قياسات منعكس H الطرفي في الفئران

Summary

التقييم السريري للتشنج على أساس منعكس هوفمان (H-reflex) واستخدام التحفيز الكهربائي للأعصاب الطرفية هو طريقة راسخة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحفيز العصب الطرفي والمباشر للقياس الكمي المنعكس H في مقدمة الفأر.

Abstract

يسمح منعكس هوفمان (H-reflex) ، كنظير كهربائي لمنعكس التمدد ، بالتحقق من صحة الفيزيولوجيا الكهربية لسلامة الدوائر العصبية بعد الإصابات مثل تلف الحبل الشوكي أو السكتة الدماغية. زيادة استجابة H-reflex ، جنبا إلى جنب مع أعراض مثل تقلصات العضلات غير الطوعية ، ومنعكس التمدد المعزز بشكل مرضي ، وفرط التوتر في العضلات المقابلة ، هو مؤشر على التشنج بعد السكتة الدماغية (PSS).

على عكس القياسات عبر الجلد غير المحددة للأعصاب ، نقدم هنا بروتوكولا لتحديد منعكس H مباشرة في الأعصاب الزندية والمتوسطة للمقدمة الأمامية ، والتي تنطبق ، مع تعديلات طفيفة ، على العصب الظنبوبي والوركي للمخلب الخلفي. استنادا إلى التحفيز المباشر والتكيف مع الأعصاب المختلفة ، تمثل الطريقة أداة موثوقة ومتعددة الاستخدامات للتحقق من صحة التغيرات الفيزيولوجية الكهربية في نماذج الأمراض المرتبطة بالتشنج.

Introduction

يمكن استحضار منعكس هوفمان (H-reflex) ، الذي سمي على اسم عالم الفسيولوجيا بول هوفمان ، عن طريق التحفيز الكهربائي للأعصاب الطرفية ، التي تحمل محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية والحركية الناشئة عن العضلات نفسها وتؤدي إليها. إنه التناظرية المستحثة كهربائيا لمنعكس التمدد أحادي المشبك ، ويشترك في نفس المسار¹. على عكس تمدد العضلات ، ينتج رد الفعل H عن التحفيز الكهربائي. عندما يتم تحفيز الأعصاب الطرفية كهربائيا عند شدة تيار منخفضة ، عادة ما يتم إزالة استقطاب ألياف Ia الواردة أولا بسبب قطرها المحوري الكبير². تثير إمكانات عملها الخلايا العصبية الحركية ألفا (αMNs) في الحبل الشوكي ، والتي بدورها تثير جهود الفعل التي تنتقل عبر محاور αMN نحو العضلات (الشكل 1). يولد هذا الشلال استجابة عضلية بسعة صغيرة ، تنعكس في ما يسمى بالموجة H. من خلال زيادة شدة التحفيز تدريجيا ، تزداد سعة الموجة H بسبب توظيف وحدات حركية إضافية. من شدة تحفيز معينة ، يتم استنباط إمكانات الفعل في المحاور الرقيقة ل αMNs مباشرة ، والتي يتم تسجيلها على أنها الموجة M. تظهر هذه الموجة M بزمن انتقال أقصر من الموجة H (الشكل 2). إذا زادت شدة التحفيز ، تصبح سعة الموجة M أكبر بسبب تجنيد المزيد من محاور αMN ، بينما تصبح الموجة H أصغر تدريجيا. يمكن قمع الموجة الهيدروجينية عند شدة تحفيز عالية بسبب الانتشار العكسي المضاد لجهود الفعل في محاور αMN. تتصادم جهود الفعالية المحفزة هذه مع تلك الناتجة عن تحفيز Ia وبالتالي يمكن أن تلغي بعضها البعض. عند شدة التحفيز فوق القصوى ، تحدث إمكانات العمل التقويمية (نحو العضلات) والمضادة للاضطراب (نحو الحبل الشوكي) في جميع محاور MN. الأول يؤدي إلى أقصى سعة للموجة M (Mmax) ، في حين أن الأخير يؤدي إلى الإلغاء الكامل ل H-reflex³.

لتقييم التشنج بعد السكتة الدماغية (PSS) أو إصابة الحبل الشوكي (SCI) ، تم استخدام منعكس H لتقييم الأساس العصبي للحركة والتشنج لدى البشر¹. يتم تحقيق تقدير كمي محسن للتغير في منعكس H بين القياسات وبين الموضوعات باستخدام نسبة الموجة H و M (نسبة H / M). بدلا من ذلك ، يتم قياس الاكتئاب المعتمد على المعدل (RDD) ، باستخدام مجموعة من الترددات الصاعدة (على سبيل المثال ، 0.1 و 0.5 و 1.0 و 2.0 و 5.0 هرتز). يعكس RDD سلامة الدوائر المثبطة التي قد تزعجها السكتة الدماغية أو اصابات النخاع الشوكي. عندما تكون جميع الدوائر العصبية سليمة ، يكون هناك قمع موحد ومستقل عن التردد لمنعكس H. ومع ذلك ، إذا كان هناك انخفاض في تثبيط الأعصاب نتيجة للسكتة الدماغية أو اصابات النخاع الشوكي ، فإن قمع رد الفعل H يتناقص مع زيادة تردد التحفيز⁴.

يمكن أن يكون التسجيل الكهربي الصحيح باستخدام الأقطاب الكهربائية السطحية أمرا صعبا وقد يتأثر بالمهام الحركية والآليات المثبطة واستثارة αMN⁵. في التسجيل عبر الجلد في القوارض ، يتم وضع قطب تحفيز بالقرب من العصب الظنبوبي ، ويتم وضع قطب تسجيل بالقرب من العضلات ذات الصلة في المقدمة. وفقا لتجربتنا ، ومع ذلك ، فإن الموضع الصحيح للأقطاب الكهربائية عبر الجلد (الشكل 1A) هو أكثر تعقيدا ومتغيرا في القوارض من وضع القطب السطحي في البشر. يمكن أن يؤدي ذلك إلى اختلافات في الطول والتردد وشدة التحفيز اللازمة لاستنباط منعكس H. يمكن أن تفسر هذه التحديات المنهجية سبب وجود عدد محدود جدا من دراسات قياس H-reflex (على سبيل المثال ، في نماذج السكتة الدماغية التجريبية ^3,4 ، ونماذج التشنج الأخرى⁶. يمكن تحقيق تحفيز دقيق (طويل الأجل) وتسجيل منعكس H على الأعصاب الفردية ، من حيث المبدأ ، باستخدام أقطاب كهربائية قابلة للزرع تحيط بالعصب المستهدف ^7,8. بسبب الجراحة الصعبة مع الآثار الجانبية المحتملة للحيوان وعدم الاستقرار المحتمل للمسبار ، لم يصبح هذا النهج معيارا في هذا المجال. تتطلب الطريقة المعروضة هنا أيضا بعض الخبرة الجراحية. ومع ذلك ، فإنه يسمح بتحفيز وتسجيل جديد ودقيق للأعصاب المعزولة في الجسم الحي باستخدام شدة تحفيز منخفضة ، مما يتجنب التحفيز المتزامن للأعصاب المجاورة.

Protocol

أجريت جميع التجارب وفقا لقوانين رعاية الحيوان الأوروبية والوطنية والمبادئ التوجيهية المؤسسية ، وتمت الموافقة عليها من قبل Landesamt für Natur-، Umwelt- ، und Verbraucherschutz North Rhine-Westphalia (Az: 81-02.04.2019.A309). تم تحسين البروتوكول للفئران البالغة (حوالي 8-16 أسبوعا من الفئران C57Bl / 6J) وتسجيل الأطراف الأمامية. يمكن تكييفه بسهولة عن طريق تحفيز الأعصاب المعنية في الطرف الخلفي وتسجيل عضلات الخلف (الشكل 1 ب). تمت إضافة وصف لأقطاب التسجيل والتحفيز في جدول المواد. لاحظ أن البروتوكول يستخدم للقياس الطرفي فقط.

1. التحضير

1. وزن الحيوان وبدء التخدير عن طريق الحقن عن طريق i.p. خليط من الكيتامين (100 ملغم / كغم) والزيلازين (10 ملغ / كغ).
2. احتفظ بالماوس في صندوق التسخين حتى يتم الوصول إلى التسامح الجراحي. انتظر بضع دقائق حتى يهدأ الماوس ، ويكون التنفس مستقرا ، وردود الفعل غائبة. تحقق من عمق التخدير عن طريق قياس عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
3. أدر الماوس على ظهره وضعه على وسادة تدفئة (الأفضل هو التسخين الذي يتم التحكم فيه باستخدام مسبار درجة حرارة المستقيم). إصلاح forepaws مع الشريط. هنا ، تأكد من وضع الشريط بطريقة يمكن إدخال أقطاب القياس بسهولة في المقدمة.
4. أدخل مسبار المستقيم لقياس درجة حرارة الحيوان وإصلاحه بشريط. ضع مرهم العين لمنع جفاف العينين.

2. الجراحة

ملاحظة: يجب مراقبة الحالة المستقرة للحيوان المخدر ، أي التنفس ودرجة الحرارة وفقدان ردود الفعل ، بانتظام طوال الإجراء. يظهر إجراء قياس الموجة الهيدروجينية للعصب المباشر للعصب الكعبري / الزندي / الوسيط للمقدمة (الشكل 3 أ). يمكن أيضا تكييف القياس مع العصب الخلفي (العصب الوركي / الظنبوبي) مع التعديلات.

1. للحصول على نظرة عامة أفضل على المنطقة الجراحية ، قم بإزالة الشعر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية أو مقص في مكان منفصل مسبقا. بالنسبة للجراحين الأكثر خبرة ، هذا اختياري فقط.
   ملاحظة: التطهير ليس ضروريا هنا ، لأن هذه تجربة نهائية. سيتم القتل الرحيم للحيوان في وقت لاحق.
2. ارفع الجلد بملاقط وقم بعمل شق يبلغ طوله حوالي 1 سم في الجلد على طول المحور البطني الخلفي للمقدمة (المنطقة فوق الإبط والصدر) باستخدام مقص دائري ناعم.
3. قم بإزالة النسيج الضام بعناية وكشف العضلات والأعصاب تحته. قم بإزالة العضلة الصدرية العميقة المكشوفة باستخدام الملقط للوصول إلى العصب المتوسط (الشكل 3E ، F). إزالة كميات صغيرة من الدم وسوائل الأنسجة مع الأنسجة الرخوة.
4. في الخطوة التالية ، قم بقص الثدي أو العضلة الإبطية بعناية من الأعلى إلى الأسفل لكشف الحزمة العصبية تحتها. حرر الحزمة العصبية من النسيج الضام والعضلي بطول 1.5 سم تقريبا.
   ملاحظة: هنا ، يجب توخي الحذر بشكل خاص لعدم إتلاف الأوعية الدموية التي تعمل بالتوازي مع العصب المتوسط. عند قطع الأنسجة ، قم دائما بقص العصب لتجنب إصابته. إذا حدث هذا ، فقم بإزالة السوائل المتسربة والدم باستخدام مسحة. المجهر الاستريو ليس ضروريا للتجربة بأكملها ، ومع ذلك يمكن أن يكون مفيدا لإعداد الأعصاب.
5. افصل العصب الزندي والمتوسط للمقدمة بعناية باستخدام ماصة زجاجية منحنية (الشكل 3E). الجزء العلوي من العصبين هو العصب الزندي ، والجزء السفلي هو العصب المتوسط.
   ملاحظة: عند فصل الأعصاب عن بعضها البعض ، تأكد من عدم إصابة الأوعية الدموية الموجودة تحتها.

3. وضع القطب

1. رتب أقطاب خطاف التحفيز بالتوازي على مسافة 0.5-1.0 مم ، واستخدم مناولة دقيقة لوضع الخطاف المزدوج على مقربة من العصب.
2. استخدم الخطاف الزجاجي كأداة لرفع العصب الزندي على أقطاب خطاف التحفيز. اسحب القطب الكهربائي مع العصب وافصله عن الأعصاب الأخرى بحوالي 1-2 مم باستخدام المعالج الدقيق (الشكل 3D ، F).
3. ضع الأقطاب الكهربائية على طول المحور الطويل للمخلب لتقليل الحديث المتبادل بين العضلات.
   ملاحظة: يعد وضع الأقطاب الكهربائية مهما جدا ولكن يصعب توحيده بسبب التشريح الفردي. يتطلب جراحا متمرسا لوضع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح. يمكن أيضا إعادة وضع الأسلاك إذا كانت سعة الإشارة غير مرضية.
4. قم بتجفيف خطافات القطب الكهربائي المتصلة بالعصب بشكل سطحي وتطبيق الفازلين باستخدام حقنة لتوفير العزل الكهربائي من الأنسجة المجاورة.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر لتطبيق ما يكفي من الفازلين على القطب وأيضا بين الخطافين لضمان العزل الكهربائي ومنع الأعصاب من الجفاف.

4. وضع أقطاب التسجيل والمرجعية

1. لقياس منعكس H ، ضع أقطاب EMG في العضل في مقدمة المخلب. بالإضافة إلى ذلك ، ضع القطب المرجعي تحت الجلد في الطرف الخلفي (على سبيل المثال ، باستخدام دبوس دقيقة) ، مثبتا بمشبك تمساح مصغر (الشكل 3 ب).
2. عند تشغيل المحفز ، لاحظ التحفيز الناجح كتشنجات صغيرة من المقدمة. يجب أن يكون الحد الأدنى من تيار التحفيز لاستنباط الموجة M والتشنجات المرئية الصغيرة في مقدمة المخلب في حدود 10-50 μA.
   ملاحظة: إذا لم تكن هناك تشنجات مرئية عند 50 μA ، فاضبط أقطاب التحفيز وأعد وضع الفازلين. أيضا ، في الفئران ، ليس من غير المألوف أن تظهر الموجة M بكثافة تحفيز أقل من^{H-wave 5}.

5. القياس

1. كرر تحفيز العصب 15 مرة بنبضات بطول 0.2 مللي ثانية لكل منهما. مع توقف مؤقت لمدة دقيقتين بين مجموعات المحفزات ، يزداد التردد من 0.1 ، 0.5 ، 1.0 ، 2.0 ، إلى 5 هرتز.
   ملاحظة: هذه الترددات ضرورية في حالة حساب RDD بعد ذلك. يتم تسجيل جميع بيانات EMG ورقمنتها وتحليلها باستخدام برنامج مثل برنامج Spike2 (CED ، الإصدار 7.19). من المتوقع أن تكون أكبر سعة للموجة H عند 0.1 هرتز. كلما زاد التردد ، كلما أصبحت سعة الموجة H أصغر بسبب RDD.
2. بعد التجربة ، التضحية بالحيوان وفقا لبروتوكول IACUC للمعهد. في هذه التجربة ، تم إجراء نضح الفأر عبر القلب باستخدام PBS و 4٪ PFA تحت التخدير العميق.

النتائج

من n = 15 تجربة تحفيز لكل تردد تحفيز ومخلب ، حدد n = 10 تسجيلات ناجحة على الأقل للتحليل. يتم استبعاد التجارب التي تحتوي على أخطاء في القياس (على سبيل المثال ، الموجة M المفقودة) من التحليل. قم بتحليل كل تجربة على حدة وقم بإنشاء متوسط لمقارنات المجموعة / الوقت لاحقا. يتم تسجيل زمن الانتقال بين التحف...

Discussion

على عكس قياسات H-reflex عبر الجلد الموصوفة سابقا في الماوس⁶ ، فإننا نقدم قياسا مباشرا وخاصا بالأعصاب. يمكن تطبيق هذا النهج الجديد على أعصاب الأطراف الأمامية والخلفية (على سبيل المثال ، الأعصاب المتوسطة والزندية والشعاعية والأعصاب الظنبوبية والوركية ، على التوالي) ، مما يجعل هذه ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun