В городе Ово Внутрисосудистая инъекция куриным эмбрионам

Резюме

Общей целью данной работы является описание того, как выполнить внутриклеточную инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Такой подход очень полезен для изучения биологии развития куриных эмбрионов.

Аннотация

В качестве классической модельной системы биологии эмбрионов куриный эмбрион был использован для исследования эмбрионального развития и дифференцировки. Доставка экзогенных материалов в куриные эмбрионы имеет большое преимущество для изучения функции генов, трансгенного разведения и подготовки химер во время эмбрионального развития. Здесь мы показываем метод внутрисосудистой инъекции in ovo, при котором экзогенные материалы, такие как плазмидные векторы или модифицированные первичные половые клетки (PGC), могут быть перенесены в донорские куриные эмбрионы на ранних стадиях развития. Результаты показывают, что внутрисосудистая инъекция через дорсальную аорту и головку позволяет введенным материалам диффундировать во весь эмбрион через кровеносную систему. В представленном протоколе эффективность введения экзогенных плазмидных и лентивирусных векторов, а также колонизация вводимых экзогенных ПГК в гонаду-реципиента определялись путем наблюдения флуоресценции у эмбрионов. В данной статье подробно описаны процедуры этого метода, тем самым обеспечивая отличный подход к изучению функции генов, биологии эмбриона и развития, а также производства гонадно-химерной курицы. В заключение данная статья позволит исследователям с большим успехом и воспроизводимостью выполнить внутрисосудистую инъекцию экзогенных материалов в куриные эмбрионы.

Введение

Куриные эмбрионы широко использовались на протяжении веков в развитии, иммунологическом, патологическом и других биологических применениях ^1,2,3. Они имеют много неотъемлемых преимуществ перед другими животными моделями в изучении токсикологии и клеточной биологии⁴. Куриные эмбрионы легко доступны и могут манипулироваться in vitro и непосредственно наблюдаться на любой стадии развития, что обеспечивает удобную систему моделирования эмбрионов.

В целом, современные методы доставки куриного эмбриона, такие как электротрансфекция и инъекция в подгерминальную полость, имеют ограничения, такие как потребность в специализированном оборудовании и разработанной программе, а также неэффективность из-за наличия желтка и белка ^5,6,7. Здесь мы показываем простой и эффективный метод транспортировки экзогенных материалов в куриные эмбрионы. Это может быть мощным инструментом, используемым при изучении биологии развития. Введенные материалы распространяются на весь эмбрион через кровообращение. Во время раннего развития куриных эмбрионов PHC могут мигрировать через кровь, колонизировать генитальный хребет, а затем развиваться в гаметы, которые обеспечивают ценный возможный путь для доставки экзогенных материалов⁸. В настоящее время этот метод широко используется при изучении функции генов, биологии эмбриона и развития, а также химерного и трансгенного производства^{курицы 9,10,11}.

Внутрисосудистая инъекция в куриные эмбрионы является хорошо зарекомендовавшим себя и широко используемым методом 12,13,14. В этой статье мы показываем всестороннее описание этого протокола, включая инъекционные материалы, места, дозировку и репрезентативные результаты.

протокол

Все процедуры, связанные с уходом и использованием животных, соответствовали руководящим принципам Национального института здравоохранения США (NIH Pub. No. 85-23, пересмотренный в 1996 году), а протоколы куриных эмбрионов были одобрены Комитетом по управлению лабораторными животными и экспериментальной этике животных Университета Янчжоу, Китай (No 201803124).

1. Сбор и подготовка оплодотворенных яйцеклеток

Примечание: В отличие от млекопитающих, курица имеет миллионы фолликулов в одном яичнике, но только некоторые из этих фолликулов достаточно зрелые, чтобы овулировать. Каждый фолликул содержит одну яйцеклетку или зародышевую клетку. Как только фолликул созревает и высвобождает свой желток, он включается в воронку маточной трубы. Когда фолликул попадает в яремное брюшко яйцевода, сперма связывается с яйцом в организме курицы, а кальций в организме курицы образует оболочку, которая обволакивает оплодотворенное яйцо, образуя в организме яйцо с мягкой скорлупой. Кальциевая оболочка постепенно утолщается до тех пор, пока не получится яйцо.

1. Соберите оплодотворенные яйцеклетки у местного продавца или учреждения, которые можно хранить при 16°C в течение 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая температура хранения поможет эмбриону развиваться, в то время как низкая температура снизит жизнеспособность эмбриона. Эмбрионы не будут развиваться, если время хранения слишком долгое.
2. Очистите яичную скорлупу мягко и медленно с 75% этанолом перед переносом яиц в инкубатор.
3. Поместите яйца боком, аккуратно на стойку в инкубаторе при температуре 37,8 °C и влажности 60%. После 60 ч инкубации (стадия HH 17) у эмбрионов разовьются видимые кровеносные сосуды и сердце начнет биться¹⁵.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После 2 дней инкубации появляются небольшие первичные точки, ранняя стадия сердца. Этот процесс называется вишневым бисером. Через ~2,5 дня сердце и другие сегменты тела формируются с видимыми сосудами.

2. Подготовка перед инъекцией

1. Подготовьте стеклянные капилляры, которые будут использоваться в качестве игл. Перед инъекцией вытяните стеклянные капилляры диаметром 90 мм с наружным диаметром 1 мм и внутренним диаметром 0,6 мм с помощью съемника. Разбейте наконечники с помощью щипцов (угол наклона стеклянного капилляра обычно составляет 45°) и стерилизуйте капилляры под ультрафиолетовым светом в течение 2 ч.
2. Приготовьте экзогенные материалы, такие как плазмиды, упакованные лентивирусы и PGC.
   1. Осторожно смешайте плазмиду pEGFP-N1 (усиленную плазмиду, экспрессирующую GFP, 1 мкг/мкл) с липосомой в соотношении 1:3 (м/об). Добавьте воду для получения конечной концентрации ДНК 10 нг/мкл. Дайте смеси ДНК постоять при 37 °C в течение 20 минут перед инъекцией.
   2. Оттаивайте вирусы на льду перед инъекцией. Титр лентивируса, используемого для инъекций, должен быть более 5 х 10⁶ Ту/мл.
   3. Разбавляйте родительские или модифицированные ГОНАДные ПГК (E4.5, HH стадия 24) до 2000-5000 клеток/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы показали процедуру инъекции с использованием трипан синего цвета.

3. Окна

1. Перед обнажением эмбрионов стерилизуйте их, аккуратно и мягко протирая поверхность яичной скорлупы 75% спиртом с помощью ватного тампона, обеспечив тщательную стерилизацию тупого края яиц.
2. После стерилизации аккуратно постучите по тупому концу щипцами, чтобы создать небольшое окошко (0,5 см х 0,5 см) на поверхности яичной скорлупы, чтобы обнажить эмбрион. Удалите мембрану эмбриона, а затем поместите яйцеклетку на держатель под рассеченным микроскопом.

4. Инъекция

1. Ищите кровеносные сосуды под микроскопом и регулируйте фокус рассеченного микроскопа, чтобы найти эмбрион, а затем найдите кровеносный сосуд, готовый к инъекции.
2. Заполните стеклянную иглу экзогенным раствором (плазмидой, лентивирусом или PGC) с помощью пипетки медленно, избегая пузырьков воздуха в игле.
3. Направьте иглу с экзогенным раствором на кровеносный сосуд, причем игла параллельна вводимому кровеносному сосуду.
4. Аккуратно вставьте заполненную иглу в сосуд и включите насос, чтобы извлечь раствор (обычно вводимый объем составляет ~1-5 мкл) под микроскопом. Давление воздушного насоса должно быть достаточно низким, чтобы предотвратить разрушение сосудов, так как чрезмерно высокое давление воздуха повредит кровеносные сосуды, что приведет к высокоскоростному потоку.
   1. После того, как экзогенный раствор введен в сосуд, убедитесь, что цвет сосуда превращается в цвет раствора и восстанавливается до красного через 2-5 с, что указывает на то, что экзогенный раствор успешно доставлен в сосуд. В этот момент раствор поступает в артерию, и с биением сердца циркулирует обратно к эмбриону через артерию, а затем к вене.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два места инъекции для сосудистой инъекции (рисунок 1B): один - головка, где экзогенный раствор вводится из вены в головке эмбриона и в сердце через кровоток, а затем циркулирует ко всему эмбриону с сердцебиением (Рисунок 1B, Стрелка 1). Другой — через дорсальную аорту эмбриональной крови; экзогенный раствор вводится и распространяется на весь эмбрион (рис. 1В. Стрелка 2) с биением эмбрионального сердца.
5. После инъекции извлеките яйцо из стереомикроскопа и опустите 200 мкл раствора пенициллина внутрь яичной скорлупы. Вырежьте кусок медицинской ленты длиной 3 см и заклейте окно. Аккуратно соскоблите ленту ножницами, чтобы выдавить пузырьки воздуха, а затем вырежьте еще один кусок, чтобы запечатать отверстие поперек.
6. Маркируйте и поместите введенное яйцо обратно в инкубатор и инкубируйте до требуемой стадии развития или вылупления.

Результаты

Здесь мы покажем внутрисосудистую инъекцию в ово куриных эмбрионов. Схематический процесс внутрисосудистой инъекции показан на рисунке 1; В нашем исследовании мы использовали различные экзогенные растворы для тестирования и проверки инъекций.

Что?...

Обсуждение

Метод внутрисосудистой инъекции куриных эмбрионов оптимизирован для переноса в эмбрион экзогенных материалов (векторных, вирусных или ПГК). На основе этого метода мы построили модели куриного эмбриона со стабильной гиперэкспрессией или интерференцией генов (SpinZ, JUN, UBE2I и т.д.)

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061