Querbruch des Mausfemurs mit stabilisierendem Stift

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um Frakturen an erwachsenen Mäusen durchzuführen und den Heilungsprozess zu überwachen.

Zusammenfassung

Die Frakturreparatur ist eine wesentliche Funktion des Skeletts, die in vitro nicht zuverlässig modelliert werden kann. Ein Mausverletzungsmodell ist ein effizienter Ansatz, um zu testen, ob ein Gen, ein Genprodukt oder ein Medikament die Knochenreparatur beeinflusst, da murine Knochen die während der menschlichen Frakturheilung beobachteten Stadien rekapitulieren. Wenn eine Maus oder ein Mensch einen Knochen bricht, wird eine Entzündungsreaktion ausgelöst, und das Periost, eine Stammzellnische, die den Knochen selbst umgibt, wird aktiviert und expandiert. Zellen, die sich im Periost befinden, differenzieren sich dann zu einem vaskularisierten weichen Kallus. Der Übergang vom weichen Kallus zu einem harten Kallus erfolgt, wenn sich die rekrutierten Skelettvorläuferzellen in mineralisierende Zellen differenzieren und die Überbrückung der gebrochenen Enden zur Knochenvereinigung führt. Der mineralisierte Kallus wird dann umgebaut, um die ursprüngliche Form und Struktur des geheilten Knochens wiederherzustellen. Die Frakturheilung wurde an Mäusen mit verschiedenen Verletzungsmodellen untersucht. Dennoch ist der beste Weg, diesen gesamten biologischen Prozess zu rekapitulieren, den Querschnitt eines langen Knochens zu durchbrechen, der beide Kortexe umfasst. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine stabilisierte, transversale Femurfraktur sicher durchgeführt werden kann, um die Heilung bei erwachsenen Mäusen zu beurteilen. Ein chirurgisches Protokoll mit detaillierten Ernte- und Bildgebungstechniken zur Charakterisierung der verschiedenen Stadien der Frakturheilung wird ebenfalls bereitgestellt.

Einleitung

Frakturen, Brüche in der Kontinuität der Knochenoberfläche, treten in allen Segmenten der Bevölkerung auf. Sie werden bei Menschen, die aufgrund von Alterung oder Krankheit zerbrechliche Knochen haben, schwer, und die Gesundheitskosten von Fragilitätsfrakturen werden in 5 Jahren voraussichtlich 25 Milliarden ^US-Dollar übersteigen 1,2,3,4,5. Das Verständnis der biologischen Mechanismen, die an der Frakturreparatur beteiligt sind, wäre ein Ausgangspunkt für die Entwicklung neuer Therapien, die darauf abzielen, den Heilungsprozess zu verbessern. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass bei einer Fraktur vier signifikante Schritte auftreten, die es dem Knochen ermöglichen, zu heilen: (1) Bildung des Hämatoms; (2) Bildung eines fibroknorpeligen Kallus; (3) Mineralisierung des weichen Kallus zur Bildung von Knochen; und (4) Umbau des verheilten Knochens ^6,7. Viele biologische Prozesse werden aktiviert, um die Fraktur erfolgreich zu heilen. Zunächst wird unmittelbar nach einer Fraktur eine akute entzündungsfördernde Reaktion eingeleitet ^6,7. Dann wird das Periost aktiviert und dehnt sich aus, und periostale Zellen differenzieren sich in Chondrozyten, um einen Knorpelkallus zu bilden, der wächst, um die Lücke zu füllen, die die gestörten Knochensegmente ^{hinterlassen 6,7,8,9}. Nerven- und Gefäßzellen dringen in den neu gebildeten Kallus ein, um zusätzliche Zellen und Signalmoleküle bereitzustellen, die zur Erleichterung der Reparatur^{benötigt werden 6,7,8,9,10}. Periostatale Zellen tragen nicht nur zur Bildung von Kallusen bei, sondern differenzieren sich auch zu Osteoblasten, die gewebten Knochen im überbrückenden Kallus ablegen. Schließlich bauen Osteoklasten den neu gebildeten Knochen um, um zu seiner ursprünglichen Form und lamellären Struktur^{zurückzukehren} 7,8,9,10,11. Viele Gruppen entwickelten Mausmodelle zur Frakturreparatur. Eines der früheren und am häufigsten verwendeten Frakturmodelle bei Mäusen ist der Einhorn-Ansatz, bei dem ein Gewicht ab einer bestimmten Höhe¹² auf das Bein fällt. Die mangelnde Kontrolle über den Winkel und die Kraft, die angewendet wird, um die Fraktur zu induzieren, erzeugt eine große Variabilität in der Lage und Größe der Knochendiskontinuität. Anschließend führt dies zu Variationen in der beobachteten spezifischen Frakturheilungsreaktion. Andere beliebte Ansätze sind chirurgische Eingriffe zur Erzeugung eines tibialen monokortikalen Defekts oder Stressfrakturen, Verfahren, die vergleichsweise mildere Heilungsreaktionen induzieren^10,13. Die Variabilität in diesen Modellen ist in erster Linie auf die Person zurückzuführen, die das Verfahren durchführt¹⁴.

Hier ermöglicht ein detailliertes Maus-Femurverletzungsmodell die Kontrolle über den Bruch, um eine reproduzierbare Verletzung zu ermöglichen und eine quantitative und qualitative Bewertung der Femurfrakturreparatur zu ermöglichen. Insbesondere wird ein vollständiger Durchbruch in den Oberschenkelknochen erwachsener Mäuse eingeführt und stabilisiert die Frakturenden, um die Rolle der körperlichen Belastung bei der Knochenheilung zu berücksichtigen. Die Methoden zur Gewebeentnahme und Bildgebung der verschiedenen Schritte des Heilungsprozesses mittels Histologie und Mikrocomputertomographie (MikroCT) werden ebenfalls ausführlich erläutert.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Harvard Medical Area genehmigt. In diesem Protokoll wurden 12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse (Männchen und Weibchen) verwendet. C57BL/6J männliche und weibliche Mäuse erreichen eine maximale Knochenmasse im Alter von etwa 12 Wochen mit Oberschenkelknochen, die breit genug sind, um einen stabilisierenden Stift unterzubringen, was sie zu einer geeigneten Belastung für dieses Protokoll¹⁵ macht.

1. Vorbereitung auf die Operation

1. Autoklavieren Sie die chirurgischen Geräte, einschließlich chirurgischer Scheren, gerader Pinzetten, gebogener Pinzetten, chirurgischer Klemmen und Diamantschneidraden (siehe Materialtabelle), um das Infektionsrisiko zu minimieren.
2. Legen Sie einen sauberen Mauskäfig auf ein Heizkissen, um die postoperative Genesung zu erleichtern. Stellen Sie das Heizkissen so ein, dass es eine Temperatur zwischen 37-45 ° C erreicht.
3. Stellen Sie die Maus mit einer Isoflurankammer unter Narkose. Stellen Sie den induktiven Sauerstofffluss auf 2 l / min, die Isofluran-Induktion auf 2-4%, den Sauerstoff des Erhaltungskegels auf 2 l / min und den Erhaltungsisofluran auf 1,4%.
4. Vergewissern Sie sich, dass die Atmung der Maus stabil ist und sie nicht auf eine Zehenzwicke reagiert. Tragen Sie eine dünne Schicht Augensalbe auf jedes Auge auf, um Hornhautkratzer zu vermeiden. Überführen Sie die Maus auf ein steriles Pad und halten Sie die Anästhesie mit einem Nasenkonus aufrecht, um Isofluran kontinuierlich mit der gleichen Geschwindigkeit wie in Schritt 1.3 abzugeben.
   HINWEIS: Die Verwendung von 12 Wochen alten Mäusen oder älter wird empfohlen, da Femuren von jüngeren Mäusen möglicherweise zu dünn sind, um einen stabilisierenden Stift unterzubringen.
5. Injizieren Sie der Maus subkutan 0,05 mg/kg Körpergewicht langsam freisetzendes Buprenorphin (siehe Materialtabelle).
6. Rasieren Sie mit einem elektrischen Trimmer ein 2 x 2 cm großes Quadrat auf beiden Oberschenkeln, das der Position des Femurs entspricht.
7. Desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit steriler Gaze oder Tupfern, um eine Jodschicht zu verteilen, gefolgt von einer Spülung mit 70% Ethanol (Abbildung 1A).

2. Chirurgie

1. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell einen 5-mm-Schnitt in der rasierten, desinfizierten Region und schälen Sie die Haut ab, um die darunter liegende Faszie freizulegen.
2. Verwenden Sie gerade Pinzetten und feine Scheren, um die Faszie, die den Femur direkt bedeckt, vorsichtig zu greifen und zu schneiden, um den Muskel freizulegen. Ein 5-mm-Schnitt der Faszie reicht aus, um auf den darunter liegenden Muskel zuzugreifen.
3. Verwenden Sie ein Paar gerade Pinzetten und trennen Sie den Muskel sanft vom Femur mit minimaler Gewebeschädigung.
4. Sobald der Femur sichtbar ist, schieben Sie die gekrümmte Pinzette unter den Femur zwischen dem abgetrennten Muskel und Knochen. Lassen Sie die Pinzette langsam öffnen, um die Muskeltrennung aufrechtzuerhalten, und sichern Sie den Femur, um einen sauberen Schnitt zu ermöglichen.
   HINWEIS: Der Femur muss freiliegend und vom Muskel und der Haut getrennt bleiben, wenn die Pinzette nicht gehalten wird, wie in Abbildung 1B dargestellt.
5. Machen Sie einen Querschnitt in der Mitte des Femurschafts mit einer Handsäge auf der niedrigen Leistungseinstellung (siehe Materialtabelle für das verwendete Blatt und das Rotary Tool Kit).
   HINWEIS: Sobald der Femur vollständig geschnitten ist, entstehen zwei Frakturenden: der proximale Abschnitt (am Hüftknochen befestigt) und der distale Abschnitt (am Knie befestigt, auch bekannt als das Würgegelenk). Vermeiden Sie es, den Femur in einer einzigen Bewegung zu schneiden. Machen Sie stattdessen 3-5 Durchgänge, bis der Femur vollständig durchtrennt ist. Dies ist entscheidend, um eine Überhitzung des umgebenden Gewebes und die Erzeugung erheblicher Knochenreste zu vermeiden, die sich negativ auf die Heilung auswirken.
6. Führen Sie eine Leitnadel (23 G x 1 TW IM, 0,6 mm x 25 mm) (siehe Materialtabelle) in die Markhöhle des distalen Abschnitts ein. Drehen Sie die Nadel mit den Fingern vorsichtig, während Sie durch das Kniegelenk drücken (Abbildung 1C).
   1. Entfernen Sie die Leitnadel vom distalen Ende und wiederholen Sie dies am proximalen Ende, indem Sie die Führungsnadel mit der gleichen sanften Drehbewegung durch das Hüftgelenk drücken. Lassen Sie die Führungsnadel im proximalen Ende, wobei ihre Spitze aus der Haut hervortritt (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Um die Bruchenden zu stabilisieren, wurde zuerst eine Führungsnadel verwendet, um einen Weg durch die Bruchenden zu schaffen, und dann wurde ein stabilisierender Stift durch diesen Weg gefädelt, um die Bruchenden¹⁴ zu sichern.
7. Stecken Sie den Stabilisierungsstift (Nadel, 27 G x 1 1/4, 0,4 mm x 30 mm) (siehe Materialtabelle) in die Spitze der Leitnadel (Abbildung 1E). Drücken Sie vorsichtig so, dass der stabilisierende Stift eintritt, wenn die Führungsnadel die Knochenmarkshöhle des proximalen Endes verlässt.
   1. Entsorgen Sie die Leitnadel. Verwenden Sie eine Pinzette, um das distale Ende mit dem proximalen Ende zu halten und auszurichten, und fädeln Sie den stabilisierenden Stift weiterhin durch die distale Markhöhle, bis er das Kniegelenk mit dem in 2.6 hergestellten Weg verlässt (Abbildung 1F).
      HINWEIS: Der stabilisierende Stift sollte nun aus der Hüfte und den Kniegelenken herausragen.
8. Ziehen Sie mit der chirurgischen Klemme an der Spitze des Stiftes, um die proximalen und distalen Abschnitte nahe beieinander zu bringen, so dass sie sich kaum berühren. Richten Sie die Bruchenden bei Bedarf mit einer Pinzette neu aus und falten Sie die Enden des stabilisierenden Stifts mit der chirurgischen Klemme zur Bruchstelle (siehe Materialtabelle).
   1. Entfernen Sie den Kunststoff mit Drahtschneidern von der Nadelbasis. Drehen Sie mit der Klemme beide Enden des Stiftes, bis sie stumpf sind, um innere Gewebeschäden zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Bruchenden sind jetzt an Ort und Stelle verriegelt, so dass die Maus das verletzte Bein belasten kann. Der Stift wird gesichert, wenn sich die Bruchenden nicht trennen können. Ein Drahtschneider kann auch verwendet werden, um die Enden abzustumpfen. Der stabilisierende Stift muss während der gesamten Dauer der Studie an Ort und Stelle bleiben, bis die Maus eingeschläfert wird. Versuche, den Stift zu entfernen, werden wahrscheinlich die Frakturreaktion destabilisieren und dem Tier Schaden zufügen. Der Stift kann bei der Dissektion entfernt werden.
9. Verwenden Sie gerade Pinzetten, um den Muskel auf dem Oberschenkelknochen neu zu positionieren. Drücken Sie mit einer gebogenen Pinzette die Enden der Haut zusammen und schließen Sie die Öffnung mit Wundclips.
   HINWEIS: Schließen Sie die Haut nicht zu fest mit den Clips, sonst vermeidet die Maus, dieses Bein zu belasten. Die Begrenzung der körperlichen Belastung während der Genesung könnte den Heilungsprozess verzögern.
10. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4 am anderen Bein und schließen Sie die Wunde, ohne die Oberschenkelfraktur durchzuführen.
    HINWEIS: Dieser scheinoperierte Femur dient als kontralaterale Kontrolle.
11. Ziehen Sie die Isofluran-Exposition zurück, legen Sie die Maus in den beheizten Käfig und stellen Sie sicher, dass sie innerhalb von 10-15 Minuten das Bewusstsein wiedererlangt.
12. Überwachen Sie die Aktivität und die Inzisionsstelle der Maus täglich für 5 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Stress oder Infektion.
    HINWEIS: Wenn das Tier Anzeichen von Schmerzen zeigt, nicht frisst und / oder zögert, auf seinen Hinterbeinen zu gehen, konsultieren Sie das Tierarztpersonal und verabreichen Sie zusätzliches Analgetikum.
13. Entfernen Sie die Wundclips 10 Tage nach der Operation.
    HINWEIS: Wenn die Wunde nach 10 Tagen nicht geschlossen zu sein scheint, konsultieren Sie das Tierarztpersonal und die IACUC, bevor Sie die Clips entfernen.

3. Gewebeentnahme

1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch CO 2-Inhalation mit anschließender Zervixdislokation.
   HINWEIS: Dieses Verfahren steht im Einklang mit dem Panel on Euthanasia der American Veterinary Medical Association.
2. Entfernen Sie mit einer Schere und einer Pinzette die Haut von beiden Mausbeinen, verrenken Sie den Hüftkopf vom Hüftknochen und schneiden Sie den angrenzenden Muskel ab, um das Bein zu befreien.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, zu viele Muskeln um den Oberschenkelknochen zu entfernen, da der Kallus entfernt oder beschädigt werden könnte.
3. Vermeiden Sie den stabilisierenden Stift, schneiden Sie durch das Kniegelenk, um den Femur von der Tibia zu trennen.
4. Sezieren Sie um die distalen und proximalen Teile des Femurs, um die Enden der stabilisierenden Nadel freizulegen.
5. Schneiden Sie mit einem harten Drahtschneider die gefalteten stumpfen Enden des Stiftes ab, so dass nur der gerade Teil des Stiftes übrig bleibt. Verwenden Sie eine Pinzette, um den stabilisierenden Stift langsam und sanft aus dem Oberschenkelknochen zu schieben.
   HINWEIS: Wenn der Stift nicht leicht herausgleitet, wenden Sie keine Kraft an, da dies die Hornhaut lösen und die Probe beschädigen könnte. Versuchen Sie stattdessen, den Stift zu drehen und vorsichtig zu entfernen. Das Entfernen des Stiftes kann auch nach der Fixierung einfacher sein.

4. Histologie - Alcian Blue / Eosin / Orange G Färbung

HINWEIS: Die Alcian Blue / Orange G / Eosin-Färbung wird routinemäßig verwendet, um Knorpel (blau) und den Knochen (rosa) zu visualisieren. Die Knorpelfläche kann als Anteil an der gesamten Kallusfläche quantifiziert werden (Abbildung 2A,B).

1. Femuren in 10% neutralem gepuffertem Formalin über Nacht bei 4 °C fixieren.
2. Waschen Sie die fixierten Proben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Proben in 0,5M EDTA, pH 8,0 auf einem langsam rotierenden Shaker für 2 Wochen legen. Wechseln Sie die EDTA-Lösung jeden zweiten Tag, um eine effiziente Entkalkung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Für den Shaker ist keine bestimmte Drehzahl erforderlich. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit im Behälter fließt, um alle Proben abzudecken. Die vollständige Entkalkung kann durch Röntgen der Oberschenkelknochen getestet werden.
4. Um die Proben für die Paraffineinbettung zu verarbeiten, inkubieren Sie sie in den folgenden Lösungen (je 1 h): 70% EtOH, 95% EtOH, 100% EtOH, 100% EtOH, Xylol, Xylol, Paraffin, Paraffin.
5. Betten Sie die Proben zum Schneiden in Paraffin ein.
6. Schneiden Sie 5-7 μm dicke Längsschnitte der gebrochenen Oberschenkelknochen mit einem Mikrotom ab.
7. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie in 2 Bädern Xylol (je 5 min) inkubieren.
8. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Inkubation im folgenden Ethanolgradienten (je 2 min): 100% EtOH, 100% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH.
9. Legen Sie die Rutschen für 1 Minute in Leitungswasser.
10. Machen Sie die Lösungen von Alcian Blau, saurem Alkohol, Ammoniumwasser und Eosin / Orange G für die Histologie, wie in der Ergänzungsdatei 1 erwähnt.
    HINWEIS: Die vorgeschlagenen Volumina jeder Lösung sollten ausreichen, um die Objektträger für die Färbung vollständig zu untertauchen.
11. Legen Sie die Objektträger in sauren Alkohol für 30 s und inkubieren Sie in Alcian Blau für 40 min.
12. Vorsichtig unter dem laufenden Wasserhahn waschen, bis das Wasser für ca. 2 min klar ist.
13. Tauchen Sie die Objektträger schnell in sauren Alkohol für 1 s.
14. Spülen Sie wie in Schritt 4.9 beschrieben ab.
15. 15 s in Ammoniumwasser inkubieren.
16. Spülen Sie wie in Schritt 4.9 beschrieben ab.
17. In 95% EtOH für 1 min geben und 90 s in Eosin/Orange G inkubieren.
18. Trocknen Sie die Objektträger schnell mit einem einzigen Dip in 70% EtOH, 80% EtOH und 100% EtOH.
19. Legen Sie die Dias für 1 Minute in Xylol, um die Dias zu löschen.
20. Tragen Sie Montagemedien und ein Deckblatt für die Bildgebung auf.
    HINWEIS: Für die molekulare Analyse können RNA und Protein aus dem Kallus isoliert werden. Sezieren Sie den Muskel vorsichtig unter einem Sezierbereich und trennen Sie den Kallus mit einem Skalpell vom darunter liegenden Knochen.

5. Mikro-CT

HINWEIS: In den späteren Stadien der Heilung kann eine MikroCT durchgeführt werden, um die Mineralisierung im harten Kallus und die Frakturlücke abzubilden und zu quantifizieren. Bei C57BL/6J-Mäusen ist der Kallus in der Regel mineralisiert und nach 10 Tagen nach der Fraktur (dpf) durch MikroCT nachweisbar (Abbildung 2C).

1. Femuren in 10% neutralem gepuffertem Formalin über Nacht bei 4 °C fixieren.
   HINWEIS: MicroCT kann an den gleichen Femuren durchgeführt werden, die für die Histologie verwendet werden, solange sie vor der EDTA-Entkalkung durchgeführt wird (Schritt 4.3). Wenn Sie für beide Techniken dieselben Oberschenkelknochen verwenden, führen Sie eine MikroCT durch, rufen Sie die Proben ab und fahren Sie mit Schritt 4.3 fort.
2. Waschen Sie die fixierten Proben in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und lagern Sie sie in 70% EtOH.
3. Führen Sie MikroCT mit einer isotropen Voxelgröße von 7 μm bei einem Energieniveau von 55 kVP und einer Intensität von 145 μA durch (siehe Materialtabelle).
4. Konturieren Sie die microCT-Scheiben, um den Kallus einzuschließen und den kortikalen Knochen auszuschließen.
   HINWEIS: Da der Kallus mit der Zeit mineralisierter wird, kann der Schwellenwert angepasst werden, um das Kallusvolumen in verschiedenen Stadien zu visualisieren und zu messen.
5. Erhalten Sie das in den Kalluskonturen enthaltene Knochenvolumen als Maß für das Kallusvolumen.
   HINWEIS: Die Bruchlücke kann direkt an den microCT-Scheiben als Abstand gemessen werden, der vom Bruch eingenommen wird.

Ergebnisse

Bei C57BL/6J-Mäusen schließt eine erfolgreiche Operation die zuvor erwähnten Heilungsschritte mit wenig bis gar keiner lokalen Entzündungsreaktion oder periostalen Beteiligung am scheinoperierten kontralateralen Femur ab. Ein Hämatom wird einige Stunden nach der Operation gebildet, und das Periost wird aktiviert, um Skelettvorläufer für die Chondrogenese zu rekrutieren. Verschiedene Zellpopulationen, wie z.B. Prx1⁺ mesenchymale Vorläufer, können während des Reparaturprozesses mit handelsüblichen flu...

Diskussion

Das in diesem Protokoll beschriebene Verletzungsmodell umfasst alle vier signifikanten Schritte, die während der Heilung spontaner Frakturen beobachtet wurden, einschließlich (1) entzündungsfördernder Reaktion mit der Bildung des Hämatoms, (2) Rekrutierung von Skelettvorläufern aus dem Periost zur Bildung des weichen Kallus, (3) Mineralisierung des Kallus durch Osteoblasten und (4) Umbau des Knochens durch Osteoklasten.

Der in diesem Manuskript beschriebene chirurgische Eingriff ist für...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm