Fratura transversa do fêmur do rato com pino estabilizador

Resumo

Este protocolo descreve um método para realizar fraturas em camundongos adultos e monitorar o processo de cura.

Resumo

O reparo da fratura é uma função essencial do esqueleto que não pode ser modelado de forma confiável in vitro. Um modelo de lesão do camundongo é uma abordagem eficiente para testar se um gene, produto genético ou droga influencia a reparação óssea porque os ossos da murina recapitulam os estágios observados durante a cicatrização da fratura humana. Quando um rato ou humano quebra um osso, uma resposta inflamatória é iniciada, e o periosteum, um nicho de células-tronco ao redor do próprio osso, é ativado e se expande. As células que residem no periósteo então se diferenciam para formar um calo macio vascularizado. A transição do calo macio para um calo duro ocorre à medida que as células progenitoras esqueléticas recrutadas se diferenciam em células mineralizadoras, e a ponte das extremidades fraturadas resulta na união óssea. O calo mineralizado passa então por remodelação para restaurar a forma original e a estrutura do osso curado. A cicatrização de fraturas tem sido estudada em camundongos usando vários modelos de lesões. Ainda assim, a melhor maneira de recapitular todo esse processo biológico é romper a seção transversal de um osso longo que engloba ambos os cortices. Este protocolo descreve como uma fratura de fêmur transversal estabilizada pode ser realizada com segurança para avaliar a cicatrização em camundongos adultos. Também é fornecido um protocolo cirúrgico, incluindo técnicas detalhadas de colheita e imagem para caracterizar os diferentes estágios de cicatrização da fratura.

Introdução

Fraturas, quebras na continuidade da superfície óssea, ocorrem em todos os segmentos da população. Eles se tornam graves em pessoas que têm ossos frágeis devido ao envelhecimento ou doença, e os custos de cuidados de saúde das fraturas por fragilidade devem ultrapassar US$ 25 bilhões em 5 anos 1,2,3,4,5. Compreender os mecanismos biológicos envolvidos na reparação de fraturas seria um ponto de partida no desenvolvimento de novas terapias visando melhorar o processo de cicatrização. Pesquisas anteriores most....

Protocolo

Todos os experimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Área Médica de Harvard. Foram utilizados neste protocolo camundongos C57BL/6J de 12 semanas (machos e fêmeas). Camundongos machos e fêmeas C57BL/6J atingem o pico de massa óssea em torno de 12 semanas de idade com fêmures largos o suficiente para caber em um pino estabilizador, tornando-os uma cepa apropriada para usar para este protocolo¹⁵.

1. Preparação para a cirurgia

1. Autoclave o equipamento cirúrgico, incluindo tesoura cirúrgica, fórceps retos, fórceps curvos, grampos cir....

Resultados

Em camundongos C57BL/6J, uma cirurgia bem sucedida completa os passos de cura mencionados anteriormente com pouca ou nenhuma resposta inflamatória local ou envolvimento periosteal no fêmur contralateral operado pela farsa. Um hematoma é formado algumas horas após a cirurgia, e o periosteum é ativado para recrutar progenitores esqueléticos para condrogênese. Várias populações de células, como progenitores mesenquimais Prx1⁺, podem ser rastreadas durante o processo de reparo usando modelos de mouse fl.......

Discussão

O modelo de lesão detalhado neste protocolo abrange todos os quatro passos significativos observados durante a cicatrização de fraturas espontâneas, incluindo (1) resposta pró-inflamatória com a formação do hematoma, (2) recrutamento de progenitores esqueléticos do periósteo para formar o calo macio, (3) mineralização do calo por osteoblastos e (4) remodelação do osso por osteoclasstos.

O procedimento cirúrgico descrito neste manuscrito é otimizado para camundongos adultos com .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm