Farelerde Terminal H-refleks Ölçümleri

Özet

Spastisitenin Hoffmann refleksine (H-refleksi) dayanarak ve periferik sinirlerin elektriksel stimülasyonu kullanılarak klinik olarak değerlendirilmesi kanıtlanmış bir yöntemdir. Burada, fare ön pençesinde H-refleks ölçümü için bir terminal ve doğrudan sinir stimülasyonu için bir protokol sağlıyoruz.

Özet

Hoffmann refleksi (H-refleksi), gerilme refleksine elektriksel bir analog olarak, omurilik hasarı veya felç gibi yaralanmalardan sonra nöral devrelerin bütünlüğünün elektrofizyolojik olarak doğrulanmasını sağlar. H-refleks yanıtının artması, istemsiz kas kasılmaları, patolojik olarak artmış gerilme refleksi ve ilgili kastaki hipertoni gibi semptomlarla birlikte, inme sonrası spastisitenin (PSS) bir göstergesidir.

Oldukça sinir-spesifik olmayan transkutanöz ölçümlerin aksine, burada, H-refleksini doğrudan ön pençenin ulnar ve median sinirlerinde ölçmek için bir protokol sunuyoruz; bu, küçük değişikliklerle, arka pençenin tibial ve siyatik sinirine uygulanabilir. Doğrudan stimülasyona ve farklı sinirlere adaptasyona dayanan yöntem, spastisite ile ilişkili hastalık modellerinde elektrofizyolojik değişiklikleri doğrulamak için güvenilir ve çok yönlü bir aracı temsil eder.

Giriş

Fizyolog Paul Hoffmann'ın adını taşıyan Hoffmann refleksi (H-refleksi), aynı kaslardan kaynaklanan ve aynı kaslara yol açan duyusal ve motor nöronların aksonlarını taşıyan periferik sinirlerin elektriksel uyarımı ile uyandırılabilir. Monosinaptik gerilme refleksinin elektriksel olarak indüklenen analoğudur ve aynı yolu paylaşır¹. Kas gerilmesinin aksine, H-refleksi elektriksel stimülasyondan kaynaklanır. Periferik sinirler düşük akım yoğunluğunda elektriksel olarak uyarıldığında, Ia afferent lifleri tipik olarak büyük akson çapları² nedeniyle ilk önce depolarize edilir. Aksiyon potansiyelleri, omurilikteki alfa motornöronları (αMN'ler) heyecanlandırır ve bu da αMN aksonlarından kaslara doğru ilerleyen aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarır (Şekil 1). Bu kaskad, sözde H-dalgasına yansıyan küçük genliğe sahip kaslı bir tepki üretir. Uyaran yoğunluğunu kademeli olarak artırarak, ek motor ünitelerin işe alınması nedeniyle H dalgasının genliği artar. Belirli bir uyaran yoğunluğundan, αMN'lerin daha ince aksonlarındaki aksiyon potansiyelleri doğrudan ortaya çıkar ve bu da M-dalgası olarak kaydedilir. Bu M-dalgası, H-dalgasından daha kısa bir gecikme süresiyle görünür (Şekil 2). Stimülasyon yoğunluğu daha da artarsa, daha fazla αMN aksonunun işe alınması nedeniyle M-dalgasının genliği büyürken, H-dalgası yavaş yavaş küçülür. H-dalgası, αMN aksonlarındaki aksiyon potansiyellerinin antidromik geri yayılımı nedeniyle yüksek uyaran yoğunluklarında bastırılabilir. Bu tetiklenen aksiyon potansiyelleri, Ia stimülasyonundan gelenlerle çarpışır ve böylece birbirlerini iptal edebilir. Supramaksimal uyaran yoğunluklarında, tüm MN aksonlarında ortodromik (kaslara doğru) ve antidromik (omuriliğe doğru) aksiyon potansiyelleri ortaya çıkar; birincisi maksimum M-dalgası genliğine (Mmax) yol açarken, ikincisi H-refleksi^3'ün tamamen ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır.

İnme sonrası spastisite (PSS) veya omurilik yaralanmasının (SCI) değerlendirilmesi için, H-refleksi insanlarda hareket ve spastisitenin nöral temelini değerlendirmek için kullanılmıştır¹. Ölçümler arasındaki ve denekler arasındaki H-refleksindeki değişimin iyileştirilmiş bir nicelleştirilmesi, H- ve M- dalgasının (H / M oranı) oranı kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, hıza bağlı depresyon (RDD), bir dizi artan frekans (örneğin, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 ve 5.0 Hz) kullanılarak ölçülür. RDD, inme veya SCI tarafından bozulabilecek inhibitör devrelerin bütünlüğünü yansıtır. Tüm nöral devreler sağlam olduğunda, H-refleksinin tekdüze, frekanstan bağımsız bir baskılanması vardır. Bununla birlikte, inme veya SCI sonucu azalmış nöral inhibisyon varsa, H-refleksinin baskılanması, artan stimülasyon frekansı⁴ ile azalır.

Yüzey elektrotları kullanılarak doğru elektrofizyolojik kayıt yapmak zor olabilir ve motor görevlerden, inhibitör mekanizmalardan ve αMN uyarılabilirliğinden etkilenebilir⁵. Kemirgenlerde transkutanöz kayıtta, tibial sinirin yanına bir uyaran elektrodu yerleştirilir ve ön pençedeki ilgili kasların yanına bir kayıt elektrodu yerleştirilir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, transkutanöz elektrotların doğru yerleştirilmesi (Şekil 1A), kemirgenlerde insanlarda yüzey elektrodu yerleşiminden daha karmaşık ve değişkendir. Bu, H-refleksini ortaya çıkarmak için gerekli uzunluk, frekans ve stimülasyon yoğunluğunda farklılıklara yol açabilir. Bu metodolojik zorluklar, neden çok sınırlı sayıda H-refleks ölçüm çalışması olduğunu açıklayabilir (örneğin, deneysel inme modellerinde ^3,4 ve diğer spastisite modellerinde⁶). H-refleksinin bireysel sinirler üzerinde hassas (uzun süreli) bir şekilde uyarılması ve kaydedilmesi, prensip olarak, hedef sinir ^7,8'i çevreleyen implante edilebilir elektrotlar kullanılarak elde edilebilir. Hayvan için potansiyel yan etkileri olan zorlu cerrahi ve probun potansiyel dengesizliği nedeniyle, bu yaklaşım sahada bir standart haline gelmemiştir. Burada sunulan yöntem aynı zamanda bazı cerrahi uzmanlık gerektirir. Bununla birlikte, komşu sinirlerin eşzamanlı uyarılmasını önleyen düşük stimülasyon yoğunluklarını kullanarak izole sinirlerin in vivo olarak yeni, hassas bir şekilde uyarılmasına ve kaydedilmesine izin verir.

Protokol

Tüm deneyler Avrupa ve Ulusal hayvan bakım yasalarına ve kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüş ve Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Kuzey Ren-Vestfalya (Az: 81-02.04.2019.A309) tarafından onaylanmıştır. Protokol, yetişkin fareler (yaklaşık 8-16 haftalık C57Bl / 6J fareler) ve ön ayak kaydı için optimize edilmiştir. Arka bacaktaki ilgili sinirleri uyararak ve arka pençe kaslarını kaydederek kolayca uyarlanabilir (Şekil 1B). Kayıt ve stimülasyon elektrotlarının bir açıklaması Malzemeler Tablosuna eklenmiştir. Protokolün yalnızca terminal ölçümü için kullanıldığını unutmayın.

1. Hazırlık

1. Hayvanı tartın ve i.p. yoluyla ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı enjekte ederek anesteziye başlayın.
2. Cerrahi toleransa ulaşılana kadar fareyi ısıtma kutusunda tutun. Fare sakinleşene kadar birkaç dakika bekleyin, solunum sabit kalır ve refleksler yoktur. Ayak parmağının sıkışmasına yanıt eksikliğini ölçerek anestezinin derinliğini kontrol edin.
3. Fareyi sırtına çevirin ve bir ısıtma yastığına yerleştirin (en uygunu, rektal sıcaklık probu kullanılarak geri besleme kontrollü ısıtma olacaktır). Ön pençeleri bantla sabitleyin. Burada, bandın, ölçüm elektrotlarının ön ayaklara kolayca yerleştirileceği şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
4. Hayvanın sıcaklığını ölçmek ve bantla sabitlemek için bir rektal prob yerleştirin. Gözlerin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın.

2. Ameliyat

NOT: Anestezi uygulanan hayvanın stabil durumu, yani solunum, sıcaklık ve refleks kaybı, prosedür boyunca düzenli olarak izlenmelidir. Direkt sinir H-dalgası ölçüm prosedürü ön pençenin radyal/ulnar/median siniri için gösterilmiştir (Şekil 3A). Ölçüm ayrıca modifikasyonlarla arka pençeye (siyatik / tibial sinir) uyarlanabilir.

1. Cerrahi bölgeye daha iyi bir genel bakış için, saçları önceden ayrı bir yerde elektrikli tıraş bıçağı veya bir çift makasla çıkarın. Daha deneyimli cerrahlar için bu sadece isteğe bağlıdır.
   NOT: Burada dezenfeksiyon gerekli değildir, çünkü bu bir son deneydir. Hayvan daha sonra ötenazi yapılacaktır.
2. Cildi cımbızla kaldırın ve bir çift ince yuvarlak makasla ön pençenin ventro-arka ekseni boyunca (koltuk altı ve göğüs kafesinin üstündeki alan) deride yaklaşık 1 cm'lik bir kesi yapın.
3. Bağ dokusunu dikkatlice çıkarın ve altındaki kas ve siniri açığa çıkarın. Median sinire erişmek için forseps kullanarak açıkta kalan pektoralis profundus kasını çıkarın (Şekil 3E,F). Az miktarda kan ve doku sıvısını yumuşak doku ile çıkarın.
4. Bir sonraki adımda, altındaki sinir demetini ortaya çıkarmak için meme veya aksiller kası yukarıdan aşağıya doğru dikkatlice kesin. Sinir demetini yaklaşık 1,5 cm uzunluğundaki bağ ve kas dokusundan serbest bırakın.
   NOT: Burada, medyan sinire paralel olarak çalışan kan damarlarına zarar vermemek için özel dikkat gösterilmelidir. Dokuyu keserken, yaralanmasını önlemek için daima sinir boyunca kesin. Bu durumda, sızan sıvıyı ve kanı bir çubukla çıkarın. Astereo mikroskop tüm deney için gerekli değildir, ancak sinirlerin hazırlanması için yararlı olabilir.
5. Ön pençenin ulnar ve median sinirini bükülmüş bir cam pipet kullanarak dikkatlice ayırın (Şekil 3E). İki sinirin üst kısmı ulnar sinir, alt kısmı ise median sinirdir.
   NOT: Sinirleri birbirinden ayırırken, altındaki kan damarının yaralanmadığından emin olun.

3. Elektrot yerleştirme

1. Stimülasyon kancası elektrotlarını paralel olarak 0.5-1.0 mm'lik bir mesafede düzenleyin ve çift kancayı sinire yakın bir yere yerleştirmek için bir mikromanipülatör kullanın.
2. Ulnar siniri stimülasyon kancası elektrotlarına kaldırmak için cam kancayı bir araç olarak kullanın. Elektrodu sinirle birlikte geri çekin ve mikromanipülatör kullanarak diğer sinirlerden yaklaşık 1-2 mm ayırın (Şekil 3D, F).
3. Kaslar arasındaki karışmayı azaltmak için elektrotları pençenin uzun ekseni boyunca yerleştirin.
   NOT: Elektrotların yerleştirilmesi çok önemlidir, ancak bireysel anatomi nedeniyle standartlaştırılması zordur. Elektrotları doğru yerleştirmek için deneyimli bir cerrah gerektirir. Sinyal genliğinin tatmin edici olmaması durumunda teller de yeniden konumlandırılabilir.
4. Sinire bağlı elektrot kancalarını yüzeysel olarak kurutun ve bitişik dokudan elektrik yalıtımı sağlamak için bir şırınga kullanarak petrol jölesi uygulayın.
   NOT: Elektrik yalıtımını sağlamak ve sinirlerin kurumasını önlemek için elektrota ve ayrıca iki kanca arasına yeterli miktarda petrol jölesi uygulanmasına özen gösterilmelidir.

4. Kayıt ve referans elektrotlarının yerleştirilmesi

1. H-refleksini ölçmek için, EMG elektrotlarını kas içinden ön pençeye yerleştirin. Ek olarak, referans elektrodunu minyatür bir timsah klipsi tarafından tutulan arka bacakta deri altından (örneğin, bir dakika pimi kullanarak) yerleştirin (Şekil 3B).
2. Stimülatör açıldığında, ön pençenin küçük seğirmeleri olarak başarılı bir stimülasyon gözlemleyin. M-dalgasını ve ön pençedeki küçük görünür seğirmeleri ortaya çıkarmak için minimum stimülasyon akımı 10-50 μA aralığında olmalıdır.
   NOT: 50 μA'da seğirme görünmüyorsa, stimülasyon elektrotlarını ayarlayın ve petrol jölesini tekrar uygulayın. Ayrıca, farelerde, M-dalgasının H-dalgası^5'ten daha düşük stimülasyon yoğunluklarında görünmesi nadir değildir.

5. Ölçüm

1. Sinirin uyarılmasını her biri 0.2 ms uzunluğundaki darbelerle 15 kez tekrarlayın. Uyaran setleri arasında 2 dakikalık duraklamalarla, frekans 0.1, 0.5, 1.0, 2.0'dan 5 Hz'e yükseltilir.
   NOT: Bu frekanslar, RDD'nin daha sonra hesaplanması için gereklidir. Tüm EMG verileri, Spike2 yazılımı (CED, sürüm 7.19) gibi yazılımlar kullanılarak kaydedilir, sayısallaştırılır ve analiz edilir. En büyük H-dalgası genliğinin 0.1 Hz'de olması bekleniyor. Frekans ne kadar yüksek olursa, H dalgasının genliği RDD'ye bağlı olarak o kadar küçük olur.
2. Deneyden sonra, enstitünün IACUC protokolüne göre hayvanı kurban edin. Bu deneyde derin anestezi altında PBS ve %4 PFA kullanılarak fare transkardiyal perfüzyonu yapıldı.

Sonuçlar

Stimülasyon frekansı ve pençe başına n = 15 stimülasyon denemesinden, analiz için en az n = 10 başarılı kayıt seçin. Ölçüm hataları (örneğin, eksik M-dalgası) olan denemeler analizin dışında tutulur. Her denemeyi ayrı ayrı analiz edin ve daha sonra grup/zaman karşılaştırmaları için bir ortalama oluşturun. M-dalgası ve H-dalgasının uyarılması ve ortaya çıkması arasındaki gecikme her deneme için kaydedilir. Deneyimlerimize göre, omurilikten daha uzun geçiş süresi nedeniyle M dal...

Tartışmalar

Fare^6'da daha önce tarif edilen transkutanöz H-refleks ölçümlerinin aksine, daha doğrudan ve sinire özgü bir ölçüm sağlıyoruz. Bu yeni yaklaşım, ön ve arka ekstremite sinirlerine (örneğin, sırasıyla medyan, ulnar ve radyal sinirler ve tibial ve siyatik sinirler) uygulanabilir, bu da bu yöntemi birçok hastalık modeline (örneğin, inme, multipl skleroz, amiyotrofik lateral skleroz, travmatik beyin hasarı ve omurilik yaralanması) tanısal bir araç olarak uyarlanabilir hale ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun