带稳定针的小鼠股骨横断

摘要

该协议描述了一种对成年小鼠进行骨折并监测愈合过程的方法。

摘要

骨折修复是骨骼的基本功能，无法在 体外可靠地建模。小鼠损伤模型是测试基因，基因产物或药物是否影响骨修复的有效方法，因为小鼠骨骼概括了在人类骨折愈合期间观察到的阶段。当小鼠或人类骨折时，炎症反应被启动，骨膜，围绕骨骼本身的干细胞生态位，被激活并扩张。然后，居住在骨膜中的细胞分化形成血管化的软愈伤组织。从软愈伤组织到硬愈伤组织的转变发生在新募集的骨骼祖细胞分化成矿化细胞时，骨折末端的桥接导致骨愈合。然后，矿化的愈伤组织进行重塑，以恢复愈合骨的原始形状和结构。已经使用各种损伤模型在小鼠中研究了骨折愈合。尽管如此，概括整个生物过程的最佳方法是突破包含两个皮质的长骨的横截面。该协议描述了如何安全地进行稳定的横贯性股骨骨折以评估成年小鼠的愈合情况。还提供了手术方案，包括详细的收获和成像技术，以表征骨折愈合的不同阶段。

引言

骨折，骨表面连续性的断裂，发生在人群的所有部分。由于衰老或疾病而骨骼脆弱的人，它们变得严重，脆性骨折的医疗保健费用预计将在5年内超过250亿美元^{1，2，3，4，5}。了解骨折修复所涉及的生物学机制将是开发旨在增强愈合过程的新疗法的起点。以前的研究表明，骨折后，会发生四个重要步骤，使骨骼愈合：（1）血肿的形成;（2）形成纤维软骨愈伤组织;（3）软愈伤组织矿化形成骨骼;（4）愈合骨的重塑^6，7。许多生物过程被激活以成功愈合骨折。首先，在骨折后立即启动急性促炎反应^6，7。然后，骨膜被激活并扩张，骨膜细胞分化成软骨细胞以形成软骨愈伤组织，其生长以填充被破坏的骨节段^6，7，8，

研究方案

所有描述的动物实验都得到了哈佛医学区机构动物护理和使用委员会的批准。该方案使用12周龄的C57BL / 6J小鼠（雄性和雌性）。C57BL / 6J雄性和雌性小鼠在12周龄左右达到峰值骨量，股骨宽度足以适合稳定针，使它们成为用于该方案的适当菌株¹⁵。

1. 手术准备

1. 高压灭菌手术设备，包括手术剪刀、直钳、弯曲镊子、手术夹具和金刚石切割轮（见 材料表），以最大限度地降低感染风险。
2. 将干净的小鼠笼放在加热垫上，以方便术后恢复。将加热垫设置为达到37-45°C之间的温度。
3. 使用异氟醚室将小鼠置于麻醉状态。将诱导氧流量设置为2 L /min，异氟醚诱导量设置为2-4%，维持鼻锥氧气设置为2 L / min，维持异氟醚为1.4%。
4. 确认鼠标的呼吸是稳定的，并且它们对脚趾捏合没有反应。在每只眼睛上涂抹一层薄薄的眼药膏，以防止角膜刮伤。将小鼠转移到无菌垫上，并使用鼻锥保持麻醉，以与步骤1.3相同的速率连续输送异氟醚。
   注意：建议使用12周龄或更大的小鼠，因为年轻小鼠的股骨可能太薄而无法容纳稳定针。
5. 皮下注射小鼠0.05mg / kg体重的缓释丁丙诺啡（见 材料表）。
6. 使用电动修剪器，在两条大腿上剃除一个2 x 2厘米的....

结果

在C57BL / 6J小鼠中，成功的手术完成了前面提到的愈合步骤，几乎没有局部炎症反应或假手术对侧股骨的骨膜受累。术后几小时形成血肿，骨膜被激活以招募骨骼祖细胞进行软骨发育。各种细胞群，如Prx1 ⁺ 间充质祖细胞，可以在修复过程中使用市售荧光报告小鼠模型进行追踪（图3）。在骨折后5天（dpf），Alcian Blue染色可用于可视化软愈伤组织，随后量化软骨区域（

讨论

该协议中详述的损伤模型包括在自发性骨折愈合期间观察到的所有四个重要步骤，包括（1）随着血肿的形成而引起的促炎反应，（2）骨骼祖细胞从骨膜中募集形成软愈伤组织，（3）成骨细胞矿化愈伤组织，以及（4）破骨细胞重塑骨骼。

本手稿中描述的外科手术针对至少12周大的成年小鼠进行了优化。27 G x 1 1/4 （0.4 mm x 30 mm） 针头用作稳定针，因为它是这个年龄段骨髓腔宽?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm