Method Article
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).
Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist der Ort, an dem Aktionspotentiale ausgehen und bildet einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die zur Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität beitragen, indem sie somato-dendritische Fracht sortieren. Ein periodisches Membranskelett (MPS), das aus periodischen Aktinringen besteht, bietet ein Gerüst zur Verankerung verschiedener AIS-Proteine, einschließlich Strukturproteinen und verschiedener Ionenkanäle. Obwohl neuere proteomische Ansätze eine beträchtliche Anzahl neuartiger AIS-Komponenten identifiziert haben, fehlen Details über die Struktur des MPS und die Rollen seiner einzelnen Komponenten. Der Abstand zwischen einzelnen Aktinringen im MPS (~ 190 nm) erfordert den Einsatz von hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die strukturellen Details des MPS aufzulösen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung kultivierter Hippocampus-Neuronen von Ratten, um die genaue Lokalisation eines AIS-Proteins im MPS relativ zu submembranösen Aktinringen mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) zu untersuchen. Darüber hinaus wird ein analytischer Ansatz beschrieben, um die Periodizität einzelner Komponenten und ihre Position relativ zu Aktinringen quantitativ zu beurteilen.
Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist eine kurze, einzigartig spezialisierte Region des proximalen Axons von Wirbeltierneuronen1. Das AIS umfasst einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die für die Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität durch Sortierung somato-dendritischer Fracht2,3,4,5,6,7 unerlässlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die einzigartige Struktur des AIS, Cluster von spannungsgesteuerten Ionenkanälen unterzubringen, die sei....
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Primäre Hippocampus-Neuronen, die in diesen Experimenten verwendet wurden16, wurden ab dem Embryonaltag 17 Wistar-Rattenembryonen beiderlei Geschlechts gemäß den ethischen Richtlinien der Universität Helsinki und dem finnischen Recht geerntet.
1. Probenvorbereitung
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Unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-SIM wird ein Protokoll beschrieben, um Aktinringe und andere Komponenten des MPS im AIS zu visualisieren und zu messen. Rekonstruktionen von Bildstapeln zeigten eine deutliche Periodizität von Aktinringen (Abbildung 2A). In unseren Händen betrug die mittlere Zwischenspitzendistanz der Aktinringe im MPS, visualisiert mit Alexa 488-markiertem Phalloidin, 190,36 ± 1,7 nm (Mittelwert ± SEM). Dies steht im Einklang mit dem z.......
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Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung und Messung von MPS-Proteinen mit der Super-Resolution-Technik. Da Aktinringe und andere MPS-Komponenten eine Periodizität von ~190 nm9,10 aufweisen, können herkömmliche beugungsbegrenzte Bildgebungsansätze die Details des MPS nicht offenbaren. Mehrere Mikroskopie-Setups können beugungsbegrenzte Strukturen in Superauflösung auflösen, und SIM stellt eine robuste und unkomplizierte Option.......
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Dr. Pirta Hotulainen wird für ihre kritischen Kommentare gewürdigt, die für die Vorbereitung dieses Manuskripts von unschätzbarem Wert sind. Dr. Rimante Minkeviciene ist für ihre Hilfe bei der Vorbereitung der neuronalen Kulturen bekannt, die für die ursprünglichen Experimente verwendet wurden. Die gesamte Bildgebung wurde in der Biomedicum Imaging Unit durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Akademie von Finnland (D.M., SA 266351) und dem Doktorandenprogramm Brain & Mind (A.A.) unterstützt.
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| 24-well plates | Corning | 3524 | |
| 4% Paraformaldehyde | |||
| Alexa-488 Phalloidin | ThermoFisher | A12379 | |
| Alexa-647 anti-mouse | ThermoFisher | A31571 | |
| Anti-Ankyrin G antibody | UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36 | 75-146 | |
| Anti-MAP2 antibody | Merck Millipore | AB5543 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | BioWest | P6154 | |
| Deltavision OMX SR | GE Healthcare Life Sciences | N/A | |
| Fiji software package | ImageJ | ||
| GNU Octave | GNU | ||
| High performance coverslips | Marienfeld | 117530 | |
| Immersion Oil Calculator | Cytiva Life Sciences | https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator | |
| L-Glutamine | VWR | ICNA1680149 | |
| MATLAB R2020a | Mathworks | ||
| Neurobasal media | Invitrogen | 21103049 | |
| OMX SR | Delta Vision OMX | ||
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ProLong Gold mounting media | Invitrogen | P10144 | |
| softWoRx Deconvolution | Cytiva Life Sciences | ||
| Superfrost Slides | Epredia | ISO 8037/1 | |
| TetraSpeck microspheres 0.1 µm | ThermoFisher | T7279 | |
| Triton-X | Sigma | X100 |
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