Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).

Zusammenfassung

Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist der Ort, an dem Aktionspotentiale ausgehen und bildet einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die zur Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität beitragen, indem sie somato-dendritische Fracht sortieren. Ein periodisches Membranskelett (MPS), das aus periodischen Aktinringen besteht, bietet ein Gerüst zur Verankerung verschiedener AIS-Proteine, einschließlich Strukturproteinen und verschiedener Ionenkanäle. Obwohl neuere proteomische Ansätze eine beträchtliche Anzahl neuartiger AIS-Komponenten identifiziert haben, fehlen Details über die Struktur des MPS und die Rollen seiner einzelnen Komponenten. Der Abstand zwischen einzelnen Aktinringen im MPS (~ 190 nm) erfordert den Einsatz von hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die strukturellen Details des MPS aufzulösen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Verwendung kultivierter Hippocampus-Neuronen von Ratten, um die genaue Lokalisation eines AIS-Proteins im MPS relativ zu submembranösen Aktinringen mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM) zu untersuchen. Darüber hinaus wird ein analytischer Ansatz beschrieben, um die Periodizität einzelner Komponenten und ihre Position relativ zu Aktinringen quantitativ zu beurteilen.

Einleitung

Das Axon-Anfangssegment (AIS) ist eine kurze, einzigartig spezialisierte Region des proximalen Axons von Wirbeltierneuronen1^. Das AIS umfasst einen Transportfilter und eine Diffusionsbarriere, die für die Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität durch Sortierung somato-dendritischer ^{Fracht2,3,4,5,6,7} unerlässlich sind. Darüber hinaus ermöglicht die einzigartige Struktur des AIS, Cluster von spannungsgesteuerten Ionenkanälen unterzubringen, die sei....

Protokoll

Primäre Hippocampus-Neuronen, die in diesen Experimenten verwendet ^wurden16, wurden ab dem Embryonaltag 17 Wistar-Rattenembryonen beiderlei Geschlechts gemäß den ethischen Richtlinien der Universität Helsinki und dem finnischen Recht geerntet.

1. Probenvorbereitung

1. Lassen Sie auf High-Fidelity-Glasdeckgläsern die Hippocampus-Neuronen der Ratte 14 Tage lang (14 Tage in vitro) unter spärlichen Kulturbedingungen (~ 5.000-10.000 Zellen / ^cm2) wachsen.
   HINWEIS: Die Verwendung von spärlichen Kulturen reduziert die Wahrscheinlichkeit von überlappenden Neuriten, was zur Quantifizierun....

Ergebnisse

Unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-SIM wird ein Protokoll beschrieben, um Aktinringe und andere Komponenten des MPS im AIS zu visualisieren und zu messen. Rekonstruktionen von Bildstapeln zeigten eine deutliche Periodizität von Aktinringen (Abbildung 2A). In unseren Händen betrug die mittlere Zwischenspitzendistanz der Aktinringe im MPS, visualisiert mit Alexa 488-markiertem Phalloidin, 190,36 ± 1,7 nm (Mittelwert ± SEM). Dies steht im Einklang mit dem z.......

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung und Messung von MPS-Proteinen mit der Super-Resolution-Technik. Da Aktinringe und andere MPS-Komponenten eine Periodizität von ~190 nm9,10 aufweisen^, können herkömmliche beugungsbegrenzte Bildgebungsansätze die Details des MPS nicht offenbaren. Mehrere Mikroskopie-Setups können beugungsbegrenzte Strukturen in Superauflösung auflösen, und SIM stellt eine robuste und unkomplizierte Option.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning	3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 Phalloidin	ThermoFisher	A12379
Alexa-647 anti-mouse	ThermoFisher	A31571
Anti-Ankyrin G antibody	UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36	75-146
Anti-MAP2 antibody	Merck Millipore	AB5543
B-27	Invitrogen	17504044
Bovine Serum Albumin (BSA)	BioWest	P6154
Deltavision OMX SR	GE Healthcare Life Sciences	N/A
Fiji software package	ImageJ
GNU Octave	GNU
High performance coverslips	Marienfeld	117530
Immersion Oil Calculator	Cytiva Life Sciences		https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-Glutamine	VWR	ICNA1680149
MATLAB R2020a	Mathworks
Neurobasal media	Invitrogen	21103049
OMX SR	Delta Vision OMX
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ProLong Gold mounting media	Invitrogen	P10144
softWoRx Deconvolution	Cytiva Life Sciences
Superfrost Slides	Epredia	ISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µm	ThermoFisher	T7279
Triton-X	Sigma	X100