Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لتصور وقياس حلقات الأكتين والمكونات الأخرى للهيكل العظمي الدوري للغشاء للجزء الأولي من المحور العصبي باستخدام الخلايا العصبية الحصينية للفئران المستزرعة ومجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM).

Abstract

الجزء الأولي للمحور العصبي (AIS) هو الموقع الذي تبدأ فيه إمكانات العمل ويشكل مرشحا للنقل وحاجزا للانتشار يساهم في الحفاظ على قطبية الخلايا العصبية عن طريق فرز البضائع الجسدية الشجيرية. يوفر الهيكل العظمي الدوري الغشائي (MPS) الذي يتكون من حلقات أكتين دورية سقالة لتثبيت بروتينات AIS المختلفة ، بما في ذلك البروتينات الهيكلية والقنوات الأيونية المختلفة. على الرغم من أن النهج البروتينية الحديثة قد حددت عددا كبيرا من مكونات AIS الجديدة ، إلا أن تفاصيل هيكل MPS وأدوار مكوناته الفردية غير موجودة. تتطلب المسافة بين حلقات الأكتين الفردية في MPS (~ 190 نانومتر) استخدام تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة لحل التفاصيل الهيكلية ل MPS. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخدام الخلايا العصبية الحصينية الفئران المستزرعة لفحص التوطين الدقيق لبروتين AIS في MPS بالنسبة لحلقات الأكتين الغشائية الفرعية باستخدام مجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM). بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا وصف نهج تحليلي لتقييم دورية المكونات الفردية وموقعها بالنسبة لحلقات الأكتين كميا.

Introduction

الجزء الأولي للمحور العصبي (AIS) هو منطقة قصيرة ومتخصصة بشكل فريد من المحور العصبي القريب من الخلايا العصبية الفقارية1. يتكون AIS من مرشح نقل وحاجز انتشار ضروري للحفاظ على قطبية الخلايا العصبية عن طريق فرز البضائع الجسدية المتغصنة2،3،4،5،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهيكل الفريد لنظام AIS يسمح له باستيعاب مجموعات من القنوات الأيونية ذات بوابات الجهد التي تسهل وظيفته كموقع لبدء العمل المحتمل 8. يكمن المجمع الهيكلي المستقر للغاية وراء الوظائف الفريدة لنظام AIS. كشفت الأبحاث خلال العقد الماضي عن وجود هيكل عظمي دوري غشائي (MPS) يحتوي على حلقات أكتين متصلة بواسطة الطيف وتوفير سقالة لتثبيت بروتينات AIS المختلفة9,10.

المسافة بين حلقات الأكتين في MPS (~ 190 نانومتر)9,10 هي تحت حد الدقة من المجهر الضوئي التقليدي. لم تنجح المحاولات المبكرة لاستخدام المجهر الإلكتروني لتصور MPS ، حيث فشلت إجراءات التحضير القاسية المعنية في الحفاظ على بنية MPS. وهكذا ، أثبتت تقنيات الفحص المجهري فائق الدقة أنها لا تقدر بثمن في توضيح بعض التفاصيل الهيكلية ل MPS11. ومع ذلك ، فإن فهم المجمع الهيكلي AIS ، وهوية ووظائف مكوناته ، وتنظيمه الزماني المكاني لا يزال غير مكتمل. نجحت الدراسات البروتينية الحديثة في إنشاء قائمة كبيرة من البروتينات التي تتمركز في AIS بالقرب من المكونات الهيكلية ل AIS12,13. ومع ذلك ، لا تزال تفاصيل وظيفتها ومكانها الدقيق في مجمع AIS غير موجودة. وبالتالي ، فإن تقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة تعمل كأداة أساسية لفحص المواضع الدقيقة لهذه البروتينات بالنسبة لمكونات MPS الأخرى والتحقيق في وظائفها. يمكن للعديد من تقنيات الفحص المجهري الضوئي تحقيق دقة أعلى من حد حيود الضوء ، حتى أن بعضها قادر على توطين جزيئات مفردة. ومع ذلك، فإن العديد من هذه التقنيات تتطلب عادة فلوروفورات متخصصة أو مخازن مؤقتة للتصوير، وغالبا ما يكون الحصول على الصور يستغرق وقتا طويلا14.

لا يتطلب الفحص المجهري للإضاءة المهيكلة ثلاثية الأبعاد (3D-SIM) ، نظرا لسهولة استخدامه ومتطلبات إعداد العينات البسيطة ، كواشف خاصة للتصوير أو إعداد العينات ، ويعمل بشكل جيد مع مجموعة واسعة من الفلوروفورات والعينات ، ويمكن تنفيذه بسهولة بألوان متعددة ، وهو قادر على تصوير الخلايا الحية 15. في حين أن أفضل دقة ممكنة تقدم بطاقة SIM (~ 120 نانومتر) منخفضة مقارنة بالعديد من تقنيات الدقة الفائقة الأخرى ، إلا أنها كافية للعديد من التطبيقات (على سبيل المثال ، لحل مكونات MPS في الخلايا العصبية). وبالتالي ، من الأهمية بمكان النظر في متطلبات تطبيقات محددة لتحديد ما إذا كانت بطاقة SIM خيارا مناسبا أو إذا كانت الدقة الأعلى ضرورية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاستخدام الخلايا العصبية الحصينية المستزرعة ومجهر الإضاءة ثلاثي الأبعاد (3D-SIM) لفحص موضع وتنظيم بروتينات AIS المفترضة بالنسبة لحلقات الأكتين في MPS ، كما هو مطبق في Abouelezz et al.16

Protocol

تم حصاد الخلايا العصبية الأولية للحصين المستخدمة في هذه التجارب16 من اليوم الجنيني 17 أجنة الفئران Wistar من أي من الجنسين بموجب المبادئ التوجيهية الأخلاقية لجامعة هلسنكي والقانون الفنلندي.

1. إعداد العينات

  1. على الأغطية الزجاجية عالية الدقة ، اسمح للخلايا العصبية الحصين الفئران بالنمو في ظروف زراعة متفرقة (~ 5000-10000 خلية / سم 2) لمدة 14 يوما (14 يوما في المختبر).
    ملاحظة: استخدام الثقافات المتناثرة يقلل من فرص تداخل الخلايا العصبية ، مما يساعد على تحديد MPS.
  2. إصلاح الخلايا العصبية باستخدام 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الغطاء مرة واحدة في 0.2٪ BSA في PBS (BSA-PBS) ، ثم احتضنه لمدة 10 دقائق في محلول 1٪ من Triton-X في PBS في درجة حرارة الغرفة. يغسل مرة واحدة في BSA-PBS.
  3. تمييع الأجسام المضادة المضادة ل ankyrin G (1:200) في BSA-PBS. أضف محلول الأجسام المضادة إلى الغطاء واحتضنه بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. اختياريا ، أضف الأجسام المضادة المضادة ل MAP2 للدجاج (انظر جدول المواد) إلى محلول الأجسام المضادة لترسيم المجال الجسدي الشجيري.
  4. اغسل الخلايا مرة واحدة في BSA-PBS ، تليها 0.1٪ Triton-X في PBS ، ثم قم بالغسيل النهائي في BSA-PBS.
  5. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر الموسومة بالفلوروفور (1:200) (انظر جدول المواد) في BSA-PBS ، وإضافتها إلى الغطاء ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا مرة واحدة في BSA-PBS ، مرة واحدة في 0.1٪ Triton-X في PBS ، ثم مرة واحدة في PBS.
  6. قم بإعداد محلول 1 ميكرومتر من phalloidin الموسوم في PBS (انظر جدول المواد) وأضفه إلى الخلايا. حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا مرة واحدة في PBS ، مرة واحدة في 0.1٪ Triton-X في PBS ، ثم مرة واحدة في PBS.
    ملاحظة: تم استخدام الفيلويدين الموسومة AlexaFluor488 هنا ، ولكن العلامات الأخرى ستعمل أيضا.
  7. لتركيب الغطاء على شريحة زجاجية ، ضع قطرة من وسائط التركيب على شريحة زجاجية ، واغمس الغطاء في الماء منزوع الأيونات ، وربت باستخدام منشفة ورقية ناعمة (لإزالة الماء الزائد).
    1. ضع الغطاء على الشريحة الزجاجية. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: لم تلاحظ أي آثار ضارة على العينة باستخدام وسائط تركيب صلبة (معامل الانكسار 1.47 بعد المعالجة).

2. التصوير

  1. إذا كان ذلك ممكنا، استشر موظفي مرفق الفحص المجهري قبل التصوير. استخدم حاسبة زيت الغمر (انظر جدول المواد) لتحديد زيت الغمر المناسب للعينة.
  2. بمجرد أن تصبح العينات جاهزة ، تأكد من أن أغطية الغطاء نظيفة وخالية من أي بقايا أو وسائط تركيب زائدة. إذا لزم الأمر ، استخدم طرف قطني مغموس في الماء أو الإيثانول للتنظيف. ضع العينة في مجهر قادر على 3D SIM (انظر جدول المواد) وابحث عن خلية لتصويرها.
  3. اضبط قوة خطوط الليزر ذات الصلة وأوقات التعرض لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى أقصى حد دون تبييض العينة بشكل كبير.
    ملاحظة: ستظهر نسبة الإشارة إلى الضوضاء الجيدة مظهرا واضحا يشبه الشبكة يركز على العينة ويؤدي إلى عمليات إعادة بناء دقيقة عالية الدقة. تم استخدام خطوط ليزر 488 نانومتر و 640 نانومتر لتصور F-actin و ankyrin G ، على التوالي.
  4. اضبط الحدود العليا والدنيا للعينة في البعد z وتابع للحصول على مكدس.
    ملاحظة: تم استخدام حجم الخطوة z البالغ 125 نانومتر هنا.
  5. لإعادة بناء بطاقة SIM بنجاح، تأكد من أن برنامج الفحص المجهري (انظر جدول المواد) يحتوي على ملف نقل بصري (OTF) مناسب للأصباغ المستخدمة.
    ملاحظة: عادة ما يتم إنشاؤها وصيانتها من قبل موظفين متخصصين. وفي غياب إطار عمل تشغيلي، تتوفر أيضا أدوات مفتوحة المصدر لإجراء عمليات إعادة الإعمار استنادا إلى التقديرات17. في هذا العمل ، تم استخدام ملفات OTF المحدثة التي يسيطر عليها موظفون متخصصون.
  6. قم بتشغيل خوارزمية إعادة الإعمار على المكدس للحصول على إعادة بناء فائقة الحل. تحقق من عمليات إعادة الإعمار بحثا عن القطع الأثرية المعروفة ، وإذا لزم الأمر ، اضبط المعلمات لتصحيحها.
    ملاحظة: عادة ما تعطي معلمات الخوارزمية الافتراضية نتائج دقيقة. تتضمن العديد من هذه القطع الأثرية بعض الأنماط المتكررة: خطوط مخططة إلى جانب اتجاهات متعددة على مستوى z واحد ، أو "ظلال" (ميزات متكررة تظهر في مستويات z مختلفة) ، أو نمط "قرص العسل" سداسي يظهر في بعض المناطق. غالبا ما يمكن إصلاح هذه القطع الأثرية من خلال إعداد عينة أفضل ، أو نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل ، أو ضبط معلمات خوارزمية إعادة الإعمار ، أو ضمان أن يكون معامل الانكسار لزيت الغمر المختار مناسبا لوسط التركيب والعينة. للحصول على مناقشة أكثر تفصيلا لقطع SIM وأداة متاحة مجانا للتحقق من وجود القطع الأثرية ، راجع Ball et al. 18
  7. قارن إعادة بناء بطاقة SIM بصورة واسعة المجال لمراقبة التحسينات في الدقة.
  8. عند إجراء بطاقة SIM متعددة الألوان، استخدم خوارزمية المحاذاة لمحاذاة القنوات المختلفة بشكل صحيح بمجرد أن تصبح عملية إعادة الإعمار المرضية جاهزة.
    ملاحظة: تستخدم خوارزمية المحاذاة ملفا مرجعيا للمحاذاة تم إنشاؤه باستخدام إعداد حبة ميكروسفير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمجهر.

3. تحليل الصور

  1. حلقات الأكتين في MPS لها مظهر دوري مميز. باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد)، قم بإنشاء صورة إسقاط بأقصى كثافة باستخدام جميع المستويات البؤرية حيث تكون حلقات الأكتين مرئية.
  2. في صورة الإسقاط ذات الكثافة القصوى ، ارسم خطا عموديا عبر الحلقات المجاورة المرئية وسجل شدة التألق جنبا إلى جنب مع وظيفة "ملف تعريف المخطط" الخاصة بالبرنامج.
  3. لحساب متوسط المسافة بين الذروة، لاحظ الحد الأقصى المحلي في ملف تعريف الخط وقم بقياس المسافة بين قمم كثافة الفلورسنت الفردية المجاورة.
    ملاحظة: يمكن حساب ذلك بسهولة، على سبيل المثال، باستخدام وظيفة "findpeaks" في MATLAB أو منصة جنو أوكتاف (مفتوحة المصدر).
  4. لتقييم التوطين المشترك للبروتينات المختلفة مع حلقات الأكتين في MPS ، قم بإجراء تحليل التوطين المشترك 19،20،21 على إعادة بناء SIM للأكتين والبروتين المرشح. ارسم يدويا اختيارا لتعريف AIS كمنطقة ذات أهمية للمكون الإضافي EzColocalization في النظام الأساسي للبرمجيات19 وقم بإجراء التحليل لحساب معامل ارتباط بيرسون (PCC) للتوطين المشترك19،20،21. تشير قيمة PCC القريبة من 1 إلى توطين مشترك قوي.
    ملاحظة: يرد ملخص لهذا البروتوكول في الشكل 1.

النتائج

باستخدام الخلايا العصبية الحصين الفئران المستزرعة و 3D-SIM ، يتم وصف بروتوكول لتصور وقياس حلقات الأكتين والمكونات الأخرى ل MPS في AIS. أظهرت عمليات إعادة بناء مكدسات الصور دورية واضحة لحلقات الأكتين (الشكل 2 أ). في أيدينا ، كان متوسط المسافة بين الذروة لحلقات الأكتين في MPS ، التي ?...

Discussion

يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة لتصور وقياس بروتينات MPS باستخدام تقنية الدقة الفائقة. نظرا لأن حلقات الأكتين ومكونات MPS الأخرى تعرض دورية تبلغ ~ 190 نانومتر 9,10 ، فإن أساليب التصوير التقليدية المحدودة الحيود لا يمكنها الكشف عن تفاصيل MPS. قد تعمل العديد من إعدا...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم الاعتراف بالدكتورة بيرتا هوتولينن لتعليقاتها النقدية ، التي لا تقدر بثمن لإعداد هذه المخطوطة. تم الاعتراف بالدكتورة ريمانتي مينكيفيتشيين لمساعدتها في إعداد الثقافات العصبية المستخدمة في التجارب الأصلية. تم إجراء جميع عمليات التصوير في وحدة التصوير Biomedicum. تم دعم هذا العمل من قبل أكاديمية فنلندا (D.M. ، SA 266351) وبرنامج الدكتوراه Brain & Mind (A.A.)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesCorning3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa-647 anti-mouseThermoFisherA31571
Anti-Ankyrin G antibodyUC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/3675-146
Anti-MAP2 antibodyMerck MilliporeAB5543
B-27Invitrogen17504044
Bovine Serum Albumin (BSA)BioWestP6154
Deltavision OMX SRGE Healthcare Life SciencesN/A
Fiji software packageImageJ
GNU OctaveGNU
High performance coverslipsMarienfeld117530
Immersion Oil CalculatorCytiva Life Scienceshttps://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-GlutamineVWRICNA1680149
MATLAB R2020aMathworks
Neurobasal mediaInvitrogen21103049
OMX SRDelta Vision OMX
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProLong Gold mounting mediaInvitrogenP10144
softWoRx DeconvolutionCytiva Life Sciences
Superfrost SlidesEprediaISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µmThermoFisherT7279
Triton-XSigmaX100

References

  1. Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
  2. Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
  3. Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
  4. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
  5. Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
  6. Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
  7. Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
  8. Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
  9. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
  10. Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
  11. Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
  12. Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
  13. Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
  15. Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
  16. Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
  17. Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
  18. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  19. Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
  20. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  21. Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
  22. Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved