オヴォで ニワトリ胚における血管内注射

要約

この論文の全体的な目標は、ニワトリ胚への外因性物質の卵管細胞内注入 において どのように行うかを記述することである。このアプローチは、ニワトリ胚の発生生物学を研究するのに非常に有用である。

要約

胚生物学の古典的なモデルシステムとして、ニワトリ胚は胚の発生と分化を調べるために使用されてきた。外因性物質をニワトリ胚に送達することは、胚発生中の遺伝子機能、トランスジェニック育種、およびキメラ調製を研究する上で大きな利点を有する。ここでは、プラスミドベクターや改変始原生殖細胞(PGC)などの外因性物質を発生初期の段階でドナーニワトリ胚に移入することができる in ovo 血管内注射の方法を示す。結果は、背側大動脈および頭部を介した血管内注射が、注入された物質が血液循環系を介して胚全体に拡散することを可能にすることを示している。提示されたプロトコールにおいて、外因性プラスミドおよびレンチウイルスベクター導入の有効性、ならびにレシピエント生殖巣における注射された外因性PGCのコロニー形成を、胚における蛍光を観察することによって決定した。この記事では、この方法の詳細な手順を説明し、それによって遺伝子機能、胚および発生生物学、および生殖腺キメラニワトリ産生を研究するための優れたアプローチを提供する。結論として、この記事は、研究者が大きな成功と再現性でニワトリ胚への外因性物質の 卵管 内注射を行うことを可能にします。

概要

ニワトリ胚は、発生学的、免疫学的、病理学的、および他の生物学的用途において何世紀にもわたって広く使用されてきた^1,2,3。それらは、毒物学および細胞生物学の研究において、他の動物モデルよりも多くの固有の利点を有する⁴。ニワトリの胚は簡単にアクセスでき、インビトロで操作し、任意の発生段階で直接観察することができ、便利な胚研究モデルシステムを提供します。

一般に、エレクトロトランスフェクションや胚腔下注射などの現在のニワトリ胚送達方法は、専門機器や設計されたプログラムの要件、卵黄や卵白の存在による非効率性などの制限があります^5,6,7。ここでは、外因性物質をニワトリ胚に送達するための簡単で効率的な取り扱い方法を示す。これは、発生生物学の研究に使用される強力なツールとなり得ます。注入された物質は、血液循環を介して胚全体に広がる。ニワトリ胚の初期発生の間、PGCは血液中を移動し、生殖器隆起に定着し、配偶子に発達し、外因^性物質8を送達するための貴重な可能な経路を提供する。現在、この方法は、遺伝子機能、胚および発生生物学、ならびにキメラおよびトランスジェニックニワトリ産生の研究において広く使用されている⁹、^10、11。

ニワトリ胚における卵管内注射において、十分に確立され、一般的に使用される方法¹²、^13、14である。この論文では、注射材料、部位、投与量、および代表的な結果を含むこのプロトコルの包括的な説明を示す。

プロトコル

動物の世話と使用に関するすべての手順は、米国国立衛生研究所のガイドライン(NIH Pub. No. 85-23、1996年改訂)に準拠し、ニワトリ胚プロトコルは、中国揚州大学の実験動物管理および実験動物倫理委員会(No.201803124)によって承認されました。

1. 受精卵の採取と準備

注:哺乳類とは異なり、鶏肉は単一の卵巣に何百万もの卵胞を持っていますが、これらの卵胞のほんの一部だけが排卵するのに十分成熟しています。各卵胞は1つの卵母細胞または生殖細胞を含む。卵胞が成熟して卵黄を放出するとすぐに、卵管の漏斗に取り込まれます。卵胞が卵管の頸部腹部に入ると、精液が鶏の体内の卵に結合し、鶏の体内のカルシウムが受精卵を包む殻を形成し、体内に柔らかい殻の卵を形成します。カルシウムの殻は、卵が生産されるまで徐々に厚くなります。

1. 受精卵を地元の業者や機関から集め、16°Cで1週間保存することができます。
   注:高い保存温度は胚の発達を助け、低温は胚の生存率を低下させる。胚は、保存時間が長すぎると発達しない。
2. 卵をインキュベーターに移す前に、卵殻を75%エタノールで柔らかくゆっくりとこすります。
3. 卵を横向きに、37.8°C、湿度60%のインキュベーター内のラックにきれいに置きます。60時間のインキュベーション(HHステージ17)の後、胚は目に見える血管を発達させ、心臓は¹⁵を鼓動し始めます。
   注:2日間の孵化後、心臓の初期段階である小さな原始的な点が現れます。このプロセスはチェリービーズと呼ばれます。〜2.5日で、心臓および他の身体セグメントが目に見える血管で形成される。

2. 注射前の準備

1. 針として使用するガラス毛細血管を準備します。注入前に、プーラーを使用して外径1mm、内径0.6mmの90mmのガラス毛細血管を引っ張る。鉗子(ガラス細管の角度は通常45°)を使用して先端を壊し、UV光の下で毛細血管を2時間滅菌します。
2. プラスミド、パッケージ化されたレンチウイルス、PGCなどの外因性材料を調製する。
   1. プラスミドpEGFP-N1(GFP発現増強プラスミド、1μg/μL)とリポソームを1:3(m/v)の比率で穏やかに混合する。水を加えて、10 ng/μLの最終DNA濃度を得た。DNA混合物を注射前に37°Cで20分間座らせます。
   2. 注射前に氷の上でウイルスを解凍する。注射に使用するレンチウイルスの力価は、5 x 10⁶ Tu/mL以上でなければなりません。
   3. 親または修飾生殖腺PGC(E4.5、HHステージ24)を2,000~5,000細胞/μLに希釈する。
      注:ここでは、トリパンブルーを使用した注射手順を示しました。

3. ウィンドウイング

1. 胚を露出させる前に、綿球を使って75%のアルコールで卵殻の表面を優しく柔らかく拭き取り、卵の鈍い縁を完全に滅菌してください。
2. 滅菌後、鈍い端を鉗子で静かに叩いて、卵殻表面に小さな窓(0.5 cm x 0.5 cm)を作り、胚を露出させます。胚膜を除去し、解剖顕微鏡下でホルダーに卵子を置く。

4. インジェクション

1. 顕微鏡下で血管を探し、解剖顕微鏡の焦点を調整して胚を見つけ、注射の準備ができている血管を見つけます。
2. ガラスの針に外因性溶液(プラスミド、レンチウイルス、またはPGC)をピペットを使用してゆっくりと充填し、針の気泡を避けます。
3. 外因性溶液を含む針を血管に向け、注射する血管と平行な針を向けます。
4. 充填された針を容器に静かに挿入し、ポンプをオンにして溶液(通常、注入量は〜1〜5μL)を顕微鏡下で排出する。空気ポンプの圧力は、過度に高い空気圧が高速の流れにつながる血管を損傷するため、血管の破壊を防ぐのに十分低いべきである。
   1. 外因性溶液が容器に注入されたら、容器の色が溶液の色に変わり、2〜5秒で赤色に回復し、外因性溶液が血管に正常に送達されたことを示す。この時点で、溶液は動脈に入り、心臓の鼓動とともに動脈を通って胚に戻り、次いで静脈に循環する。
      注:血管注射には2つの注射部位(図1B)があります:1つは頭部であり、外因性溶液が胚の頭部の静脈から血流を介して心臓に注入され、次いで心臓が鼓動しながら胚全体に循環する(図1B、矢印1)。もう一つは、胚血の背側大動脈を通してである。外因性溶液が注入され、胚全体に広がる(図1B.矢印2)胚性心臓の鼓動を伴う。
5. 注射後、実体顕微鏡から卵を取り出し、卵殻の中に200μLのペニシリン溶液を滴下する。長さ3cmの医療用テープを切って窓を密閉します。はさみでテープを優しくこすり取って気泡を絞り出し、別の部分を切って開口部を密閉します。
6. 注射した卵にラベルを付け、インキュベーターに戻し、必要な発達段階または孵化まで孵化させる。

結果

ここではニワトリ胚の 卵 管内注射を示す。血管内注射の概略プロセスを 図1に示す。私たちの研究では、注射をテストおよび検証するためにさまざまな外因性溶液を使用しました。

注入された材料をよりよく視覚化するために、トリパンブルー(0.4%)をトレーサーとして胚に注入した。トレーサー(青色)は、背側大動脈または頭部注射のいず?...

ディスカッション

ニワトリ胚のin ovo血管内注射の方法は、外因性物質(ベクター、ウイルス性、またはPGC)が胚に移植されるように最適化される。この手法に基づき、安定した遺伝子過剰発現または干渉(SpinZ、JUN、UBE2Iなど)を有するニワトリ胚モデルを構築した。^17,18,19。これらの確立されたモデルは、このアプローチの実現可能性を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061