Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kültürlü sıçan hipokampal nöronları ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanarak aktin halkalarını ve akson başlangıç segmentinin membran periyodik iskeletinin diğer bileşenlerini görselleştirmek ve ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Özet

Akson başlangıç segmenti (AIS), aksiyon potansiyellerinin başladığı ve somato-dendritik kargoyu ayırarak nöronal polaritenin korunmasına katkıda bulunan bir taşıma filtresi ve difüzyon bariyeri oluşturduğu yerdir. Periyodik aktin halkalarından oluşan bir membran periyodik iskeleti (MPS), yapısal proteinler ve farklı iyon kanalları da dahil olmak üzere çeşitli AIS proteinlerinin sabitlenmesi için bir iskele sağlar. Son proteomik yaklaşımlar önemli sayıda yeni AIS bileşeni tanımlamış olsa da, MPS'nin yapısına ve bireysel bileşenlerinin rollerine ilişkin ayrıntılar eksiktir. MPS'deki (~190 nm) münferit aktin halkaları arasındaki mesafe, MPS'nin yapısal ayrıntılarını çözmek için süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin kullanılmasını gerektirmektedir. Bu protokol, 3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) kullanılarak MPS'deki bir AIS proteininin submembranöz aktin halkalarına göre hassas lokalizasyonunu incelemek için kültürlenmiş sıçan hipokampal nöronlarının kullanılmasına yönelik bir yöntemi açıklamaktadır. Ek olarak, bireysel bileşenlerin periyodikliğini ve aktin halkalarına göre konumlarını nicel olarak değerlendirmek için analitik bir yaklaşım da açıklanmaktadır.

Giriş

Akson başlangıç segmenti (AIS), omurgalı nöronlarının proksimal aksonunun kısa, benzersiz bir şekilde uzmanlaşmış bir bölgesidir1. AIS, somato-dendritik kargoyu sıralayarak nöronal polariteyi korumak için gerekli olan bir taşıma filtresi ve difüzyon bariyerini içerir2,3,4,5,6,7. Ek olarak, AIS'nin benzersiz yapısı, aksiyon potansiyeli başlatma yeri olarak işlevini kolaylaştıran voltaj kapılı iyon kanalları kümelerini barındırmasına izin verir8. AIS'nin benzersiz işlevlerinin altında son derece kararlı bir yapısal kompleks yatmaktadır. Son on yılda yapılan araştırmalar, spektrin ile bağlanmış aktin halkaları içeren ve çeşitli AIS proteinlerini sabitlemek için bir iskele sağlayan bir membran periyodik iskeletinin (MPS) varlığını ortaya koymuştur9,10.

MPS (~190 nm)9,10'daki aktin halkaları arasındaki mesafe, geleneksel ışık mikroskobunun çözünürlük sınırının altındadır. MPS'yi görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanmaya yönelik ilk girişimler, söz konusu sert hazırlık prosedürleri MPS'nin yapısını koruyamadığından başarılı olamamıştır. Bu nedenle, süper çözünürlüklü mikroskopi tekniklerinin, MPS11'in bazı yapısal ayrıntılarını aydınlatmada paha biçilmez olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, AIS yapısal kompleksinin anlaşılması, bileşenlerinin kimliği ve işlevleri ve mekansal zamansal düzenlemesi hala tamamlanmamıştır. Son proteomik çalışmalar, AIS12,13'ün yapısal bileşenlerine yakın AIS'ye lokalize olan proteinlerin büyük bir listesini oluşturmayı başardı. Yine de, işlevlerinin ayrıntıları ve AIS kompleksindeki kesin yerleri eksiktir. Bu nedenle, süper çözünürlüklü mikroskopi teknikleri, bu proteinlerin diğer MPS bileşenlerine göre doğru konumlarını incelemek ve işlevlerini araştırmak için gerekli bir araç görevi görür. Birkaç ışık mikroskobu tekniği, ışığın kırınım sınırından daha yüksek çözünürlükler elde edebilir, hatta bazıları tek molekülleri lokalize edebilir. Bununla birlikte, bu tekniklerin çoğu tipik olarak özel floroforlar veya görüntüleme tamponları gerektirir ve görüntü elde etmek genellikle zaman alıcıdır14.

3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), kullanım kolaylığı ve basit numune hazırlama gereksinimleri nedeniyle, görüntüleme veya numune hazırlama için özel bir reaktif gerektirmez, çok çeşitli floroforlar ve numunelerle iyi çalışır, birden fazla renkte kolayca uygulanabilir ve canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahiptir15. Mümkün olan en iyi çözünürlüklü SIM teklifleri (~120 nm) diğer birçok süper çözünürlüklü tekniğe kıyasla düşük olsa da, birçok uygulama için yeterlidir (örneğin, MPS'nin nöronlardaki bileşenlerini çözmek için). Bu nedenle, SIM'in uygun bir seçim olup olmadığını veya daha yüksek bir çözünürlüğün gerekli olup olmadığını belirlemek için belirli uygulamaların gerekliliğini göz önünde bulundurmak çok önemlidir. Burada, Abouelezz ve ark.16'da uygulandığı gibi, MPS'deki aktin halkalarına göre varsayılan AIS proteinlerinin konumunu ve organizasyonunu incelemek için kültürlenmiş hipokampal nöronların ve 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobunun (3D-SIM) kullanılmasına yönelik bir protokol açıklanmaktadır.16

Protokol

Bu deneylerde kullanılan birincil hipokampal nöronlar, Helsinki Üniversitesi ve Finlandiya yasalarının etik kuralları uyarınca her iki cinsiyetten embriyonik gün 17 Wistar sıçan embriyolarından 16 toplandı.

1. Numune hazırlama

  1. Yüksek doğruluklu cam kapaklarda, sıçan hipokampal nöronlarının seyrek kültür koşullarında (~ 5.000-10.000 hücre / cm2) 14 gün boyunca (14 gün in vitro) büyümesine izin verin.
    NOT: Seyrek kültürlerin kullanılması, örtüşen nöritlerin olasılığını azaltarak MPS'nin nicelleştirilmesine yardımcı olur.
  2. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca% 4 paraformaldehit kullanarak nöronları sabitleyin. Kapak kapağını PBS'DE (BSA-PBS) %0,2 BSA'da bir kez yıkayın, ardından oda sıcaklığında PBS'de %1'lik bir Triton-X çözeltisinde 10 dakika boyunca inkübe edin. BSA-PBS'de bir kez yıkayın.
  3. BSA-PBS'de anti-ankirin G antikorlarını (1:200) seyreltin. Kapak kaymasına antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. İsteğe bağlı olarak, somato-dendritik alanı ayırmak için antikor çözeltisine tavuk anti-MAP2 antikorları ekleyin (bkz.
  4. BSA-PBS'de hücreleri bir kez, ardından PBS'de% 0.1 Triton-X ile yıkayın, ardından BSA-PBS'de son bir yıkama yapın.
  5. BSA-PBS'de florofor etiketli fare karşıtı ikincil antikorları (1:200) (bkz. Malzeme Tablosu) seyreltin, kapak kapağına ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Hücreleri BSA-PBS'de bir kez, PBS'de% 0.1 Triton-X'te bir kez, sonra PBS'de bir kez yıkayın.
  6. PBS'de 1 μM etiketli falloidin çözeltisi hazırlayın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve hücrelere ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Hücreleri PBS'de bir kez, PBS'de% 0.1 Triton-X'te bir kez, daha sonra PBS'de bir kez yıkayın.
    NOT: AlexaFluor488 etiketli falloidin burada kullanılmıştır, ancak diğer etiketler de çalışacaktır.
  7. Kapak kaymasını bir cam slayta monte etmek için, bir cam slayta bir damla montaj ortamı uygulayın, kapak kaymasını deiyonize suya batırın ve yumuşak bir kağıt havlu kullanarak (fazla suyu gidermek için) dablayın.
    1. Kapak fişini cam kızağın üzerine yerleştirin. 24 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
      NOT: Sert ayarlı montaj ortamı kullanılarak numune üzerinde herhangi bir olumsuz etki gözlenmemiştir (kürlemeden sonra kırılma indisi 1.47).

2. Görüntüleme

  1. Mümkünse, görüntülemeden önce mikroskopi tesisinin personeline danışın. Numuneye uygun daldırma yağını seçmek için bir daldırma yağı hesaplayıcısı kullanın (bkz.
  2. Numuneler hazır olduğunda, kapak kapaklarının temiz olduğundan ve herhangi bir kalıntı veya fazla montaj ortamından arındırıldığından emin olun. Gerekirse, temizlemek için suya veya etanol'e batırılmış bir pamuk ucu kullanın. Numuneyi 3B SIM özellikli bir mikroskopa yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve görüntülenecek bir hücre bulun.
  3. Numuneyi önemli ölçüde ağartmadan sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için ilgili lazer çizgilerinin gücünü ve maruz kalma sürelerini ayarlayın.
    NOT: İyi bir sinyal-gürültü oranı, numuneye odaklanmış net bir ızgara benzeri görünüm gösterecek ve doğru yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonlara yol açacaktır. F-aktin ve ankirin G'yi görselleştirmek için sırasıyla 488 nm ve 640 nm lazer çizgileri kullanıldı.
  4. Numunenin üst ve alt sınırlarını z boyutunda ayarlayın ve bir yığın elde etmeye devam edin.
    NOT: Burada 125 nm z-adım boyutu kullanılmıştır.
  5. Başarılı bir SIM yeniden yapılandırması için, mikroskopi yazılımının ( bkz. Malzeme Tablosu) kullanılan boyalar için uygun bir optik aktarım dosyasına (OTF) sahip olduğundan emin olun.
    NOT: Bunlar genellikle uzman personel tarafından oluşturulur ve sürdürülür. İşlevsel bir OTF'nin yokluğunda, tahminlere dayalı rekonstrüksiyonlar gerçekleştirmek için açık kaynaklı araçlar da mevcuttur17. Bu çalışmada uzman personel tarafından kontrol edilen güncel OTF dosyaları kullanılmıştır.
  6. Süper çözümlenmiş bir yeniden yapılandırma elde etmek için yığın üzerinde yeniden yapılandırma algoritmasını çalıştırın. Bilinen yapılar için rekonstrüksiyonları kontrol edin ve gerekirse bunları düzeltmek için parametreleri ayarlayın.
    NOT: Varsayılan algoritma parametreleri genellikle doğru sonuçlar verir. Bu eserlerin birçoğu bazı tekrarlanan desenleri içerir: bir z-düzleminde birden fazla yönle birlikte çizgili çizgiler, 'gölgelenme' (çeşitli z-düzlemlerinde ortaya çıkan tekrarlanan özellikler) veya bazı bölgelerde ortaya çıkan altıgen bir 'petek' deseni. Bu eserler genellikle daha iyi numune hazırlama, daha iyi bir sinyal-gürültü oranı, rekonstrüksiyon algoritmasının parametrelerinin ayarlanması veya seçilen daldırma yağının kırılma indisinin montaj ortamı ve numune için uygun olmasını sağlayarak sabitlenebilir. SIM yapıtları hakkında daha ayrıntılı bir tartışma ve yapıtların varlığını kontrol etmek için serbestçe kullanılabilen bir araç için bkz: Ball et al. 18 adet
  7. Çözünürlükteki gelişmeleri gözlemlemek için SIM yeniden yapılandırmasını geniş alan görüntüsüyle karşılaştırın.
  8. Çok renkli SIM gerçekleştirirken, tatmin edici bir yeniden yapılandırma hazır olduğunda farklı kanalları doğru şekilde hizalamak için hizalama algoritmasını kullanın.
    NOT: Hizalama algoritması, mikroskop üreticisinin talimatına göre bir mikrosfer boncuk hazırlığı kullanılarak oluşturulan bir hizalama referans dosyası kullanır.

3. Görüntü analizi

  1. MPS'deki aktin halkaları ayırt edici bir periyodik görünüme sahiptir. Görüntü analiz yazılımını kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu), aktin halkalarının görünür olduğu tüm odak düzlemlerini kullanarak maksimum yoğunlukta bir projeksiyon görüntüsü oluşturun.
  2. Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüsünde, görünür bitişik halkalar boyunca dik bir çizgi çizin ve yazılımın çizgi 'Grafiği Profili' işleviyle birlikte floresan yoğunluğunu kaydedin.
  3. Ortalama zirveler arası mesafeyi hesaplamak için, çizgi profilindeki yerel maksimumu not edin ve bireysel bitişik floresan yoğunluğu zirveleri arasındaki mesafeyi ölçün.
    NOT: Bu, örneğin, MATLAB'daki 'findpeaks' işlevi veya (açık kaynaklı) GNU Octave platformu kullanılarak kolayca hesaplanabilir.
  4. MPS'deki aktin halkaları ile farklı proteinlerin kolokalizasyonunu değerlendirmek için, aktin ve aday proteinin SIM rekonstrüksiyonları hakkında bir kolokalizasyon analiz prosedürü19,20,21 çalıştırın. AIS'yi yazılım platformundaki EzColocalization eklentisinin ilgi alanı olarak tanımlamak için manuel olarak bir seçim yapın19 ve Pearson'ın ortak yerelleştirmenin korelasyon katsayısını (PCC) hesaplamak için analizi çalıştırın19,20,21. 1'e yakın bir PCC değeri güçlü kolokalizasyonu gösterir.
    NOT: Bu protokol Şekil 1'de özetlenmiştir.

Sonuçlar

Kültürlü sıçan hipokampal nöronları ve 3D-SIM kullanılarak, AIS'deki aktin halkalarını ve MPS'nin diğer bileşenlerini görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol tanımlanmıştır. Görüntü yığınlarının rekonstrüksiyonları, aktin halkalarının net periyodikliğini göstermiştir (Şekil 2A). Ellerimizde, Alexa 488 etiketli falloidin kullanılarak görselleştirilen MPS'deki aktin halkalarının zirveler arası ortalama mesafesi 190,36 ± 1,7 nm (ortalama ± SEM) i...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol, süper çözünürlük tekniğini kullanarak MPS proteinlerinin görselleştirilmesi ve ölçülmesi için bir yöntem sağlar. Aktin halkaları ve diğer MPS bileşenleri ~190 nm9,10 periyodiklik gösterdiğinden, geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme yaklaşımları MPS'nin ayrıntılarını ortaya çıkaramaz. Birkaç mikroskopi kurulumu, kırınım sınırlı yapıları süper çözünürlükte çözebilir ve SIM sağlam...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Dr. Pirta Hotulainen, bu makaleyi hazırlamak için paha biçilmez olan eleştirel yorumları için kabul edilmektedir. Dr. Rimante Minkeviciene, orijinal deneyler için kullanılan nöronal kültürlerin hazırlanmasındaki yardımı için teşekkür edilir. Tüm görüntüleme işlemleri Biomedicum Görüntüleme Ünitesinde yapıldı. Bu çalışma Finlandiya Akademisi (D.M., SA 266351) ve Doktora Programı Beyin ve Zihin (AA) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesCorning3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 PhalloidinThermoFisherA12379
Alexa-647 anti-mouseThermoFisherA31571
Anti-Ankyrin G antibodyUC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/3675-146
Anti-MAP2 antibodyMerck MilliporeAB5543
B-27Invitrogen17504044
Bovine Serum Albumin (BSA)BioWestP6154
Deltavision OMX SRGE Healthcare Life SciencesN/A
Fiji software packageImageJ
GNU OctaveGNU
High performance coverslipsMarienfeld117530
Immersion Oil CalculatorCytiva Life Scienceshttps://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-GlutamineVWRICNA1680149
MATLAB R2020aMathworks
Neurobasal mediaInvitrogen21103049
OMX SRDelta Vision OMX
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProLong Gold mounting mediaInvitrogenP10144
softWoRx DeconvolutionCytiva Life Sciences
Superfrost SlidesEprediaISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µmThermoFisherT7279
Triton-XSigmaX100

Referanslar

  1. Leterrier, C. The Axon initial segment, 50 years later: A nexus for neuronal organization and function. Current Topics in Membranes. 77, 185-233 (2016).
  2. Leterrier, C., Dargent, B. No pasaran! Role of the axon initial segment in the regulation of protein transport and the maintenance of axonal identity. Seminars in Cell & Developmental Biology. 27, 44-51 (2014).
  3. Brachet, A., et al. Ankyrin G restricts ion channel diffusion at the axonal initial segment before the establishment of the diffusion barrier. Journal of Cell Biology. 191 (2), 383-395 (2010).
  4. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nature Cell Biology. 5 (7), 626-632 (2003).
  5. Song, A. H., et al. A selective filter for cytoplasmic transport at the axon initial segment. Cell. 136 (6), 1148-1160 (2009).
  6. Sun, X., et al. Selective filtering defect at the axon initial segment in Alzheimer's disease mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (39), 14271-14276 (2014).
  7. Winckler, B., Forscher, P., Mellman, I. A diffusion barrier maintains distribution of membrane proteins in polarized neurons. Nature. 397 (6721), 698-701 (1999).
  8. Kole, M. H., et al. Action potential generation requires a high sodium channel density in the axon initial segment. Nature Neuroscience. 11 (2), 178-186 (2008).
  9. Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science. 339 (6118), 452-456 (2013).
  10. Leterrier, C., et al. Nanoscale architecture of the axon initial segment reveals an organized and robust scaffold. Cell Reports. 13 (12), 2781-2793 (2015).
  11. Leterrier, C. The axon initial segment: An updated viewpoint. The Journal of Neuroscience. 38 (9), 2135-2145 (2018).
  12. Hamdan, H., et al. Mapping axon initial segment structure and function by multiplexed proximity biotinylation. Nature Communications. 11 (1), 100 (2020).
  13. Zhou, R., et al. Proteomic and functional analyses of the periodic membrane skeleton in neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Valli, J., et al. Seeing beyond the limit: A guide to choosing the right super-resolution microscopy technique. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100791 (2021).
  15. Wang, T., et al. Radial contractility of actomyosin rings facilitates axonal trafficking and structural stability. Journal of Cell Biology. 219 (5), 201902001 (2020).
  16. Abouelezz, A., Stefen, H., Segerstråle, M., Micinski, D., Minkeviciene, R., Lahti, L., Hardeman, E., Gunning, P., Hoogenraad, C., Taira, T., Fath, T., Hotulainen, P. Tropomyosin Tpm3.1 is required to maintain the structure and function of the axon initial segment. iScience. 23 (5), 101053 (2020).
  17. Muller, M., Monkemoller, V., Hennig, S., Hubner, W., Huser, T. Open-source image reconstruction of super-resolution structured illumination microscopy data in ImageJ. Nature Communications. 7, 10980 (2016).
  18. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  19. Stauffer, W., Sheng, H., Lim, H. N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms. Scientific Reports. 8 (1), 15764 (2018).
  20. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (4), 723-742 (2011).
  21. Lahti, L. Data analysis supplement to the research article Abouelezz, Stefen, Segerstråle, Micinski, Minkeviciene, Lahti, Hardeman, Gunning, Hoogenraad, Taira, Fath, & Hotulainen. Tropomyosin Tpm3.1 Is Required to Maintain the Structure and Function of the Axon Initial Segment. , (2021).
  22. Abouelezz, A., Micinski, D., Lipponen, A., Hotulainen, P. Sub-membranous actin rings in the axon initial segment are resistant to the action of latrunculin. Journal of Biological Chemistry. 400 (9), 1141-1146 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır