظم عظم الفخذ مع دبوس التثبيت

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لإجراء الكسور على الفئران البالغة ومراقبة عملية الشفاء.

Abstract

إصلاح الكسر هو وظيفة أساسية للهيكل العظمي الذي لا يمكن نمذجته بشكل موثوق في المختبر. نموذج إصابة الفأر هو نهج فعال لاختبار ما إذا كان الجين أو المنتج الجيني أو الدواء يؤثر على إصلاح العظام لأن عظام الفئران تلخص المراحل التي لوحظت أثناء التئام الكسور البشرية. عندما يكسر الفأر أو الإنسان عظما ، تبدأ استجابة التهابية ، ويتم تنشيط السمحاق ، وهو مكان للخلايا الجذعية يحيط بالعظم نفسه ، ويتوسع. ثم تتمايز الخلايا المقيمة في السمحاق لتشكيل الكالس الناعم الوعائي. يحدث الانتقال من الكالس الناعم إلى الكالس الصلب عندما تتمايز الخلايا السلفية الهيكلية المجندة إلى خلايا معدنية ، ويؤدي جسر النهايات المكسورة إلى اتحاد العظام. ثم يخضع الكالس المعدني لإعادة التشكيل لاستعادة الشكل الأصلي وبنية العظم الملتئم. تمت دراسة التئام الكسور في الفئران باستخدام نماذج إصابة مختلفة. ومع ذلك ، فإن أفضل طريقة لتلخيص هذه العملية البيولوجية بأكملها هي اختراق المقطع العرضي لعظم طويل يشمل كلا القشرة. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن إجراء كسر عظم الفخذ المستعرض المستقر بأمان لتقييم الشفاء في الفئران البالغة. كما يتم توفير بروتوكول جراحي يتضمن تقنيات الحصاد والتصوير التفصيلية لتوصيف المراحل المختلفة من التئام الكسور.

Introduction

تحدث الكسور ، والفواصل في استمرارية سطح العظام ، في جميع شرائح السكان. تصبح شديدة في الأشخاص الذين لديهم عظام هشة بسبب الشيخوخة أو المرض ، ومن المتوقع أن تتجاوز تكاليف الرعاية الصحية لكسور الهشاشة 25 مليار دولار في 5 سنوات¹،²،^3،4،5. سيكون فهم الآليات البيولوجية المشاركة في إصلاح الكسور نقطة انطلاق في تطوير علاجات جديدة تهدف إلى تعزيز عملية الشفاء. وقد أظهرت الأبحاث السابقة أنه عند الكسر ، تحدث أربع خطوات مهمة تمكن العظام من الشفاء: (1) تكوين الورم الدموي. (2) تشكيل الكالس الغضروفي الليفي. (3) تمعدن الكالس الناعم لتشكيل العظام ؛ و (4) إعادة تشكيل العظام الملتئمة ^6,7. يتم تنشيط العديد من العمليات البيولوجية لشفاء الكسر بنجاح. أولا ، تبدأ الاستجابة الحادة المؤيدة للالتهابات مباشرة بعد الكسر ^6,7. بعد ذلك ، يتم تنشيط السمحاق ويتوسع ، وتتمايز الخلايا السمحاق إلى خلايا غضروفية لتشكيل الكالس الغضروفي الذي ينمو لملء الفجوة التي خلفتها شرائح العظام المعطلة^6،7،^8،9. تغزو الخلايا العصبية والوعائية الكالس المتشكل حديثا لتوفير خلايا إضافية وجزيئات إشارات ضرورية لتسهيل الإصلاح⁶،⁷،^8،9،10. بالإضافة إلى المساهمة في تكوين الكالس ، تتمايز الخلايا السمحاق أيضا إلى خلايا عظمية تضع عظاما منسوجة في الكالس الجسر. وأخيرا، تعيد الخلايا العظمية تشكيل العظم المشكل حديثا للعودة إلى شكله الأصلي وهيكله الرقائقي⁷،^8،9،^10،11. طورت العديد من المجموعات نماذج الماوس لإصلاح الكسور. أحد نماذج الكسور السابقة والأكثر استخداما في الفئران هو نهج أينهورن ، حيث يتم إسقاط الوزن على الساق من ارتفاع محدد¹². عدم السيطرة على الزاوية والقوة المطبقة للحث على الكسر يخلق الكثير من التباين في موقع وحجم انقطاع العظام. في وقت لاحق ، فإنه يؤدي إلى اختلافات في استجابة التئام الكسور المحددة التي لوحظت. الأساليب الشائعة الأخرى هي التدخل الجراحي لإنتاج عيب أحادي القشرة الظنبوبي أو كسور الإجهاد ، وهي إجراءات تحفز استجابات الشفاء الأكثر اعتدالا نسبيا^10,13. يرجع التباين في هذه النماذج في المقام الأول إلى الشخص الذي يجري الإجراء¹⁴.

هنا ، يسمح نموذج مفصل لإصابة عظم الفخذ بالتحكم في الكسر لتوفير إصابة قابلة للتكرار والسماح بالتقييم الكمي والنوعي لإصلاح كسر عظم الفخذ. على وجه التحديد ، يتم إدخال اختراق كامل في عظم الفخذ للفئران البالغة ويستقر في نهايات الكسر لحساب الدور الذي يلعبه التحميل البدني في التئام العظام. كما يتم توفير طرق حصاد الأنسجة وتصوير الخطوات المختلفة لعملية الشفاء باستخدام علم الأنسجة والتصوير المقطعي المحوسب (microCT) بالتفصيل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في منطقة هارفارد الطبية. تم استخدام الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا (ذكورا وإناثا) في هذا البروتوكول. C57BL/6J الفئران الذكور والإناث تحقيق ذروة كتلة العظام حوالي 12 أسبوعا من العمر مع عظم الفخذ واسعة بما يكفي لتناسب دبوس الاستقرار، مما يجعلها سلالة مناسبة لاستخدامها لهذا البروتوكول¹⁵.

1. التحضير للجراحة

1. قم بتعقيم المعدات الجراحية ، بما في ذلك المقص الجراحي ، والملقط المستقيم ، والملقط المنحني ، والمشابك الجراحية ، وعجلة القطع الماسية (انظر جدول المواد) لتقليل خطر العدوى.
2. ضع قفص فأر نظيف على وسادة تدفئة لتسهيل التعافي بعد الجراحة. اضبط وسادة الحرارة للوصول إلى درجة حرارة تتراوح بين 37-45 درجة مئوية.
3. ضع الفأر تحت التخدير باستخدام غرفة الأيزوفلوران. اضبط تدفق الأكسجين الحثي عند 2 لتر / دقيقة ، وتحريض الأيزوفلوران عند 2-4٪ ، وأكسجين مخروط الأنف عند 2 لتر / دقيقة ، وصيانة الأيزوفلوران هو 1.4٪.
4. تأكد من أن تنفس الماوس مستقر ولا يستجيب لقرصة إصبع القدم. ضع طبقة رقيقة من مرهم العيون على كل عين لمنع خدش القرنية. انقل الماوس إلى وسادة معقمة وحافظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف لتوصيل الأيزوفلوران بشكل مستمر بنفس المعدل كما في الخطوة 1.3.
   ملاحظة: يوصى باستخدام الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا أو أكبر لأن عظم الفخذ من الفئران الأصغر سنا قد يكون رقيقا جدا بحيث لا يمكنه استيعاب دبوس التثبيت.
5. حقن الفأر تحت الجلد بوزن جسم 0.05 مغ/كغ من البوبرينورفين بطيء الإطلاق (انظر جدول المواد).
6. باستخدام أداة تشذيب كهربائية ، احلق مربعا 2 × 2 سم على كلا الفخذين يتوافق مع موقع عظم الفخذ.
7. قم بتطهير المنطقة المحلوقة باستخدام شاش معقم أو مسحات لنشر طبقة من اليود تليها شطف بنسبة 70٪ من الإيثانول (الشكل 1A).

2. الجراحة

1. باستخدام مشرط معقم ، قم بعمل شق 5 مم في المنطقة المحلوقة والمطهرة وقشر الجلد لكشف اللفافة الأساسية.
2. استخدم ملقط مستقيم ومقص ناعم للإمساك بدقة باللفافة التي تغطي عظم الفخذ مباشرة وقطعها لفضح العضلات. قطع 5 مم من اللفافة يكفي للوصول إلى العضلات الأساسية.
3. باستخدام زوج واحد من الملقط المستقيم ، افصل العضلات بلطف عن عظم الفخذ مع الحد الأدنى من تلف الأنسجة.
4. بمجرد أن يصبح عظم الفخذ مرئيا ، حرك الملقط المنحني أسفل عظم الفخذ بين العضلات والعظم المنفصلين. دع الملقط يفتح ببطء للحفاظ على فصل العضلات وتأمين عظم الفخذ لتسهيل القطع النظيف.
   ملاحظة: يجب أن يظل عظم الفخذ مكشوفا ومنفصلا عن العضلات والجلد عندما لا يتم تثبيت الملقط ، كما هو موضح في الشكل 1B.
5. قم بإجراء قطع عرضي في منتصف عمود عظم الفخذ باستخدام منشار محمول باليد على إعداد الطاقة المنخفضة (انظر جدول المواد للاطلاع على الشفرة ومجموعة الأدوات الدوارة المستخدمة).
   ملاحظة: بمجرد قطع عظم الفخذ بالكامل ، يتم إنشاء نهايتين للكسر: القسم القريب (المتصل بعظم الورك) والقسم البعيد (المتصل بالركبة ، المعروف أيضا باسم مفصل الخنق). تجنب قطع عظم الفخذ في حركة واحدة. بدلا من ذلك ، اجعل 3-5 تمريرات حتى يتم قطع عظم الفخذ بالكامل. هذا أمر بالغ الأهمية لتجنب ارتفاع درجة حرارة الأنسجة المحيطة وتوليد حطام عظمي كبير ، مما يؤثر سلبا على الشفاء.
6. أدخل إبرة توجيه (23 جم × 1 TW IM، 0.6 مم × 25 مم) (انظر جدول المواد) في تجويف النخاع في القسم البعيد. استخدم الأصابع لثني الإبرة بلطف أثناء الدفع للخيط عبر مفصل الركبة (الشكل 1C).
   1. قم بإزالة إبرة التوجيه من الطرف البعيد وكرر ذلك على الطرف القريب ، باستخدام نفس الحركة الملتوية اللطيفة لدفع إبرة التوجيه عبر مفصل الورك. اترك إبرة الدليل في الطرف القريب ، مع ظهور طرفها من الجلد (الشكل 1D).
      ملاحظة: لتحقيق الاستقرار في نهايات الكسر، تم استخدام إبرة توجيه لأول مرة لإنشاء مسار عبر نهايات الكسر، ثم تم ربط دبوس تثبيت عبر هذا المسار لتأمين نهايات الكسر¹⁴.
7. أدخل دبوس التثبيت (إبرة، 27 جم × 1 1/4، 0.4 مم × 30 مم) (انظر جدول المواد) في طرف إبرة التوجيه (الشكل 1E). ادفع بلطف حتى يدخل دبوس التثبيت أثناء خروج إبرة التوجيه من تجويف النخاع في الطرف القريب.
   1. تخلص من إبرة التوجيه. استخدم الملقط لتثبيت الطرف البعيد ومحاذاته مع الطرف القريب والاستمرار في ربط دبوس التثبيت عبر تجويف النخاع البعيد حتى يخرج من مفصل الركبة باستخدام المسار المصنوع في 2.6 (الشكل 1F).
      ملاحظة: يجب أن يكون دبوس التثبيت بارزا الآن من مفاصل الورك والركبة.
8. باستخدام المشبك الجراحي ، اسحب طرف الدبوس لتقريب الأقسام القريبة والبعيدة من بعضها البعض ، بحيث بالكاد تلمس. أعد محاذاة نهايات الكسر بملقط إذا لزم الأمر، وقم بطي نهايات دبوس التثبيت باتجاه موقع الكسر باستخدام المشبك الجراحي (انظر جدول المواد).
   1. قم بإزالة البلاستيك من قاعدة الإبرة باستخدام قواطع الأسلاك. باستخدام المشبك ، قم بلف طرفي الدبوس حتى يكونا حادين لتجنب تلف الأنسجة الداخلية.
      ملاحظة: يتم الآن قفل نهايات الكسر في مكانها بحيث يمكن للفأر وضع وزن على الساق المصابة. يتم تأمين الدبوس إذا كانت نهايات الكسر غير قادرة على الانفصال. يمكن أيضا استخدام قاطع الأسلاك لتخفيف النهايات. يجب أن يبقى دبوس التثبيت في مكانه طوال مدة الدراسة حتى يتم القتل الرحيم للماوس. من المرجح أن تؤدي محاولات إزاحة الدبوس إلى زعزعة استقرار استجابة الكسر والتسبب في ضرر للحيوان. يمكن إزالة الدبوس عند التشريح.
9. استخدم ملقط مستقيم لإعادة وضع العضلات على عظم الفخذ. باستخدام ملقط منحني ، قرصة نهايات الجلد معا وإغلاق الفتحة باستخدام مشابك الجرح.
   ملاحظة: لا تغلق الجلد بإحكام شديد باستخدام المشابك وإلا فإن الماوس سيتجنب وضع وزن على هذه الساق. الحد من التحميل المادي أثناء الشفاء يمكن أن يؤخر عملية الشفاء.
10. كرر الخطوات من 2.2 إلى 2.4 على الساق الأخرى وأغلق الجرح دون إجراء كسر عظم الفخذ.
    ملاحظة: يعمل عظم الفخذ الذي يتم تشغيله بشكل صوري كعنصر تحكم مضاد.
11. اسحب التعرض للإيسوفلوران ، وضع الماوس في القفص الساخن ، وتأكد من استعادة وعيه في غضون 10-15 دقيقة.
12. راقب نشاط الماوس وموقع شقه يوميا لمدة 5 أيام بعد الجراحة بحثا عن علامات الضيق أو العدوى.
    ملاحظة: إذا أظهر الحيوان علامات الألم ، ولا يأكل ، و / أو يتردد في المشي على أطرافه الخلفية ، فاستشر الموظفين البيطريين وإعطاء مسكن إضافي.
13. قم بإزالة مقاطع الجرح بعد 10 أيام من الجراحة.
    ملاحظة: إذا لم يبدو أن الجرح قد أغلق بعد 10 أيام ، فاستشر الشخص البيطري و IACUC قبل إزالة المقاطع.

3. حصاد الأنسجة

1. القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO₂ يليه خلع عنق الرحم.
   ملاحظة: يتسق هذا الإجراء مع الفريق المعني بالقتل الرحيم التابع للجمعية الطبية البيطرية الأمريكية.
2. باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة الجلد من ساقي الفأر ، وخلع رأس الفخذ من عظم الورك ، وقطع العضلات المجاورة لتحرير الساق.
   ملاحظة: تجنب إزالة الكثير من العضلات حول عظم الفخذ حيث يمكن إزاحة الكالس أو تلفه.
3. تجنب دبوس التثبيت ، وقطع من خلال مفصل الركبة لفصل عظم الفخذ عن الساق.
4. تشريح حول الأجزاء البعيدة والقريبة من عظم الفخذ لفضح نهايات دبوس التثبيت.
5. باستخدام قاطع سلك صلب ، قم بقطع الأطراف الحادة المطوية للدبوس بحيث يبقى الجزء المستقيم فقط من الدبوس. استخدم الملقط لتحريك دبوس التثبيت ببطء ولطف خارج عظم الفخذ.
   ملاحظة: إذا لم ينزلق الدبوس بسهولة، فلا تستخدم القوة لأن ذلك قد يؤدي إلى إزاحة الكالس وإتلاف العينة. بدلا من ذلك ، حاول تدوير الدبوس وإزالته بدقة. قد تكون إزالة الدبوس أسهل أيضا بعد التثبيت.

4. علم الأنسجة - ألسيان الأزرق / Eosin / البرتقالي G تلطيخ

ملاحظة: يستخدم تلطيخ Alcian Blue / Orange G / Eosin بشكل روتيني لتصور الغضروف (الأزرق) والعظم (الوردي). يمكن تحديد مساحة الغضروف كميا كنسبة من إجمالي مساحة الكالس (الشكل 2A ، B).

1. إصلاح عظم الفخذ في 10٪ محايد الفورمالين المخزن مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
2. اغسل العينات الثابتة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
3. ضع العينات في 0.5M EDTA ، الرقم الهيدروجيني 8.0 على شاكر دوار ببطء لمدة 2 أسابيع. قم بتغيير حل EDTA كل يومين لضمان إزالة الكلس بكفاءة.
   ملاحظة: لا يلزم وجود دورة محددة في الدقيقة للشاكر. تأكد من تدفق السائل في الحاوية لتغطية جميع العينات. يمكن اختبار إزالة الكلس الكاملة عن طريق الأشعة السينية لعظم الفخذ.
4. لمعالجة عينات تضمين البارافين ، احتضنها في المحاليل التالية (1 ساعة لكل منها): 70٪ EtOH ، 95٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، Xylene ، Xylene ، Paraaffin ، Paraffin.
5. تضمين العينات في البارافين للتقسيم.
6. قطع 5-7 ميكرومتر أقسام طولية سميكة من عظم الفخذ المكسور باستخدام ميكروتوم.
7. إزالة paraffinize الأقسام عن طريق احتضانها في 2 حمامات من Xylene (5 دقائق لكل منهما).
8. أعد ترطيب الأقسام عن طريق احتضان تدرج الإيثانول التالي (2 دقيقة لكل منهما): 100٪ EtOH ، 100٪ EtOH ، 80٪ EtOH ، 70٪ EtOH.
9. ضع الشرائح في ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
10. اصنع محاليل من الأزرق السياني والكحول الحمضي وماء الأمونيوم والإيوسين / البرتقالي G لعلم الأنسجة كما هو مذكور في الملف التكميلي 1.
    ملاحظة: يجب أن تكون الأحجام المقترحة لكل حل كافية لغمر الشرائح بالكامل للتلطيخ.
11. ضع الشرائح في الكحول الحمضي لمدة 30 ثانية واحتضنها باللون الأزرق السياني لمدة 40 دقيقة.
12. اغسل بلطف تحت الصنبور الجاري حتى يصبح الماء صافيا لمدة 2 دقيقة.
13. اغمس الشرائح بسرعة في الكحول الحمضي لمدة 1 ثانية.
14. شطف كما هو موضح في الخطوة 4.9.
15. حضانة في ماء الأمونيوم لمدة 15 ثانية.
16. شطف كما هو موضح في الخطوة 4.9.
17. ضع في 95٪ EtOHلمدة 1 دقيقة واحتضنه في Eosin/Orange G لمدة 90 ثانية.
18. جفف الشرائح بسرعة مع انخفاض واحد في 70٪ EtOH، 80٪ EtOH و 100٪ EtOH.
19. ضع الشرائح في Xylene لمدة 1 دقيقة لمسح الشرائح.
20. قم بتطبيق وسائط التركيب وغطاء للتصوير.
    ملاحظة: بالنسبة للتحليل الجزيئي ، يمكن عزل الحمض النووي الريبي والبروتين من الكالس. تشريح العضلات بعناية تحت نطاق تشريح وفصل الكالس عن العظم الأساسي باستخدام مشرط.

5. ميكرو سي تي

ملاحظة: في المراحل اللاحقة من الشفاء ، يمكن إجراء microCT لتصوير وقياس التمعدن في الكالس الصلب وفجوة الكسر. في الفئران C57BL/6J ، عادة ما يتم تمعدن الكالس ويمكن اكتشافه بواسطة microCT بعد 10 أيام بعد الكسر (dpf) (الشكل 2C).

1. إصلاح عظم الفخذ في 10٪ محايد الفورمالين المخزن مؤقتا بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن إجراء التصوير المقطعي المحوسب المجهري على نفس عظم الفخذ المستخدم في علم الأنسجة طالما أنه يتم قبل إزالة الكلس من EDTA (الخطوة 4.3). عند استخدام نفس عظم الفخذ لكلتا التقنيتين ، قم بإجراء microCT ، واسترجع العينات وانتقل إلى الخطوة 4.3.
2. اغسل العينات الثابتة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وخزنه في 70٪ EtOH.
3. قم بإجراء microCT بحجم فوكسل متساوي الخواص يبلغ 7 ميكرومتر عند مستوى طاقة 55 kVP وكثافة 145 μA (انظر جدول المواد).
4. حدد ملامح شرائح microCT لتشمل الكالس واستبعاد العظم القشري.
   ملاحظة: عندما يصبح الكالس أكثر تمعدنا مع مرور الوقت، يمكن تعديل العتبة لتصور وقياس حجم الكالس في مراحل مختلفة.
5. الحصول على حجم العظام الموجود في ملامح الكالس كقياس لحجم الكالس.
   ملاحظة: يمكن قياس فجوة الكسر مباشرة على شرائح microCT كمسافة يشغلها الكسر.

النتائج

في الفئران C57BL/6J ، تكمل الجراحة الناجحة خطوات الشفاء المذكورة سابقا مع استجابة التهابية محلية قليلة أو معدومة أو مشاركة سمحاق في عظم الفخذ المضاد الذي يتم تشغيله بشكل صوري. يتشكل ورم دموي بعد ساعات قليلة من الجراحة ، ويتم تنشيط السمحاق لتجنيد أسلاف الهيكل العظمي لتكوين الغضروف. يمكن تتبع م...

Discussion

يشمل نموذج الإصابة المفصل في هذا البروتوكول جميع الخطوات الأربع الهامة التي لوحظت أثناء التئام الكسور التلقائية ، بما في ذلك (1) الاستجابة المؤيدة للالتهابات مع تكوين الورم الدموي ، (2) تجنيد أسلاف الهيكل العظمي من السمحاق لتشكيل الكالس الناعم ، (3) تمعدن الكالس بواسطة الخلايا العظمية و (4) إ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm