Terminale H-Reflex-Messungen bei Mäusen

Zusammenfassung

Die klinische Abklärung der Spastik auf Basis des Hoffmann-Reflexes (H-Reflex) und mittels elektrischer Stimulation peripherer Nerven ist eine etablierte Methode. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine terminale und direkte Nervenstimulation zur Quantifizierung des H-Reflexes in der Vorderpfote der Maus zur Verfügung.

Zusammenfassung

Der Hoffmann-Reflex (H-Reflex) ermöglicht als elektrisches Analogon zum Dehnungsreflex die elektrophysiologische Validierung der Integrität neuronaler Schaltkreise nach Verletzungen wie Rückenmarksschäden oder Schlaganfall. Eine Zunahme der H-Reflexantwort ist zusammen mit Symptomen wie unwillkürlichen Muskelkontraktionen, pathologisch verstärktem Dehnungsreflex und Hypertonie im entsprechenden Muskel ein Indikator für eine Spastik nach einem Schlaganfall (PSS).

Im Gegensatz zu eher nervenunspezifischen transkutanen Messungen stellen wir hier ein Protokoll zur Quantifizierung des H-Reflexes direkt am Nervus ulnaris und medianus der Vorderpfote vor, das mit geringfügigen Modifikationen auf den Nervus tibialis und ischiadica der Hinterpfote anwendbar ist. Basierend auf der direkten Stimulation und der Anpassung an verschiedene Nerven stellt die Methode ein zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug dar, um elektrophysiologische Veränderungen in spastizitätsbedingten Krankheitsmodellen zu validieren.

Einleitung

Der Hoffmann-Reflex (H-Reflex), benannt nach dem Physiologen Paul Hoffmann, kann durch elektrische Stimulation peripherer Nerven hervorgerufen werden, die Axone von sensorischen und motorischen Neuronen tragen, die von denselben Muskeln ausgehen und zu ihnen führen. Es ist das elektrisch induzierte Analogon des monosynaptischen Dehnungsreflexes und teilt sich den gleichen Weg¹. Im Gegensatz zur Muskeldehnung resultiert der H-Reflex aus einer elektrischen Stimulation. Wenn periphere Nerven mit niedriger Stromintensität elektrisch stimuliert werden, werden die Ia-afferenten Fasern aufgrund ihres großen Axondurchmessers typischerweise zuerst depolarisiert². Ihre Aktionspotentiale regen Alpha-Motoneuronen (αMNs) im Rückenmark an, die wiederum Aktionspotentiale auslösen, die über die αMN-Axone in Richtung Muskel wandern (Abbildung 1). Diese Kaskade erzeugt eine Muskelantwort mit kleiner Amplitude, die sich in der sogenannten H-Welle widerspiegelt. Durch die allmähliche Erhöhung der Reizintensität erhöht sich die Amplitude der H-Welle durch die Rekrutierung zusätzlicher motorischer Einheiten. Ab einer bestimmten Reizintensität werden in den dünneren Axonen der αMNs direkt Aktionspotentiale ausgelöst, die als M-Welle aufgezeichnet werden. Diese M-Welle tritt mit einer kürzeren Latenz auf als die H-Welle (Abbildung 2). Wird die Stimulationsintensität weiter erhöht, wird die Amplitude der M-Welle durch die Rekrutierung von mehr αMN-Axonen größer, während die H-Welle allmählich kleiner wird. Die H-Welle kann bei hohen Stimulusintensitäten durch antidrome Backpropagation von Aktionspotentialen in den αMN-Axonen unterdrückt werden. Diese ausgelösten Aktionspotentiale kollidieren mit denen der Ia-Stimulation und können sich so gegenseitig aufheben. Bei supramaximalen Reizintensitäten treten in allen MN-Axonen orthodrome (zum Muskel hin) und antidrome (zum Rückenmark hin) Aktionspotentiale auf; Ersteres führt zur maximalen M-Wellen-Amplitude (Mmax), während letzteres zur vollständigen Aufhebung des H-Reflexes³ führt.

Für die Beurteilung von Spastizität nach Schlaganfall (PSS) oder Rückenmarksverletzung (SCI) wurde der H-Reflex verwendet, um die neuronalen Grundlagen von Bewegung und Spastik beim Menschen zu beurteilen¹. Eine verbesserte Quantifizierung der Veränderung des H-Reflexes zwischen Messungen und zwischen Probanden wird durch die Verwendung des Verhältnisses von H- und M-Welle (H/M-Verhältnis) erreicht. Alternativ wird die geschwindigkeitsabhängige Depression (RDD) mit einer Reihe von aufsteigenden Frequenzen (z. B. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 und 5,0 Hz) gemessen. Die RDD spiegelt die Integrität von hemmenden Schaltkreisen wider, die durch Schlaganfall oder Rückenmarksverletzung gestört werden können. Wenn alle neuronalen Schaltkreise intakt sind, kommt es zu einer gleichmäßigen, frequenzunabhängigen Unterdrückung des H-Reflexes. Kommt es jedoch zu einer verminderten neuronalen Hemmung infolge eines Schlaganfalls oder einer Rückenmarksverletzung, nimmt die Unterdrückung des H-Reflexes mit zunehmender Stimulationsfrequenz^{ab 4}.

Die korrekte elektrophysiologische Ableitung mit Oberflächenelektroden kann eine Herausforderung darstellen und durch motorische Aufgaben, inhibitorische Mechanismen und die αMN-Erregbarkeit beeinflusst werden⁵. Bei der transkutanen Aufnahme bei Nagetieren wird eine Reizelektrode in der Nähe des Nervus tibialis und eine Aufzeichnungselektrode in der Nähe der zugehörigen Muskeln in der Vorderpfote platziert. Unserer Erfahrung nach ist die korrekte Platzierung der transkutanen Elektroden (Abbildung 1A) bei Nagetieren jedoch noch komplexer und variabler als die Platzierung der Oberflächenelektroden beim Menschen. Dies kann zu Unterschieden in Länge, Frequenz und Stimulationsintensität führen, die notwendig sind, um den H-Reflex auszulösen. Diese methodischen Herausforderungen könnten erklären, warum es nur eine sehr begrenzte Anzahl von H-Reflex-Messstudien gibt (z.B. in experimentellen Schlaganfallmodellen ^3,4 und anderen Spastikmodellen⁶). Eine präzise (Langzeit-)Stimulation und Aufzeichnung des H-Reflexes an einzelnen Nerven könnte prinzipiell mit implantierbaren Elektroden erreicht werden, die den Zielnerv ^7,8 umgeben. Aufgrund der anspruchsvollen Operation mit möglichen Nebenwirkungen für das Tier und der möglichen Instabilität der Sonde ist dieser Ansatz in der Praxis nicht zum Standard geworden. Die hier vorgestellte Methode erfordert auch einiges an chirurgischem Fachwissen. Es ermöglicht jedoch eine neuartige, präzise Stimulation und Aufzeichnung isolierter Nerven in vivo mit geringen Stimulationsintensitäten, wodurch eine gleichzeitige Stimulation benachbarter Nerven vermieden wird.

Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Tierschutzgesetzen und institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen genehmigt (Az: 81-02.04.2019.A309). Das Protokoll ist optimiert für adulte Mäuse (ca. 8-16 Wochen alte C57Bl/6J Mäuse) und die Aufnahme der Vordergliedmaßen. Es kann leicht angepasst werden, indem die entsprechenden Nerven der Hintergliedmaße stimuliert und die Hinterpfotenmuskulatur aufgezeichnet wird (Abbildung 1B). Eine Beschreibung der Aufzeichnungs- und Stimulationselektroden ist in der Materialtabelle beigefügt. Beachten Sie, dass das Protokoll nur für eine Terminalmessung verwendet wird.

1. Vorbereitung

1. Wiegen Sie das Tier und beginnen Sie die Anästhesie, indem Sie eine Mischung aus Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) i.p . injizieren.
2. Lassen Sie die Maus in der Warmhaltebox, bis die chirurgische Toleranz erreicht ist. Warten Sie ein paar Minuten, bis sich die Maus beruhigt hat, die Atmung stabil ist und die Reflexe fehlen. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen messen.
3. Drehen Sie die Maus auf den Rücken und legen Sie sie auf ein Heizkissen (optimal wäre eine rückkopplungsgesteuerte Erwärmung mit einem rektalen Temperaturfühler). Fixiere die Vorderpfoten mit Klebeband. Achten Sie dabei darauf, dass das Tape so positioniert ist, dass die Messelektroden leicht in die Vorderpfoten eingeführt werden können.
4. Führen Sie eine rektale Sonde ein, um die Temperatur des Tieres zu messen, und fixieren Sie sie mit Klebeband. Tragen Sie Augensalbe auf, damit die Augen nicht austrocknen.

2. Chirurgie

HINWEIS: Der stabile Zustand des anästhesierten Tieres, d. h. Atmung, Temperatur und Reflexverlust, sollte während des gesamten Eingriffs regelmäßig überwacht werden. Das Verfahren der H-Wellen-Messung des direkten Nervs ist für den Nervus radialis/ulnaris/medianus der Vorderpfote dargestellt (Abbildung 3A). Die Messung kann mit Modifikationen auch an die Hinterpfote (Ischias-/Tibianerv) angepasst werden.

1. Für einen besseren Überblick über das Operationsgebiet entfernen Sie die Haare vorher mit einem Elektrorasierer oder einer Schere an einer separaten Stelle. Für erfahrenere Chirurgen ist dies nur optional.
   HINWEIS: Eine Desinfektion ist hier nicht notwendig, da es sich um ein Endexperiment handelt. Das Tier wird später eingeschläfert.
2. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und machen Sie mit einer feinen abgerundeten Schere einen Schnitt von ca. 1 cm in die Haut entlang der ventro-hinteren Achse der Vorderpfote (Bereich über Achselhöhle und Brustkorb).
3. Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe und legen Sie den darunter liegenden Muskel und Nerv frei. Entfernen Sie den freiliegenden Musculus pectoralis profundus mit einer Pinzette, um Zugang zum Nervus medianus zu erhalten (Abbildung 3E,F). Entfernen Sie kleine Mengen Blut und Gewebsflüssigkeit mit Weichgewebe.
4. Im nächsten Schritt schneiden Sie die Brust oder den Achselmuskel vorsichtig von oben nach unten auf, um das darunter liegende Nervenbündel freizulegen. Befreien Sie das Nervenbündel auf einer Länge von ca. 1,5 cm vom Binde- und Muskelgewebe.
   HINWEIS: Hier sollte besonders darauf geachtet werden, dass die Blutgefäße, die parallel zum Nervus medianus verlaufen, nicht beschädigt werden. Wenn Sie das Gewebe schneiden, schneiden Sie immer entlang des Nervs, um ihn nicht zu verletzen. Entfernen Sie in diesem Fall austretende Flüssigkeit und Blut mit einem Tupfer. Ein Astereo-Mikroskop ist nicht für das gesamte Experiment notwendig, kann aber für die Präparation der Nerven nützlich sein.
5. Trennen Sie den Nervus ulnaris und den Nervus medianus der Vorderpfote vorsichtig mit einer gebogenen Glaspipette (Abbildung 3E). Der obere der beiden Nerven ist der Nervus ulnaris und der untere ist der Nervus medianus.
   Anmerkungen: Wenn Sie die Nerven voneinander trennen, achten Sie darauf, dass das darunter liegende Blutgefäß nicht verletzt wird.

3. Platzierung der Elektroden

1. Ordnen Sie die Elektroden der Stimulationshaken parallel in einem Abstand von 0,5-1,0 mm an und positionieren Sie den Doppelhaken mit einem Mikromanipulator in unmittelbarer Nähe des Nervs.
2. Verwenden Sie den Glashaken als Werkzeug, um den Nervus ulnaris auf die Elektroden des Stimulationshakens zu heben. Ziehen Sie die Elektrode mit dem Nerv zurück und trennen Sie sie mit dem Mikromanipulator ca. 1-2 mm von anderen Nerven (Abbildung 3D, F).
3. Platzieren Sie die Elektroden entlang der Längsachse der Pfote, um das Übersprechen zwischen den Muskeln zu reduzieren.
   HINWEIS: Die Platzierung der Elektroden ist sehr wichtig, aber aufgrund der individuellen Anatomie schwer zu standardisieren. Es erfordert einen erfahrenen Chirurgen, um die Elektroden richtig zu platzieren. Die Drähte können auch neu positioniert werden, wenn die Signalamplitude nicht zufriedenstellend ist.
4. Trocknen Sie die am Nerv befestigten Elektrodenhaken oberflächlich ab und tragen Sie Vaseline mit einer Spritze auf, um sie elektrisch vom angrenzenden Gewebe zu isolieren.
   Anmerkungen: Es sollte darauf geachtet werden, dass genügend Vaseline auf die Elektrode und auch zwischen den beiden Haken aufgetragen wird, um die elektrische Isolierung zu gewährleisten und ein Austrocknen der Nerven zu verhindern.

4. Platzierung der Aufzeichnungs- und Referenzelektroden

1. Um den H-Reflex zu messen, positionieren Sie die EMG-Elektroden intramuskulär in der Vorderpfote. Positionieren Sie außerdem die Referenzelektrode subkutan in der Hintergliedmaße (z. B. mit einem winzigen Stift), der von einer Miniatur-Krokodilklemme gehalten wird (Abbildung 3B).
2. Wenn der Stimulator eingeschaltet ist, beobachten Sie eine erfolgreiche Stimulation als winziges Zucken der Vorderpfote. Der minimale Reizstrom, um die M-Welle und winzige sichtbare Zuckungen in der Vorderpfote hervorzurufen, sollte im Bereich von 10-50 μA liegen.
   Anmerkungen: Wenn bei 50 μA keine Zuckungen sichtbar sind, passen Sie die Stimulationselektroden an und tragen Sie Vaseline erneut auf. Auch bei Mäusen ist es nicht ungewöhnlich, dass die M-Welle bei geringeren Stimulationsintensitäten auftritt als die H-Welle⁵.

5. Messung

1. Wiederholen Sie die Stimulation des Nervs 15 Mal mit jeweils 0,2 ms langen Impulsen. Bei Pausen von 2 Minuten zwischen den Stimuli wird die Frequenz von 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 auf 5 Hz erhöht.
   HINWEIS: Diese Frequenzen sind notwendig, wenn die RDD nachträglich berechnet wird. Alle EMG-Daten werden mit einer Software, z. B. der Spike2-Software (CED, Version 7.19), aufgezeichnet, digitalisiert und analysiert. Die größte H-Wellen-Amplitude wird bei 0,1 Hz erwartet. Je höher die Frequenz, desto kleiner wird die Amplitude der H-Welle aufgrund der RDD.
2. Opfern Sie das Tier nach dem Experiment gemäß dem IACUC-Protokoll des Instituts. In diesem Experiment wurde die transkardiale Perfusion der Maus unter Verwendung von PBS und 4% PFA unter tiefer Betäubung durchgeführt.

Ergebnisse

Wählen Sie aus den n = 15 Stimulationsversuchen pro Stimulationsfrequenz und Pfote mindestens n = 10 erfolgreiche Aufnahmen für die Analyse aus. Versuche mit Messfehlern (z.B. fehlende M-Welle) sind von der Analyse ausgeschlossen. Analysieren Sie jeden Versuch separat und generieren Sie einen Durchschnitt für spätere Gruppen-/Zeitvergleiche. Die Latenz zwischen Stimulation und Auftreten der M- und H-Welle wird für jeden Versuch aufgezeichnet. Unserer Erfahrung nach tritt die M-Welle ca. 2 ms nach der Stimulation und...

Diskussion

Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen transkutanen H-Reflex-Messungen in der Maus⁶ bieten wir eine direktere und nervenspezifischere Messung an. Dieser neue Ansatz kann auf die Nerven der Vorder- und Hintergliedmaße (z. B. den Nervus medianus, ulnaris und radialis sowie den Nervus tibialis bzw. den Ischiasnerv) angewendet werden, wodurch diese Methode als diagnostisches Werkzeug an viele Krankheitsmodelle (z. B. Schlaganfall, Multiple Sklerose, Amyotrophe Lateralsklerose, Schädel-Hirn-Trauma u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun