使用3D结构照明显微镜（3D-SIM）测量轴突初始段的膜周期性骨架的性质

摘要

本方案描述了一种使用培养的大鼠海马神经元和3D结构照明显微镜（3D-SIM）可视化和测量肌动蛋白环和轴突初始节段的膜周期性骨架的其它组分的方法。

摘要

轴突初始段（AIS）是动作电位启动的位点，并构成传递过滤器和扩散屏障，通过对体突状货物进行分类，有助于维持神经元极性。由周期性肌动蛋白环组成的膜周期性骨架（MPS）为锚定各种AIS蛋白（包括结构蛋白和不同的离子通道）提供了支架。尽管最近的蛋白质组学方法已经确定了相当多的新型AIS成分，但缺乏MPS结构及其各个组件的作用的细节。MPS中单个肌动蛋白环之间的距离（~190nm）需要使用超分辨率显微镜技术来解决MPS的结构细节。该协议描述了一种使用培养的大鼠海马神经元使用3D结构照明显微镜（3D-SIM）检查MPS中AIS蛋白相对于膜下肌动蛋白环的精确定位的方法。此外，还描述了一种定量评估单个组分的周期性及其相对于肌动蛋白环的位置的分析方法。

引言

轴突初始节段（AIS）是脊椎动物神经元近端轴突的一个短而独特的特化区域¹。AIS包括一个传输过滤器和扩散屏障，通过对躯体树^{突货物进行分类}来维持神经元极性2^，3，^{4，5，6，7}。此外，AIS的独特结构使其能够容纳电压门控离子通道簇，从而促进其作为动作电位启动位点的功能⁸。高度稳定的结构综合体是AIS独特功能的基础。过去十年的研究表明，存在一种膜周期性骨架（MPS），其中含有通过光谱连接的肌动蛋白环，并为锚定各种AIS蛋白提供了支架^9，10。

MPS中肌动蛋白环之间的距离（~190nm）^9，10 低于常规光学显微镜的分辨率极限。早期使用电子显微镜可视化MPS的尝试....

研究方案

这些实验中使用的原代海马神经元是根据赫尔辛基大学的道德准则和芬兰法律从胚胎第17天的Wistar大鼠胚胎中收获的¹⁶ 。

1. 样品制备

1. 在高保真玻璃盖玻片上，让大鼠海马神经元在稀疏培养条件下（约5，000-10，000个细胞/ cm ²）生长14天（体外14天）。
   注意：使用稀疏培养物可减少神经突重叠的机会，这有助于量化 MPS。
2. 在室温下使用4%多聚甲醛固定神经元12分钟。在PBS（BSA-PBS）中用0.2%BSA洗涤盖玻片一次，然后在室温下在PBS中的1%Triton-X溶液中孵育10分钟。在 BSA-PBS 中洗涤一次。
3. 稀释BSA-PBS中的抗炔酸甘油G抗体（1：200）。将抗体溶液加入盖玻片中，并在4°C下孵育过夜。 任选地，将鸡抗MAP2抗体（见 材料表）添加到抗体溶液中以划分躯体树突结构域。
4. 在BSA-PBS中洗涤细胞一次，然后在PBS中洗涤0.1%Triton-X，然后在BSA-PBS中进行最后洗涤。
5. 在BSA-PBS中稀释荧光团标记的抗小鼠二抗（1：200）（见 材料表），加入盖玻片中，并在室温下孵育1小时。在BSA-PBS中洗涤细胞一次，在PBS中洗涤0.1%Triton-X一次....

结果

使用培养的大鼠海马神经元和3D-SIM，描述了一种方案来可视化和测量AIS中MPS的肌动蛋白环和其他组分。图像堆栈的重建显示出肌动蛋白环的明显周期性（图2A）。在我们手中，使用 Alexa 488 标记的霉素可视化的 MPS 中肌动蛋白环的平均峰值间距离为 190 . 36±1 . 7nm （平均±SEM）。这与先前报道的MPS中肌动蛋白环之间的平均距离~190nm一致。同样，抗强耐菌素G抗体用于可视化强耐素.......

讨论

这里描述的方案提供了一种使用超分辨率技术可视化和测量MPS蛋白的方法。由于肌动蛋白环和其他MPS组分的周期性约为190 ^nm9，10，因此传统的衍射限制成像方法无法揭示MPS的细节。几种显微镜设置可以分辨超分辨率的衍射极限结构，而SIM代表了一种强大而简单的选择。重要的是，SIM与最广泛使用的荧光团兼容，提供了极大的灵活性。此外，SIM 可有效可?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Corning	3524
4% Paraformaldehyde
Alexa-488 Phalloidin	ThermoFisher	A12379
Alexa-647 anti-mouse	ThermoFisher	A31571
Anti-Ankyrin G antibody	UC Davis/NIH NeuroMab Facility, Clone 106/36	75-146
Anti-MAP2 antibody	Merck Millipore	AB5543
B-27	Invitrogen	17504044
Bovine Serum Albumin (BSA)	BioWest	P6154
Deltavision OMX SR	GE Healthcare Life Sciences	N/A
Fiji software package	ImageJ
GNU Octave	GNU
High performance coverslips	Marienfeld	117530
Immersion Oil Calculator	Cytiva Life Sciences		https://tinyurl.com/ImmersionOilCalculator
L-Glutamine	VWR	ICNA1680149
MATLAB R2020a	Mathworks
Neurobasal media	Invitrogen	21103049
OMX SR	Delta Vision OMX
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
ProLong Gold mounting media	Invitrogen	P10144
softWoRx Deconvolution	Cytiva Life Sciences
Superfrost Slides	Epredia	ISO 8037/1
TetraSpeck microspheres 0.1 µm	ThermoFisher	T7279
Triton-X	Sigma	X100