Mesures terminales du réflexe H chez la souris

Résumé

L’évaluation clinique de la spasticité basée sur le réflexe de Hoffmann (réflexe H) et utilisant la stimulation électrique des nerfs périphériques est une méthode établie. Ici, nous fournissons un protocole pour une stimulation nerveuse terminale et directe pour la quantification du réflexe H dans la patte avant de la souris.

Résumé

Le réflexe de Hoffmann (réflexe H), en tant qu’analogue électrique du réflexe d’étirement, permet une validation électrophysiologique de l’intégrité des circuits neuronaux après des lésions telles que des lésions de la moelle épinière ou un accident vasculaire cérébral. Une augmentation de la réponse réflexe H, ainsi que des symptômes tels que des contractions musculaires non volontaires, un réflexe d’étirement pathologiquement augmenté et une hypertonie dans le muscle correspondant, est un indicateur de spasticité post-AVC (PSS).

Contrairement aux mesures transcutanées plutôt non spécifiques aux nerfs, nous présentons ici un protocole pour quantifier le réflexe H directement au niveau des nerfs ulnaire et médian de la patte antérieure, qui est applicable, avec des modifications mineures, au nerf tibial et sciatique de la patte postérieure. Basée sur la stimulation directe et l’adaptation à différents nerfs, la méthode représente un outil fiable et polyvalent pour valider les changements électrophysiologiques dans les modèles de maladies liées à la spasticité.

Introduction

Le réflexe d’Hoffmann (H-reflex), du nom du physiologiste Paul Hoffmann, peut être évoqué par stimulation électrique des nerfs périphériques, qui transportent des axones de neurones sensoriels et moteurs provenant et conduisant aux mêmes muscles. C’est l’analogue électriquement induit du réflexe d’étirement monosynaptique, et partage la même voie¹. Contrairement à l’étirement musculaire, le réflexe H résulte d’une stimulation électrique. Lorsque les nerfs périphériques sont stimulés électriquement à faible intensité de courant, les fibres afférentes Ia sont généralement dépolarisées en premier en raison de leur grand diamètre^{axonale 2}. Leurs potentiels d’action excitent les motoneurones alpha (αMN) dans la moelle épinière, qui à leur tour suscitent des potentiels d’action qui descendent le long des axones αMN vers le muscle (Figure 1). Cette cascade génère une réponse musculaire de faible amplitude, reflétée dans ce que l’on appelle l’onde H. En augmentant progressivement l’intensité du stimulus, l’amplitude de l’onde H augmente en raison du recrutement d’unités motrices supplémentaires. À partir d’une certaine intensité de stimulus, les potentiels d’action dans les axones plus minces des αMN sont obtenus directement, ce qui est enregistré sous forme d’onde M. Cette onde M apparaît avec une latence plus courte que l’onde H (Figure 2). Si l’intensité de la stimulation est encore augmentée, l’amplitude de l’onde M devient plus grande en raison du recrutement de plus d’axones αMN, tandis que l’onde H devient progressivement plus petite. L’onde H peut être supprimée à des intensités de stimulus élevées en raison de la rétropropagation antidromique des potentiels d’action dans les axones αMN. Ces potentiels d’action déclenchés entrent en collision avec ceux de la stimulation Ia et peuvent donc s’annuler mutuellement. Aux intensités de stimulus supramaximales, des potentiels d’action orthodromiques (vers le muscle) et antidromiques (vers la moelle épinière) se produisent dans tous les axones MN; le premier donne lieu à l’amplitude maximale de l’onde M (Mmax), tandis que le second entraîne l’abolition complète du réflexe H³.

Pour l’évaluation de la spasticité post-AVC (PSS) ou des lésions de la moelle épinière (LME), le réflexe H a été utilisé pour évaluer la base neurale du mouvement et de la spasticité chez l’homme¹. Une meilleure quantification du changement du réflexe H entre les mesures et entre les sujets est obtenue en utilisant le rapport de l’onde H et de l’onde M (rapport H/M). Alternativement, la dépression dépendante du taux (RDD) est mesurée à l’aide d’un ensemble de fréquences ascendantes (par exemple, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 et 5,0 Hz). Le RDD reflète l’intégrité des circuits inhibiteurs qui peuvent être perturbés par un accident vasculaire cérébral ou une lésion médullaire. Lorsque tous les circuits neuronaux sont intacts, il y a une suppression uniforme et indépendante de la fréquence du réflexe H. Cependant, s’il y a une inhibition neuronale réduite à la suite d’un accident vasculaire cérébral ou d’une lésion médullaire, la suppression du réflexe H diminue avec l’augmentation de la fréquence de stimulation⁴.

L’enregistrement électrophysiologique correct à l’aide d’électrodes de surface peut être difficile et peut être affecté par les tâches motrices, les mécanismes inhibiteurs et l’excitabilité αMN⁵. Dans l’enregistrement transcutané chez les rongeurs, une électrode de stimulus est placée près du nerf tibial et une électrode d’enregistrement est placée près des muscles connexes de la patte antérieure. Selon notre expérience, cependant, le placement correct des électrodes transcutanées (Figure 1A) est encore plus complexe et variable chez les rongeurs que le placement des électrodes de surface chez l’homme. Cela peut entraîner des différences de longueur, de fréquence et d’intensité de stimulation nécessaires pour provoquer le réflexe H. Ces défis méthodologiques pourraient expliquer pourquoi il n’existe qu’un nombre très limité d’études de mesure du réflexe H (p. ex., dans les modèles expérimentaux d’AVC 3^{, 4} et^d’autres modèles de spasticité⁶). Une stimulation et un enregistrement précis (à long terme) du réflexe H sur des nerfs individuels pourraient, en principe, être réalisés à l’aide d’électrodes implantables entourant le nerf cible ^7,8. En raison de la chirurgie difficile avec des effets secondaires potentiels pour l’animal et l’instabilité potentielle de la sonde, cette approche n’est pas devenue une norme dans le domaine. La méthode présentée ici nécessite également une certaine expertise chirurgicale. Cependant, il permet une stimulation et un enregistrement nouveaux et précis de nerfs isolés in vivo en utilisant de faibles intensités de stimulation, ce qui évite la stimulation simultanée des nerfs voisins.

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux lois européennes et nationales sur les soins aux animaux et aux directives institutionnelles, et ont été approuvées par le Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Rhénanie-du-Nord-Westphalie (Az: 81-02.04.2019.A309). Le protocole est optimisé pour les souris adultes (environ 8-16 semaines de souris C57Bl/6J) et l’enregistrement des membres antérieurs. Il peut être facilement adapté en stimulant les nerfs respectifs du membre postérieur et en enregistrant les muscles de la patte postérieure (Figure 1B). Une description des électrodes d’enregistrement et de stimulation est ajoutée dans le tableau des matériaux. Notez que le protocole n’est utilisé que pour une mesure terminale.

1. Préparation

1. Peser l’animal et commencer l’anesthésie en injectant par voie intraveineuse un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).
2. Gardez la souris dans la boîte chauffante jusqu’à ce que la tolérance chirurgicale soit atteinte. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que la souris soit calme, que la respiration soit stable et que les réflexes soient absents. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en mesurant l’absence de réponse au pincement de l’orteil.
3. Tournez la souris sur le dos et placez-la sur un coussin chauffant (optimal serait un chauffage contrôlé par rétroaction à l’aide d’une sonde de température rectale). Fixez les pattes antérieures avec du ruban adhésif. Ici, assurez-vous que le ruban est positionné de manière à ce que les électrodes de mesure soient facilement insérées dans les pattes avant.
4. Insérez une sonde rectale pour mesurer la température de l’animal et fixez-la avec du ruban adhésif. Appliquez une pommade pour les yeux pour empêcher les yeux de se dessécher.

2. Chirurgie

REMARQUE : L’état stable de l’animal anesthésié, c’est-à-dire la respiration, la température et la perte des réflexes, doit être surveillé régulièrement tout au long de la procédure. La procédure de mesure directe de l’onde H nerveuse est illustrée pour le nerf radial/cubital/médian de la patte antérieure (Figure 3A). La mesure peut également être adaptée à la patte arrière (nerf sciatique/tibial) avec des modifications.

1. Pour une meilleure vue d’ensemble de la zone chirurgicale, retirez les cheveux avec un rasoir électrique ou une paire de ciseaux dans un endroit séparé au préalable. Pour les chirurgiens plus expérimentés, cela n’est que facultatif.
   REMARQUE: La désinfection n’est pas nécessaire ici, car il s’agit d’une expérience finale. L’animal sera euthanasié plus tard.
2. Soulevez la peau avec une pince à épiler et faites une incision d’environ 1 cm dans la peau le long de l’axe ventro-postérieur de la patte antérieure (zone au-dessus de l’aisselle et du thorax) avec une paire de ciseaux fins arrondis.
3. Retirez soigneusement le tissu conjonctif et exposez le muscle et le nerf en dessous. Retirez le muscle pectoral profundus exposé à l’aide d’une pince pour accéder au nerf médian (Figure 3E,F). Enlevez de petites quantités de sang et de liquide tissulaire avec les tissus mous.
4. Dans l’étape suivante, coupez soigneusement le sein ou le muscle axillaire du haut vers le bas pour exposer le faisceau nerveux en dessous. Libérez le faisceau nerveux du tissu conjonctif et musculaire sur une longueur d’environ 1,5 cm.
   REMARQUE: Ici, des précautions particulières doivent être prises pour ne pas endommager les vaisseaux sanguins qui courent parallèlement au nerf médian. Lorsque vous coupez le tissu, coupez toujours le long du nerf pour éviter de le blesser. Si cela se produit, retirez le liquide et le sang qui fuient avec un écouvillon. Le microscope stéréoscopique n’est pas nécessaire pour toute l’expérience, mais il peut être utile pour la préparation des nerfs.
5. Séparez soigneusement le nerf ulnaire et le nerf médian de la patte avant à l’aide d’une pipette en verre courbée (figure 3E). Le supérieur des deux nerfs est le nerf ulnaire et le nerf inférieur est le nerf médian.
   REMARQUE: Lorsque vous séparez les nerfs les uns des autres, assurez-vous que le vaisseau sanguin en dessous n’est pas blessé.

3. Placement des électrodes

1. Disposez les électrodes du crochet de stimulation en parallèle à une distance de 0,5 à 1,0 mm et utilisez un micromanipulateur pour positionner le double crochet à proximité du nerf.
2. Utilisez le crochet en verre comme outil pour soulever le nerf ulnaire sur les électrodes du crochet de stimulation. Tirez l’électrode avec le nerf vers l’arrière et séparez-la des autres nerfs d’environ 1 à 2 mm à l’aide du micromanipulateur (Figure 3D,F).
3. Placez les électrodes le long de l’axe long de la patte pour réduire la diaphonie entre les muscles.
   REMARQUE: Le placement des électrodes est très important mais difficile à normaliser en raison de l’anatomie individuelle. Il faut un chirurgien expérimenté pour placer correctement les électrodes. Les fils peuvent également être repositionnés si l’amplitude du signal n’est pas satisfaisante.
4. Sécher superficiellement les crochets d’électrode fixés au nerf et appliquer de la vaseline à l’aide d’une seringue pour fournir une isolation électrique du tissu adjacent.
   REMARQUE: Il faut prendre soin d’appliquer suffisamment de vaseline sur l’électrode et aussi entre les deux crochets pour assurer l’isolation électrique et empêcher les nerfs de se dessécher.

4. Emplacement des électrodes d’enregistrement et de référence

1. Pour mesurer le réflexe H, positionnez les électrodes EMG par voie intramusculaire dans la patte antérieure. De plus, placez l’électrode de référence par voie sous-cutanée dans le membre postérieur (p. ex., à l’aide d’une épingle minute), maintenue par une pince crocodile miniature (figure 3B).
2. Lorsque le stimulateur est allumé, observez une stimulation réussie sous forme de minuscules secousses de la patte antérieure. Le courant de stimulation minimum pour provoquer l’onde M et de minuscules secousses visibles dans la patte avant devrait être compris entre 10 et 50 μA.
   REMARQUE: Si aucune secousse n’est visible à 50 μA, ajustez les électrodes de stimulation et réappliquez de la vaseline. De plus, chez la souris, il n’est pas rare que l’onde M apparaisse à des intensités de stimulation inférieures à celles de l’onde H⁵.

5. Mesure

1. Répétez la stimulation du nerf 15 fois avec des impulsions de 0,2 ms de long chacune. Avec des pauses de 2 minutes entre les séries de stimuli, la fréquence est augmentée de 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 à 5 Hz.
   REMARQUE: Ces fréquences sont nécessaires si vous calculez le RDD par la suite. Toutes les données EMG sont enregistrées, numérisées et analysées à l’aide d’un logiciel, par exemple le logiciel Spike2 (CED, version 7.19). La plus grande amplitude d’onde H est attendue à 0,1 Hz. Plus la fréquence est élevée, plus l’amplitude de l’onde H devient faible en raison du RDD.
2. Après l’expérience, sacrifiez l’animal selon le protocole IACUC de l’institut. Dans cette expérience, une perfusion transcardique de souris a été réalisée en utilisant du PBS et 4% de PFA sous anesthésie profonde.

Résultats

À partir des n = 15 essais de stimulation par fréquence de stimulation et patte, sélectionnez au moins n = 10 enregistrements réussis pour l’analyse. Les essais comportant des erreurs de mesure (p. ex. onde M manquante) sont exclus de l’analyse. Analysez chaque essai séparément et générez une moyenne pour les comparaisons groupe/temps plus tard. La latence entre la stimulation et l’apparition de l’onde M et de l’onde H est enregistrée pour chaque essai. D’après notre expérience, l’onde M se produ...

Discussion

Contrairement aux mesures transcutanées du réflexe H décrites précédemment chez la souris⁶, nous fournissons une mesure plus directe et spécifique aux nerfs. Cette nouvelle approche peut être appliquée aux nerfs des membres antérieur et postérieur (p. ex., les nerfs médian, ulnaire et radial, et les nerfs tibial et sciatique, respectivement), ce qui rend cette méthode adaptable en tant qu’outil de diagnostic à de nombreux modèles de maladies (p. ex. accident vasculaire cérébral, ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun