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Method Article
O presente protocolo descreve um método para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial do axônio usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM).
O segmento inicial de axônio (AIS) é o local no qual os potenciais de ação iniciam e constituem um filtro de transporte e barreira de difusão que contribuem para a manutenção da polaridade neuronal através da triagem da carga somato-dendrítica. Um esqueleto periódico de membrana (MPS) composto por anéis periódicos de actina fornece um andaime para ancorar várias proteínas AIS, incluindo proteínas estruturais e diferentes canais de íons. Embora as recentes abordagens proteômicas tenham identificado um número considerável de novos componentes AIS, faltam detalhes da estrutura do MPS e dos papéis de seus componentes individuais. A distância entre anéis de actin individuais no MPS (~190 nm) requer a contratação de técnicas de microscopia de super resolução para resolver os detalhes estruturais do MPS. Este protocolo descreve um método para o uso de neurônios hipocampais de ratos cultivados para examinar a localização precisa de uma proteína AIS no MPS em relação aos anéis de actina sub-membranous usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM). Além disso, também é descrita uma abordagem analítica para avaliar quantitivamente a periodicidade dos componentes individuais e sua posição em relação aos anéis de actina.
O segmento inicial de axônio (AIS) é uma região curta e exclusivamente especializada do axônio proximal de neurônios vertebrados1. A AIS compreende um filtro de transporte e uma barreira de difusão essencial na manutenção da polaridade neuronal, classificando a carga somato-dendrítica2,3,4,5,6,7. Além disso, a estrutura única da AIS permite acomodar clusters de canais de íons fechados de tensão que facilitam sua função como local de iniciação potencial de ação8. Um complexo estrutural altamente estável está por trás das funções únicas da AIS. Pesquisas na última década revelaram a presença de um esqueleto periódico de membrana (MPS) contendo anéis de actina conectados por espectro e fornecendo um andaime para ancorar várias proteínas AIS9,10.
A distância entre os anéis de actin no MPS (~190 nm)9,10 está sob o limite de resolução da microscopia de luz convencional. As primeiras tentativas de utilização de microscopia eletrônica para visualizar o MPS não foram bem sucedidas, pois os severos procedimentos de preparação envolvidos não conseguiram preservar a estrutura do MPS. Assim, as técnicas de microscopia de super resolução têm se mostrado inestimáveis na elucidação de alguns detalhes estruturais do MPS11. No entanto, o entendimento do complexo estrutural da AIS, a identidade e as funções de seus componentes e sua regulação espostetemporal ainda estão incompletos. Estudos proteômicos recentes conseguiram criar uma lista considerável de proteínas que se localizam na AIS perto de componentes estruturais do AIS12,13. Ainda assim, faltam detalhes de sua função e lugar preciso no complexo AIS. Assim, as técnicas de microscopia de superrespeso servem como uma ferramenta essencial para examinar as posições precisas dessas proteínas em relação a outros componentes de MPS e investigar suas funções. Várias técnicas de microscopia leve podem alcançar resoluções superiores ao limite de difração de luz, algumas até capazes de localização de moléculas únicas. No entanto, muitas dessas técnicas normalmente requerem fluoroforos especializados ou tampões de imagem, e a aquisição de imagens é frequentemente intensiva em tempo14.
Microscopia de iluminação estruturada 3D (3D-SIM), devido à sua facilidade de uso e requisitos simples de preparação de amostras, não requer reagentes especiais para a preparação de imagens ou amostras, funciona bem com uma ampla gama de fluoroforos e amostras, pode ser facilmente implementado em múltiplas cores, e é capaz de imagens de células vivas15. Embora a melhor resolução possível que o SIM oferece (~120 nm) seja baixa em comparação com muitas outras técnicas de super-resolução, é suficiente para muitas aplicações (por exemplo, para resolver os componentes do MPS em neurônios). Assim, é fundamental considerar a exigência de aplicações específicas para determinar se o SIM é uma escolha adequada ou se uma resolução ainda maior é necessária. Aqui, um protocolo é descrito para o uso de neurônios hipocampais cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM) para examinar a posição e organização de proteínas AIS putativas relativas aos anéis de actina no MPS, conforme implementado em Abouelezz et al.16
Os neurônios hipocampais primários usados nesses experimentos foram colhidos16 a partir do dia 17 embriões de ratos Wistar de ambos os sexos sob as diretrizes éticas da Universidade de Helsinque e da lei finlandesa.
1. Preparação da amostra
2. Imagem
3. Análise de imagem
Usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e 3D-SIM, um protocolo é descrito para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do MPS na AIS. Reconstruções de pilhas de imagens mostraram clara periodicidade dos anéis actin (Figura 2A). Em nossas mãos, a média de distância entre picos de anéis actin no MPS, visualizado usando alexa 488-tagged phalloidin, foi de 190,36 ± 1,7 nm (média ± SEM). Isso está em linha com a distância média relatada anteriormente de ~1...
O protocolo descrito aqui fornece um método para visualizar e medir proteínas MPS usando a técnica de super-resolução. Como os anéis de actin e outros componentes MPS exibem uma periodicidade de ~190 nm9,10, abordagens de imagem convencionais limitadas à difração não podem revelar os detalhes do MPS. Várias configurações de microscopia podem resolver estruturas limitadas à difração em super resolução, e o SIM representa uma opção robusta e des...
Os autores não têm nada a revelar.
Pirta Hotulainen é reconhecida por seus comentários críticos, inestimáveis para a preparação deste manuscrito. Dr. Rimante Minkeviciene é reconhecida por sua ajuda na preparação das culturas neuronais usadas para os experimentos originais. Todas as imagens foram realizadas na Unidade de Imagem do Biomedicum. Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (D.M., SA 266351) e pelo Programa de Doutorado Brain & Mind (A.A.)
Name | Company | Catalog Number | Comments |
24-well plates | Corning | 3524 | |
4% Paraformaldehyde | |||
Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
Fiji software package | ImageJ | ||
GNU Octave | GNU | ||
High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
MATLAB R2020a | Mathworks | ||
Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
OMX SR | Delta Vision OMX | ||
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
Triton-X | Sigma | X100 |
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