Fracture transversale du fémur de la souris avec broche stabilisatrice

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour effectuer des fractures sur des souris adultes et surveiller le processus de guérison.

Résumé

La réparation des fractures est une fonction essentielle du squelette qui ne peut pas être modélisée de manière fiable in vitro. Un modèle de blessure chez la souris est une approche efficace pour tester si un gène, un produit génétique ou un médicament influence la réparation osseuse, car les os murins récapitulent les étapes observées lors de la guérison des fractures humaines. Lorsqu’une souris ou un humain casse un os, une réponse inflammatoire est déclenchée et le périoste, une niche de cellules souches entourant l’os lui-même, est activé et se dilate. Les cellules résidant dans le périoste se différencient alors pour former un callosité molle vascularisée. La transition du callosité molle à un callosité dure se produit lorsque les cellules progénitrices squelettiques recrutées se différencient en cellules minéralisantes, et le pontage des extrémités fracturées entraîne l’union osseuse. Le cal minéralisé subit ensuite un remodelage pour restaurer la forme et la structure d’origine de l’os guéri. La guérison des fractures a été étudiée chez la souris à l’aide de divers modèles de blessures. Pourtant, la meilleure façon de récapituler l’ensemble de ce processus biologique est de percer la section transversale d’un os long qui englobe les deux cortex. Ce protocole décrit comment une fracture transversale du fémur stabilisée peut être réalisée en toute sécurité pour évaluer la guérison chez les souris adultes. Un protocole chirurgical comprenant des techniques détaillées de prélèvement et d’imagerie pour caractériser les différentes étapes de la cicatrisation des fractures est également fourni.

Introduction

Les fractures, ruptures dans la continuité de la surface osseuse, se produisent dans tous les segments de la population. Ils deviennent graves chez les personnes dont les os sont fragiles en raison du vieillissement ou d’une maladie, et les coûts des soins de santé liés aux fractures de fragilité devraient dépasser 25 milliards de dollars dans 5 ans ^1,2,3,4,5. Comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la réparation des fractures serait un point de départ dans le développement de nouvelles thérapies visant à améliorer le processus de guérison. Des recherches antérieures ont montré que, lors d’une fracture, quatre étapes importantes se produisent qui permettent à l’os de guérir: (1) formation de l’hématome; (2) formation d’un cal fibrocartilagineux; 3° la minéralisation du cal mou pour former l’os; et (4) remodelage de l’os guéri ^6,7. De nombreux processus biologiques sont activés pour guérir la fracture avec succès. Tout d’abord, une réponse pro-inflammatoire aiguë est initiée immédiatement après une fracture ^6,7. Ensuite, le périoste s’active et se dilate, et les cellules périostées se différencient en chondrocytes pour former un callosité cartilagineuse qui se développe pour combler le vide laissé par les segments osseux perturbés 6,7,8,9. Les cellules neurales et vasculaires envahissent le callosité nouvellement formé pour fournir des cellules supplémentaires et des molécules de signalisation nécessaires pour faciliter la réparation ^6,7,8,9,10. En plus de contribuer à la formation de callosités, les cellules périostéales se différencient également en ostéoblastes qui déposent de l’os tissé dans le callosité de pontage. Enfin, les ostéoclastes remodèlent l’os nouvellement formé pour retrouver sa forme et sa structure lamellaire ^{d’origine 7,8,9,10,11}. De nombreux groupes ont développé des modèles murins de réparation des fractures. L’un des modèles de fracture les plus anciens et les plus souvent utilisés chez la souris est l’approche d’Einhorn, où un poids est lâché sur la jambe à partir d’une hauteur spécifique^{de 12}. Le manque de contrôle sur l’angle et la force appliquée pour induire la fracture crée beaucoup de variabilité dans l’emplacement et la taille de la discontinuité osseuse. Par la suite, il en résulte des variations dans la réponse spécifique de guérison des fractures observée. D’autres approches populaires sont l’intervention chirurgicale pour produire un défaut monocortical tibial ou des fractures de stress, des procédures qui induisent des réponses de guérison comparativement plus douces^10,13. La variabilité de ces modèles est principalement due à la personne qui effectue la procédure¹⁴.

Ici, un modèle détaillé de blessure au fémur de souris permet de contrôler la rupture pour fournir une blessure reproductible et permettre une évaluation quantitative et qualitative de la réparation de la fracture du fémur. Plus précisément, une percée complète dans les fémurs des souris adultes est introduite et stabilise les extrémités de la fracture pour tenir compte du rôle que joue la charge physique dans la guérison osseuse. Les méthodes de prélèvement des tissus et d’imagerie des différentes étapes du processus de guérison à l’aide de l’histologie et de la microterroriste (microCT) sont également fournies en détail.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee du Harvard Medical Area. Des souris C57BL/6J âgées de 12 semaines (mâles et femelles) ont été utilisées dans ce protocole. Les souris mâles et femelles C57BL/6J atteignent une masse osseuse maximale vers l’âge de 12 semaines avec des fémurs suffisamment larges pour s’adapter à une broche stabilisatrice, ce qui en fait une souche appropriée à utiliser pour ce protocole¹⁵.

1. Préparation à la chirurgie

1. Autoclavez l’équipement chirurgical, y compris les ciseaux chirurgicaux, les pinces droites, les pinces incurvées, les pinces chirurgicales et la roue de coupe au diamant (voir tableau des matériaux) pour minimiser le risque d’infection.
2. Placez une cage de souris propre sur un coussin chauffant pour faciliter la récupération post-chirurgicale. Réglez le coussin chauffant pour qu’il atteigne une température comprise entre 37 et 45 °C.
3. Placez la souris sous anesthésie à l’aide d’une chambre d’isoflurane. Réglez le débit d’oxygène d’induction à 2 L / min, l’induction d’isoflurane à 2-4%, l’oxygène du cône de nez d’entretien à 2 L / min et l’isoflurane d’entretien à 1,4%.
4. Vérifiez que la respiration de la souris est stable et qu’elle ne répond pas à un pincement d’orteil. Appliquez une fine couche de pommade ophtalmique sur chaque œil pour éviter les égratignures cornéennes. Transférer la souris sur un coussinet stérile et maintenir l’anesthésie à l’aide d’un cône nasal pour administrer de l’isoflurane en continu au même rythme qu’à l’étape 1.3.
   REMARQUE: L’utilisation de souris âgées de 12 semaines ou plus est recommandée car les fémurs de souris plus jeunes peuvent être trop minces pour accueillir une broche stabilisatrice.
5. Injecter à la souris par voie sous-cutanée 0,05 mg/kg de poids corporel de buprénorphine à libération lente (voir tableau des matériaux).
6. À l’aide d’une tondeuse électrique, rasez un carré de 2 x 2 cm sur les deux cuisses correspondant à l’emplacement du fémur.
7. Désinfecter la zone rasée à l’aide de gaze stérile ou d’écouvillons pour étaler une couche d’iode suivie d’un rinçage à 70 % d’éthanol (figure 1A).

2. Chirurgie

1. À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision de 5 mm dans la région rasée et désinfectée et pelez la peau pour exposer le fascia sous-jacent.
2. Utilisez des pinces droites et des ciseaux fins pour saisir et couper délicatement le fascia recouvrant directement le fémur afin d’exposer le muscle. Une coupe de 5 mm du fascia est suffisante pour accéder au muscle sous-jacent.
3. À l’aide d’une paire de pinces droites, séparez doucement le muscle du fémur avec un minimum de lésions tissulaires.
4. Une fois le fémur visible, faites glisser les pinces incurvées sous le fémur entre le muscle et l’os séparés. Laissez les pinces s’ouvrir lentement pour maintenir la séparation musculaire et fixez le fémur pour faciliter une coupe nette.
   REMARQUE: Le fémur doit rester exposé et séparé du muscle et de la peau lorsque les pinces ne sont pas maintenues, comme le montre la figure 1B.
5. Effectuez une coupe transversale au milieu de l’arbre du fémur à l’aide d’une scie portative sur le réglage de faible puissance (voir tableau des matériaux pour la lame et le kit d’outils rotatifs utilisés).
   REMARQUE: Une fois le fémur complètement coupé, deux extrémités de fracture sont créées: la section proximale (attachée à l’os de la hanche) et la section distale (attachée au genou, également connue sous le nom d’articulation étouffante). Évitez de couper le fémur en un seul mouvement. Au lieu de cela, faites 3-5 passes jusqu’à ce que le fémur soit complètement coupé. Ceci est essentiel pour éviter de surchauffer les tissus environnants et de générer des débris osseux importants, ce qui a un impact négatif sur la guérison.
6. Insérer une aiguille guide (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (voir tableau des matériaux) dans la cavité médullaire de la section distale. Utilisez les doigts pour tordre doucement l’aiguille lorsque vous poussez pour enfiler l’articulation du genou (Figure 1C).
   1. Retirez l’aiguille de guidage de l’extrémité distale et répétez sur l’extrémité proximale, en utilisant le même mouvement de torsion doux pour pousser l’aiguille de guidage à travers l’articulation de la hanche. Laissez l’aiguille guide à l’extrémité proximale, dont l’extrémité a émergé de la peau (Figure 1D).
      REMARQUE: Pour stabiliser les extrémités de fracture, une aiguille guide a d’abord été utilisée pour créer une voie à travers les extrémités de fracture, puis une broche stabilisatrice a été filetée à travers cette voie pour sécuriser les extrémités de fracture¹⁴.
7. Insérez la broche stabilisatrice (aiguille, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (voir tableau des matériaux) dans la pointe de l’aiguille guide (figure 1E). Poussez doucement pour que la broche stabilisatrice pénètre lorsque l’aiguille de guidage sort de la cavité médullaire de l’extrémité proximale.
   1. Jetez l’aiguille de guidage. Utilisez une pince à épiler pour maintenir et aligner l’extrémité distale avec l’extrémité proximale et continuer à enfiler la broche stabilisatrice à travers la cavité de la moelle distale jusqu’à ce qu’elle sorte de l’articulation du genou en utilisant la voie faite en 2.6 (Figure 1F).
      REMARQUE: La broche stabilisatrice doit maintenant dépasser des articulations de la hanche et du genou.
8. À l’aide de la pince chirurgicale, tirez sur la pointe de l’épingle pour rapprocher les sections proximale et distale, de sorte qu’elles se touchent à peine. Réalignez les extrémités de la fracture à l’aide d’une pince si nécessaire et pliez les extrémités de la broche stabilisatrice vers le site de la fracture à l’aide de la pince chirurgicale (voir tableau des matériaux).
   1. Retirez le plastique de la base de l’aiguille à l’aide de coupe-fil. À l’aide de la pince, tournez les deux extrémités de la broche jusqu’à ce qu’elles soient émoussées pour éviter les dommages aux tissus internes.
      REMARQUE: Les extrémités de fracture sont maintenant verrouillées en place afin que la souris puisse mettre du poids sur la jambe blessée. La broche est fixée si les extrémités de fracture ne peuvent pas se séparer. Un coupe-fil peut également être utilisé pour émousser les extrémités. La broche stabilisatrice doit rester en place pendant toute la durée de l’étude jusqu’à ce que la souris soit euthanasiée. Les tentatives de délogement de l’épingle sont susceptibles de déstabiliser la réponse à la fracture et de causer des dommages à l’animal. La broche peut être retirée à la dissection.
9. Utilisez une pince droite pour repositionner le muscle sur le fémur. À l’aide de pinces incurvées, pincez les extrémités de la peau ensemble et fermez l’ouverture à l’aide de pinces à plaie.
   REMARQUE: Ne fermez pas la peau trop fermement avec les clips ou la souris évitera de mettre du poids sur cette jambe. Limiter la charge physique pendant la récupération pourrait retarder le processus de guérison.
10. Répétez les étapes 2.2 à 2.4 sur l’autre jambe et fermez la plaie sans effectuer la fracture du fémur.
    REMARQUE: Ce fémur opéré par simulacre sert de contrôle controlatéral.
11. Retirez l’exposition à l’isoflurane, placez la souris dans la cage chauffée et assurez-vous qu’elle reprend conscience dans les 10 à 15 minutes.
12. Surveillez quotidiennement l’activité et le site d’incision de la souris pendant 5 jours après la chirurgie pour détecter tout signe de détresse ou d’infection.
    REMARQUE: Si l’animal présente des signes de douleur, ne mange pas et / ou hésite à marcher sur ses membres postérieurs, consultez le personnel vétérinaire et administrez un analgésique supplémentaire.
13. Retirez les clips de la plaie 10 jours après la chirurgie.
    REMARQUE: Si la plaie ne semble pas s’être refermée après 10 jours, consultez le vétérinaire et l’IACUC avant de retirer les clips.

3. Prélèvement de tissus

1. Euthanasier les souris par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale.
   REMARQUE: Cette procédure est conforme au groupe scientifique sur l’euthanasie de l’American Veterinary Medical Association.
2. À l’aide de ciseaux et de pinces, retirez la peau des deux pattes de souris, disloquez la tête fémorale de l’os de la hanche et coupez le muscle adjacent pour libérer la jambe.
   REMARQUE: Évitez d’enlever trop de muscle autour du fémur car le callosité pourrait être délogé ou endommagé.
3. En évitant l’épingle stabilisatrice, coupez à travers l’articulation du genou pour séparer le fémur du tibia.
4. Disséquer autour des parties distale et proximale du fémur pour exposer les extrémités de la broche stabilisatrice.
5. Avec un coupe-fil dur, coupez les extrémités émoussées pliées de la broche afin qu’il ne reste que la partie droite de la broche. Utilisez une pince pour faire glisser lentement et doucement la broche stabilisatrice hors du fémur.
   REMARQUE: Si la broche ne glisse pas facilement, n’appliquez pas de force car cela pourrait déloger le cal et endommager l’échantillon. Au lieu de cela, essayez de faire pivoter la broche et retirez-la délicatement. Le retrait de la broche peut également être plus facile après la fixation.

4. Histologie - Coloration Alcian Blue / Eosin / Orange G

REMARQUE: La coloration Alcian Blue / Orange G / Eosin est couramment utilisée pour visualiser le cartilage (bleu) et l’os (rose). La zone cartilagineuse peut être quantifiée en proportion de la surface totale des callosités (Figure 2A,B).

1. Fixer les fémurs dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit à 4 °C.
2. Laver les échantillons fixes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. Placer les échantillons dans 0,5 M EDTA, pH 8,0 sur un agitateur à rotation lente pendant 2 semaines. Changez la solution EDTA tous les deux jours pour assurer une décalcification efficace.
   REMARQUE: Aucun régime spécifique n’est requis pour le shaker; s’assurer que le liquide s’écoule dans le récipient pour couvrir tous les échantillons. La décalcification complète peut être testée par radiographie des fémurs.
4. Pour traiter les échantillons pour l’incorporation de paraffine, incubez-les dans les solutions suivantes (1 h chacune): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylène, Xylène, Paraffine, Paraffine.
5. Incorporer les échantillons dans de la paraffine pour le sectionnement.
6. Couper des sections longitudinales de 5 à 7 μm d’épaisseur des fémurs fracturés à l’aide d’un microtome.
7. Déparaffinez les sections en les incubant dans 2 bains de xylène (5 min chacun).
8. Réhydratez les sections en incubant dans le gradient d’éthanol suivant (2 min chacune): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Placez les toboggans dans l’eau du robinet pendant 1min.
10. Préparez les solutions de bleu d’Alcian, d’alcool acide, d’eau d’ammonium et d’éosine/orange G pour l’histologie comme mentionné dans le dossier supplémentaire 1.
    REMARQUE: Les volumes suggérés de chaque solution doivent être suffisants pour immerger complètement les lames pour la coloration.
11. Placez les lames dans de l’alcool acide pendant 30 s et incubez dans du bleu d’Alcian pendant 40 min.
12. Lavez doucement sous le robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire pendant environ 2 min.
13. Trempez rapidement les lames dans de l’alcool acide pendant 1 s.
14. Rincer comme décrit à l’étape 4.9.
15. Incuber dans de l’eau d’ammonium pendant 15 s.
16. Rincer comme décrit à l’étape 4.9.
17. Placer dans 95% EtOHpour 1 min et incuber dans Eosin/Orange G pendant 90 s.
18. Déshydratez rapidement les lames en un seul plongeon dans 70% EtOH, 80% EtOH et 100% EtOH.
19. Placez les diapositives dans le xylène pendant 1 min pour dégager les diapositives.
20. Appliquez un support de montage et un couvercle pour l’imagerie.
    REMARQUE: Pour l’analyse moléculaire, l’ARN et la protéine peuvent être isolés du cal. Disséquez soigneusement le muscle sous une lunette de dissection et séparez le cal de l’os sous-jacent à l’aide d’un scalpel.

5. MicroCT

REMARQUE: Dans les derniers stades de la guérison, la microCT peut être effectuée pour imager et quantifier la minéralisation dans le cal dur et l’écart de fracture. Chez les souris C57BL/6J, le callosité est généralement minéralisé et détectable par microCT après 10 jours après la fracture (dpf) (Figure 2C).

1. Fixer les fémurs dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit à 4 °C.
   NOTE : La MicroCT peut être réalisée sur les mêmes fémurs utilisés pour l’histologie tant qu’elle est effectuée avant la décalcification EDTA (étape 4.3). Lorsque vous utilisez les mêmes fémurs pour les deux techniques, effectuez une microCT, récupérez les échantillons et passez à l’étape 4.3.
2. Laver les échantillons fixes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les stocker dans de l’EtOH à 70 %.
3. Effectuer un microCT avec une taille de voxel isotrope de 7 μm à un niveau d’énergie de 55 kVP et une intensité de 145 μA (voir tableau des matériaux).
4. Contournez les tranches de microCT pour inclure le cal et exclure l’os cortical.
   REMARQUE: Au fur et à mesure que le cal se minéralise avec le temps, le seuil peut être ajusté pour visualiser et mesurer le volume du callosité à différents stades.
5. Obtenir le volume osseux contenu dans les contours des callosités comme mesure du volume des callosités.
   REMARQUE: L’écart de rupture peut être mesuré directement sur les tranches de microCT en fonction de la distance occupée par la rupture.

Résultats

Chez les souris C57BL / 6J, une chirurgie réussie complète les étapes de guérison mentionnées précédemment avec peu ou pas de réponse inflammatoire locale ou d’implication périostéale dans le fémur controlatéral opéré par simulacre. Un hématome se forme quelques heures après la chirurgie et le périoste est activé pour recruter des progéniteurs squelettiques pour la chondrogenèse. Diverses populations cellulaires, telles que les progéniteurs mésenchymateux Prx1⁺ , peuvent être tracées ...

Discussion

Le modèle de blessure détaillé dans ce protocole englobe les quatre étapes significatives observées lors de la guérison des fractures spontanées, y compris (1) la réponse pro-inflammatoire avec la formation de l’hématome, (2) le recrutement de progéniteurs squelettiques du périoste pour former le callosité molle, (3) la minéralisation du callosité par les ostéoblastes et (4) le remodelage de l’os par les ostéoclastes.

L’intervention chirurgicale décrite dans ce manuscrit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm