في أوفو الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج

Summary

الهدف العام من هذه الورقة هو وصف كيفية إجراء الحقن داخل الخلايا في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج. هذا النهج مفيد جدا لدراسة البيولوجيا التنموية لأجنة الدجاج.

Abstract

كنظام نموذجي كلاسيكي لبيولوجيا الأجنة ، تم استخدام جنين الدجاج للتحقيق في التطور الجنيني والتمايز. إن توصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج له ميزة كبيرة لدراسة وظيفة الجينات ، والتربية المعدلة وراثيا ، وإعداد الوهم أثناء التطور الجنيني. نوضح هنا طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة حيث يمكن نقل المواد الخارجية مثل ناقلات البلازميد أو الخلايا الجرثومية البدائية المعدلة (PGCs) إلى أجنة الدجاج المانحة في مراحل النمو المبكرة. تظهر النتائج أن الحقن داخل الأوعية الدموية من خلال الشريان الأورطي الظهري والرأس يسمح للمواد المحقونة بالانتشار في الجنين بأكمله من خلال الدورة الدموية. في البروتوكول المقدم ، تم تحديد فعالية إدخال البلازميد الخارجي وناقلات الفيروسات الخيطية ، واستعمار PGCs الخارجية المحقونة في الغدد التناسلية المتلقية ، من خلال مراقبة التألق في الأجنة. تصف هذه المقالة الإجراءات التفصيلية لهذه الطريقة ، وبالتالي توفر نهجا ممتازا لدراسة وظيفة الجينات ، وبيولوجيا الجنين والنمو ، وإنتاج الدجاج الوهمي للغدد التناسلية. في الختام ، ستسمح هذه المقالة للباحثين بإجراء الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة للمواد الخارجية في أجنة الدجاج بنجاح كبير وقابلية للتكرار.

Introduction

تم استخدام أجنة الدجاج على نطاق واسع لعدة قرون في التطبيقات التنموية والمناعية والمرضية وغيرها من التطبيقات البيولوجية¹،^2،3. لديهم العديد من المزايا المتأصلة على النماذج الحيوانية الأخرى في دراسة علم السموم وبيولوجيا الخلية⁴. يمكن الوصول بسهولة إلى أجنة الدجاج ويمكن التلاعب بها في المختبر ومراقبتها مباشرة في أي مرحلة من مراحل النمو ، مما يوفر نظاما مفيدا لنموذج أبحاث الأجنة.

بشكل عام ، فإن طرق توصيل جنين الدجاج الحالية مثل النقل الكهربائي والحقن تحت الجرثومي لها قيود مثل متطلبات المعدات المتخصصة وبرنامج مصمم ، وعدم الكفاءة بسبب وجود صفار البيض والزلال^5،6،7. نعرض هنا طريقة معالجة بسيطة وفعالة لتوصيل المواد الخارجية إلى أجنة الدجاج. هذا يمكن أن يكون أداة قوية تستخدم في دراسة علم الأحياء التنموي. تنتشر المواد المحقونة إلى الجنين بأكمله عن طريق الدورة الدموية. خلال التطور المبكر لأجنة الدجاج ، يمكن أن تهاجر PGCs عبر الدم ، وتستعمر التلال التناسلية ، ثم تتطور إلى أمشاج ، والتي توفر مسارا ممكنا قيما لتوصيل المواد الخارجية⁸. الآن ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع في دراسة وظيفة الجينات ، والبيولوجيا الجنينية والتنموية ، وإنتاج الدجاج الوهمي والمعدل وراثيا⁹،^10،11.

في البويضة الحقن داخل الأوعية الدموية في أجنة الدجاج هي طريقة راسخة وشائعة الاستخدام¹²،^13،14. في هذه الورقة ، نعرض وصفا شاملا لهذا البروتوكول بما في ذلك مواد الحقن والمواقع والجرعة والنتائج التمثيلية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على رعاية واستخدام الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للمعهد الوطني الأمريكي للصحة (NIH Pub. No. 85-23 ، المنقحة عام 1996) وبروتوكولات جنين الدجاج من قبل لجنة إدارة المختبر وأخلاقيات التجارب بجامعة يانغتشو ، الصين (رقم 201803124).

1. جمع البيض المخصب وإعداده

ملاحظة: على عكس الثدييات ، يحتوي الدجاج على ملايين البصيلات في مبيض واحد ، ولكن القليل فقط من هذه البصيلات ناضجة بما يكفي للإباضة. يحتوي كل جريب على بويضة واحدة أو خلية جرثومية. بمجرد أن ينضج الجريب ويطلق صفار البيض ، يتم دمجه في قمع قناة فالوب. عندما يدخل الجريب إلى البطن الوداجي لقناة البيض ، يرتبط السائل المنوي بالبويضة في جسم الدجاجة ، ويشكل الكالسيوم في جسم الدجاجة قشرة تغلف البويضة المخصبة ، وتشكل بيضة ذات قشرة ناعمة في الجسم. تزداد سماكة قشرة الكالسيوم تدريجيا حتى يتم إنتاج البيضة.

1. جمع البيض المخصب من بائع محلي أو مؤسسة ، والتي يمكن تخزينها في 16 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
   ملاحظة: ستساعد درجة حرارة التخزين العالية الجنين على التطور ، في حين أن درجة الحرارة المنخفضة ستقلل من صلاحية الجنين. سوف تفشل الأجنة في التطور إذا كان وقت التخزين طويلا جدا.
2. فرك قشر البيض بهدوء وببطء مع 75 ٪ من الإيثانول قبل نقل البيض إلى الحاضنة.
3. ضع البيض جانبيا ، بدقة على رف في حاضنة عند 37.8 درجة مئوية ورطوبة 60٪. بعد 60 ساعة من الحضانة (المرحلة 17 من HH) ، ستطور الأجنة أوعية دموية مرئية ويبدأ القلب في النبض¹⁵.
   ملاحظة: بعد 2 أيام من الحضانة ، تظهر نقاط بدائية صغيرة ، المرحلة المبكرة من القلب. وتسمى هذه العملية بتزيين الكرز. في ~ 2.5 يوم ، يتم تشكيل القلب وأجزاء الجسم الأخرى مع الأوعية المرئية.

2. التحضير قبل الحقن

1. تحضير الشعيرات الدموية الزجاجية التي سيتم استخدامها كإبر. قبل الحقن ، اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية مقاس 90 مم بقطر خارجي يبلغ 1 مم وقطر داخلي يبلغ 0.6 مم باستخدام المسحوب. كسر النصائح باستخدام ملقط (زاوية الشعيرات الدموية الزجاجية عادة ما تكون 45 درجة) وتعقيم الشعيرات الدموية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
2. قم بإعداد مواد خارجية المنشأ مثل البلازميدات وفيروسات lentivirus المعبأة و PGCs.
   1. امزج بلطف البلازميد pEGFP-N1 (بلازميد GFP محسن يعبر عن البلازميد ، 1 ميكروغرام / ميكرولتر) مع الجسيمات الشحمية بنسبة 1: 3 (م / ف). أضف الماء للحصول على تركيز الحمض النووي النهائي من 10 نانوغرام / ميكرولتر. دع خليط الحمض النووي يجلس على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الحقن.
   2. إذابة الفيروسات على الجليد قبل الحقن. يجب أن يكون عيار lentivirus المستخدم للحقن أكثر من 5 × 10⁶ Tu / mL.
   3. تمييع PGCs الغدد التناسلية الأبوية أو المعدلة (E4.5 ، المرحلة HH 24) إلى 2000-5000 خلية / ميكرولتر.
      ملاحظة: لقد أظهرنا هنا إجراء الحقن باستخدام التربان الأزرق.

3. النوافذ

1. قبل تعريض الأجنة ، قم بتعقيمها عن طريق مسح سطح قشر البيض بلطف ونعومة باستخدام 75٪ من الكحول باستخدام كرة قطنية ، مما يضمن تعقيم الحافة الحادة للبيض جيدا.
2. بعد التعقيم ، اضغط برفق على الطرف الحاد باستخدام الملقط لإنشاء نافذة صغيرة (0.5 سم × 0.5 سم) على سطح قشر البيض لفضح الجنين. قم بإزالة غشاء الجنين ثم ضع البويضة على حاملها تحت مجهر التشريح.

4. الحقن

1. ابحث عن الأوعية الدموية تحت المجهر واضبط تركيز مجهر التشريح لتحديد موقع الجنين ، ثم ابحث عن الوعاء الدموي جاهزا للحقن.
2. املأ الإبرة الزجاجية بالمحلول الخارجي (البلازميد أو الفيروس اللينتيفري أو PGCs) باستخدام ماصة ببطء ، وتجنب فقاعات الهواء في الإبرة.
3. وجه الإبرة بمحلول خارجي المنشأ إلى الوعاء الدموي ، مع الإبرة الموازية للوعاء الدموي الذي يتم حقنه.
4. أدخل الإبرة المملوءة بلطف في الوعاء وقم بتشغيل المضخة لإخراج المحلول (عادة ما يكون الحجم المحقون ~ 1-5 ميكرولتر) تحت المجهر. يجب أن يكون ضغط مضخة الهواء منخفضا بما يكفي لمنع تدمير الأوعية ، لأن ضغط الهواء المرتفع بشكل مفرط من شأنه أن يتلف الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تدفق عالي السرعة.
   1. بمجرد حقن المحلول الخارجي في الوعاء ، تأكد من أن لون الوعاء يتحول إلى لون المحلول ويستعيد إلى اللون الأحمر في 2-5 ثوان ، مما يشير إلى تسليم المحلول الخارجي بنجاح إلى السفينة. عند هذه النقطة يدخل المحلول إلى الشريان ، ومع نبض القلب يتم تعميمه مرة أخرى إلى الجنين من خلال الشريان ، ثم إلى الوريد.
      ملاحظة: هناك موقعان للحقن الوعائي (الشكل 1B): أحدهما هو الرأس ، حيث يتم حقن المحلول الخارجي من الوريد في رأس الجنين وإلى القلب من خلال تدفق الدم ، ثم يدور إلى الجنين بأكمله مع نبض القلب (الشكل 1B ، السهم 1). آخر هو من خلال الشريان الأورطي الظهري من دم الجنين. يتم حقن المحلول الخارجي وينتشر إلى الجنين بأكمله (الشكل 1B. السهم 2) مع نبض القلب الجنيني.
5. بعد الحقن ، قم بإزالة البويضة من المجهر الاستريو وأسقط 200 ميكرولتر من محلول البنسلين داخل قشر البيض. قطع قطعة طولها 3 سم من الشريط الطبي وختم النافذة. كشط الشريط بلطف باستخدام مقص للضغط على أي فقاعات هواء ثم قطع قطعة أخرى لإغلاق الفتحة عبرها.
6. ضع البويضة المحقونة مرة أخرى في الحاضنة واحتضنها حتى مرحلة النمو أو الفقس المطلوبة.

النتائج

نعرض هنا الحقن داخل الأوعية الدموية في البيضة لأجنة الدجاج. ويوضح الشكل 1 عملية تخطيطية للحقن داخل الأوعية الدموية؛ في دراستنا ، استخدمنا العديد من الحلول الخارجية لاختبار الحقن والتحقق منه.

لتصور المواد المحقونة بشكل أفضل ، تم حقن Trypan Blue (0.4٪) كمقتفي في...

Discussion

تم تحسين طريقة الحقن داخل الأوعية الدموية في البويضة لأجنة الدجاج للمواد الخارجية (الناقلة أو الفيروسية أو PGCs) ليتم نقلها إلى الجنين. بناء على هذه الطريقة ، قمنا ببناء نماذج جنين الدجاج مع فرط التعبير الجيني المستقر أو التداخل (SpinZ ، JUN ، UBE2I ، إلخ.) ^17,18,19

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061