Mediciones terminales del reflejo H en ratones

Resumen

La evaluación clínica de la espasticidad basada en el reflejo de Hoffmann (reflejo H) y el uso de estimulación eléctrica de los nervios periféricos es un método establecido. Aquí, proporcionamos un protocolo para una estimulación nerviosa terminal y directa para la cuantificación del reflejo H en la pata delantera del ratón.

Resumen

El reflejo de Hoffmann (reflejo H), como análogo eléctrico del reflejo de estiramiento, permite la validación electrofisiológica de la integridad de los circuitos neuronales después de lesiones como daño de la médula espinal o accidente cerebrovascular. Un aumento de la respuesta del reflejo H, junto con síntomas como contracciones musculares no voluntarias, reflejo de estiramiento patológicamente aumentado e hipertonía en el músculo correspondiente, es un indicador de espasticidad posterior al accidente cerebrovascular (PSS).

En contraste con las mediciones transcutáneas bastante inespecíficas del nervio, aquí presentamos un protocolo para cuantificar el reflejo H directamente en los nervios cubital y mediano de la pata delantera, que es aplicable, con modificaciones menores, al nervio tibial y ciático de la pata posterior. Basado en la estimulación directa y la adaptación a diferentes nervios, el método representa una herramienta fiable y versátil para validar cambios electrofisiológicos en modelos de enfermedades relacionadas con la espasticidad.

Introducción

El reflejo de Hoffmann (reflejo H), llamado así por el fisiólogo Paul Hoffmann, puede ser evocado por la estimulación eléctrica de los nervios periféricos, que transportan axones de neuronas sensoriales y motoras que surgen y conducen a los mismos músculos. Es el análogo inducido eléctricamente del reflejo de estiramiento monosináptico, y comparte la misma vía¹. A diferencia del estiramiento muscular, el reflejo H resulta de la estimulación eléctrica. Cuando los nervios periféricos se estimulan eléctricamente a baja intensidad de corriente, las fibras aferentes de Ia generalmente se despolarizan primero debido a su gran diámetro axónico². Sus potenciales de acción excitan las motoneuronas alfa (αMNs) en la médula espinal, que a su vez provocan potenciales de acción que viajan por los axones αMN hacia el músculo (Figura 1). Esta cascada genera una respuesta muscular con pequeña amplitud, reflejada en la llamada onda H. Al aumentar gradualmente la intensidad del estímulo, la amplitud de la onda H aumenta debido al reclutamiento de unidades motoras adicionales. A partir de una cierta intensidad de estímulo, se obtienen directamente potenciales de acción en los axones más delgados de los αMN, que se registran como la onda M. Esta onda M aparece con una latencia más corta que la onda H (Figura 2). Si la intensidad de la estimulación aumenta aún más, la amplitud de la onda M aumenta debido al reclutamiento de más axones αMN, mientras que la onda H se vuelve gradualmente más pequeña. La onda H puede suprimirse a altas intensidades de estímulo debido a la retropropagación antidrómica de los potenciales de acción en los axones αMN. Estos potenciales de acción activados chocan con los de la estimulación Ia y, por lo tanto, pueden cancelarse entre sí. A intensidades de estímulo supramáximas, se producen potenciales de acción ortodrómicos (hacia el músculo) y antidrómicos (hacia la médula espinal) en todos los axones MN; el primero da lugar a la amplitud máxima de la onda M (Mmax), mientras que el segundo resulta en la abolición completa del reflejo H³.

Para la evaluación de la espasticidad post-accidente cerebrovascular (PSS) o lesión de la médula espinal (LME), el reflejo H se ha utilizado para evaluar las bases neurales del movimiento y la espasticidad en humanos¹. Una cuantificación mejorada del cambio en el reflejo H entre mediciones y entre sujetos se logra utilizando la relación de la onda H y M (relación H / M). Alternativamente, se mide la depresión dependiente de la velocidad (RDD), utilizando un conjunto de frecuencias ascendentes (por ejemplo, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 Hz). La RDD refleja la integridad de los circuitos inhibitorios que pueden ser perturbados por un accidente cerebrovascular o LME. Cuando todos los circuitos neuronales están intactos, hay una supresión uniforme e independiente de la frecuencia del reflejo H. Sin embargo, si hay una inhibición neural reducida como resultado de un accidente cerebrovascular o LME, la supresión del reflejo H disminuye con el aumento de la frecuencia de estimulación⁴.

El registro electrofisiológico correcto utilizando electrodos de superficie puede ser desafiante y puede verse afectado por tareas motoras, mecanismos inhibitorios y excitabilidad αMN⁵. En el registro transcutáneo en roedores, se coloca un electrodo de estímulo cerca del nervio tibial y se coloca un electrodo de registro cerca de los músculos relacionados en la pata delantera. Sin embargo, según nuestra experiencia, la colocación correcta de los electrodos transcutáneos (Figura 1A) es aún más compleja y variable en roedores que la colocación de electrodos de superficie en humanos. Esto puede conducir a diferencias en la longitud, frecuencia e intensidad de estimulación necesarias para provocar el reflejo H. Estos desafíos metodológicos podrían explicar por qué solo hay un número muy limitado de estudios de medición del reflejo H (por ejemplo, en modelos experimentales de accidente cerebrovascular ^3,4 y otros modelos de espasticidad⁶. Una estimulación precisa (a largo plazo) y el registro del reflejo H en los nervios individuales podrían, en principio, lograrse utilizando electrodos implantables que rodean el nervio objetivo ^7,8. Debido a la cirugía desafiante con posibles efectos secundarios para el animal y la posible inestabilidad de la sonda, este enfoque no se ha convertido en un estándar en el campo. El método presentado aquí también requiere cierta experiencia quirúrgica. Sin embargo, permite una estimulación novedosa y precisa y el registro de nervios aislados in vivo utilizando intensidades de estimulación bajas, lo que evita la estimulación simultánea de los nervios vecinos.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las leyes europeas y nacionales sobre el cuidado de los animales y las directrices institucionales, y fueron aprobados por el Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Renania del Norte-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). El protocolo está optimizado para ratones adultos (ratones C57Bl/6J de aprox. 8-16 semanas de edad) y el registro de las extremidades anteriores. Se puede adaptar fácilmente estimulando los nervios respectivos de la extremidad posterior y registrando los músculos de las patas traseras (Figura 1B). Se agrega una descripción de los electrodos de registro y estimulación en la Tabla de materiales. Tenga en cuenta que el protocolo se utiliza sólo para una medición terminal.

1. Preparación

1. Pesar al animal e iniciar la anestesia inyectando por i.p. una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg).
2. Mantenga el ratón en la caja de calentamiento hasta que se alcance la tolerancia quirúrgica. Espere unos minutos hasta que el ratón esté tranquilo, la respiración sea estable y los reflejos estén ausentes. Verifique la profundidad de la anestesia midiendo la falta de respuesta a la pinza del dedo del pie.
3. Gire el mouse sobre su espalda y colóquelo en una almohadilla térmica (lo óptimo sería el calentamiento controlado por retroalimentación usando una sonda de temperatura rectal). Fije las patas delanteras con cinta adhesiva. Aquí, asegúrese de que la cinta esté colocada de tal manera que los electrodos de medición se inserten fácilmente en las patas delanteras.
4. Inserte una sonda rectal para medir la temperatura del animal y fíjela con cinta adhesiva. Aplique ungüento para los ojos para evitar que los ojos se sequen.

2. Cirugía

NOTA: La condición estable del animal anestesiado, es decir, la respiración, la temperatura y la pérdida de reflejos, debe controlarse regularmente durante todo el procedimiento. El procedimiento de medición de la onda H del nervio directo se muestra para el nervio radial/cubital/mediano de la pata delantera (Figura 3A). La medición también se puede adaptar a la pata trasera (nervio ciático/tibial) con modificaciones.

1. Para una mejor visión general del área quirúrgica, retire el vello con una maquinilla de afeitar eléctrica o un par de tijeras en un lugar separado de antemano. Para los cirujanos más experimentados, esto es solo opcional.
   NOTA: La desinfección no es necesaria aquí, ya que este es un experimento final. El animal será sacrificado más tarde.
2. Levante la piel con pinzas y haga una incisión de aproximadamente 1 cm en la piel a lo largo del eje ventro-posterior de la pata delantera (área por encima de la axila y el tórax) con un par de tijeras finas y redondeadas.
3. Retire con cuidado el tejido conectivo y exponga el músculo y el nervio debajo. Extraer el músculo pectoral profundus expuesto con fórceps, para acceder al nervio mediano (Figura 3E,F). Extraer pequeñas cantidades de sangre y líquido tisular con tejido blando.
4. En el siguiente paso, corte con cuidado el seno o el músculo axilar de arriba a abajo para exponer el haz de nervios debajo. Libere el haz de nervios del tejido conectivo y muscular en una longitud de aproximadamente 1,5 cm.
   NOTA: Aquí, se debe tener especial cuidado de no dañar los vasos sanguíneos que corren en paralelo al nervio mediano. Al cortar el tejido, siempre corte a lo largo del nervio para evitar lesionarlo. Si esto sucede, retire la fuga de líquido y sangre con un hisopo. El microscopio estéreo no es necesario para todo el experimento, sin embargo, puede ser útil para la preparación de los nervios.
5. Separe cuidadosamente el nervio cubital y el nervio mediano de la pata delantera con una pipeta de vidrio doblada (Figura 3E). El superior de los dos nervios es el nervio cubital, y el inferior es el nervio mediano.
   NOTA: Al separar los nervios entre sí, asegúrese de que el vaso sanguíneo debajo no esté lesionado.

3. Colocación de electrodos

1. Coloque los electrodos del gancho de estimulación en paralelo a una distancia de 0.5-1.0 mm, y use un micromanipulador para colocar el gancho doble muy cerca del nervio.
2. Use el gancho de vidrio como una herramienta para levantar el nervio cubital sobre los electrodos del gancho de estimulación. Tire hacia atrás del electrodo con el nervio y sepárelo de otros nervios aproximadamente 1-2 mm usando el micromanipulador (Figura 3D, F).
3. Coloque los electrodos a lo largo del eje largo de la pata para reducir la diafonía entre los músculos.
   NOTA: La colocación de los electrodos es muy importante pero difícil de estandarizar debido a la anatomía individual. Requiere un cirujano experimentado para colocar los electrodos correctamente. Los cables también se pueden reposicionar si la amplitud de la señal no es satisfactoria.
4. Seque superficialmente los ganchos de electrodos unidos al nervio y aplique vaselina con una jeringa para proporcionar aislamiento eléctrico del tejido adyacente.
   NOTA: Se debe tener cuidado de aplicar suficiente vaselina al electrodo y también entre los dos ganchos para garantizar el aislamiento eléctrico y evitar que los nervios se sequen.

4. Colocación de los electrodos de registro y referencia

1. Para medir el reflejo H, coloque los electrodos EMG por vía intramuscular en la pata delantera. Además, coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la extremidad posterior (p. ej., usando un alfiler diminuto), sostenido por una pinza de cocodrilo en miniatura (Figura 3B).
2. Cuando se enciende el estimulador, observe una estimulación exitosa como pequeñas contracciones de la pata delantera. La corriente de estimulación mínima para provocar la onda M y pequeñas contracciones visibles en la pata delantera debe estar en el rango de 10-50 μA.
   NOTA: Si no hay contracciones visibles a 50 μA, ajuste los electrodos de estimulación y vuelva a aplicar vaselina. Además, en ratones, no es raro que la onda M aparezca a intensidades de estimulación más bajas que la onda H⁵.

5. Medición

1. Repita la estimulación del nervio 15 veces con pulsos de 0,2 ms de duración cada uno. Con pausas de 2 minutos entre conjuntos de estímulos, la frecuencia aumenta de 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 a 5 Hz.
   NOTA: Estas frecuencias son necesarias si se calcula el RDD posteriormente. Todos los datos de EMG se registran, digitalizan y analizan utilizando software, por ejemplo, el software Spike2 (CED, versión 7.19). La mayor amplitud de onda H se espera en 0,1 Hz. Cuanto mayor es la frecuencia, menor es la amplitud de la onda H debido al RDD.
2. Después del experimento, sacrifique el animal según el protocolo IACUC del instituto. En este experimento se realizó perfusión transcárdica en ratón utilizando PBS y PFA al 4% bajo anestesia profunda.

Resultados

De los n = 15 ensayos de estimulación por frecuencia de estimulación y pata, seleccione al menos n = 10 registros exitosos para el análisis. Los ensayos con errores de medición (p.ej., falta de onda M) se excluyen del análisis. Analice cada ensayo por separado y genere un promedio para las comparaciones de grupo/tiempo más adelante. La latencia entre la estimulación y la aparición de la onda M y la onda H se registra para cada ensayo. En nuestra experiencia, la onda M ocurre aproximadamente 2 ms después de la es...

Discusión

En contraste con las mediciones transcutáneas del reflejo H descritas anteriormente en el ratón⁶, proporcionamos una medición más directa y específica del nervio. Este nuevo enfoque se puede aplicar a los nervios de la extremidad anterior y posterior (por ejemplo, los nervios mediano, cubital y radial, y los nervios tibial y ciático, respectivamente), lo que hace que este método sea adaptable como herramienta de diagnóstico a muchos modelos de enfermedades (por ejemplo, accidente cerebrova...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun