À Ovo Injection intravasculaire dans des embryons de poulet

Résumé

L’objectif global de cet article est de décrire comment effectuer une injection intracellulaire ovo de matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cette approche est très utile pour étudier la biologie du développement des embryons de poulet.

Résumé

En tant que système modèle classique de biologie embryonnaire, l’embryon de poulet a été utilisé pour étudier le développement embryonnaire et la différenciation. L’administration de matériaux exogènes dans des embryons de poulet présente un grand avantage pour l’étude de la fonction des gènes, de la reproduction transgénique et de la préparation de chimères pendant le développement embryonnaire. Nous montrons ici la méthode d’injection intravasculaire inovo par laquelle des matériaux exogènes tels que des vecteurs plasmidiques ou des cellules germinales primordiales modifiées (PGC) peuvent être transférés dans des embryons de poulet donneurs à des stades précoces de développement. Les résultats montrent que l’injection intravasculaire à travers l’aorte dorsale et la tête permet aux matériaux injectés de diffuser dans l’embryon entier à travers le système circulatoire sanguin. Dans le protocole présenté, l’efficacité de l’introduction de plasmides exogènes et de vecteurs lentiviraux, ainsi que la colonisation des PGC exogènes injectés dans la gonade receveuse, ont été déterminées en observant la fluorescence dans les embryons. Cet article décrit les procédures détaillées de cette méthode, fournissant ainsi une excellente approche pour étudier la fonction des gènes, la biologie embryonnaire et du développement, et la production de poulet gonade-chimérique. En conclusion, cet article permettra aux chercheurs d’effectuer en injection ovo-intravasculaire de matériaux exogènes dans des embryons de poulet avec beaucoup de succès et de reproductibilité.

Introduction

Les embryons de poulet sont largement utilisés depuis des siècles dans des applications développementales, immunologiques, pathologiques et biologiques ^1,2,3. Ils présentent de nombreux avantages inhérents par rapport aux autres modèles animaux dans l’étude de la toxicologie et de la biologie cellulaire⁴. Les embryons de poulet sont facilement accessibles et peuvent être manipulés in vitro et directement observés à n’importe quel stade de développement, ce qui fournit un système pratique de modèle de recherche sur les embryons.

En général, les méthodes actuelles d’administration d’embryons de poulet telles que l’électrotransfection et l’injection de cavité sous-germinale ont des limites telles que l’exigence d’un équipement spécialisé et d’un programme conçu, et l’inefficacité due à la présence de jaune et ^{d’albumine 5,6,7}. Nous montrons ici une méthode de manipulation simple et efficace pour délivrer des matériaux exogènes dans des embryons de poulet. Cela peut être un outil puissant utilisé dans l’étude de la biologie du développement. Les matières injectées se propagent à l’embryon entier par circulation sanguine. Au cours du développement précoce des embryons de poulet, les PGC pourraient migrer dans le sang, coloniser la crête génitale, puis se développer en gamètes, ce qui constitue un moyen précieux de délivrer des matériaux exogènes⁸. Maintenant, cette méthode a été largement utilisée dans l’étude de la fonction des gènes, de la biologie embryonnaire et du développement, et de la production de poulet chimérique et transgénique ^9,10,11.

L’injection intravasculaire inovo dans des embryons de poulet est une méthode bien établie et couramment utilisée 12,13,14. Dans cet article, nous montrons une description complète de ce protocole, y compris les matériaux d’injection, les sites, la posologie et les résultats représentatifs.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le soin et l’utilisation d’animaux étaient conformes aux directives de l’Institut national de la santé des États-Unis (NIH Pub. n° 85-23, révisée en 1996) et les protocoles sur les embryons de poulet ont été approuvés par le Comité de gestion des animaux de laboratoire et d’éthique des animaux expérimentaux de l’Université de Yangzhou, en Chine (n° 201803124).

1. Collecte et préparation des ovules fécondés

REMARQUE: Contrairement aux mammifères, le poulet a des millions de follicules dans un seul ovaire, mais seuls quelques-uns de ces follicules sont assez matures pour ovuler. Chaque follicule contient un ovocyte ou une cellule germinale. Dès que le follicule mûrit et libère son jaune, il est incorporé dans l’entonnoir de la trompe de Fallope. Lorsque le follicule pénètre dans l’abdomen jugulaire de l’oviducte, le sperme se lie à l’œuf dans le corps de la poule et le calcium dans le corps de la poule forme une coquille qui enveloppe l’œuf fécondé, formant un œuf à carapace molle dans le corps. La coquille de calcium s’épaissit progressivement jusqu’à ce que l’œuf soit produit.

1. Recueillez les œufs fécondés auprès d’un vendeur ou d’une institution locale, qui peuvent être conservés à 16 ° C pendant 1 semaine.
   REMARQUE: La température de stockage élevée aidera l’embryon à se développer, tandis que la basse température diminuera la viabilité de l’embryon. Les embryons ne se développeront pas si le temps de stockage est trop long.
2. Frottez la coquille d’œuf doucement et lentement avec de l’éthanol à 75% avant de transférer les œufs dans l’incubateur.
3. Placez les œufs sur le côté, soigneusement sur une grille dans un incubateur à 37,8 °C et 60% d’humidité. Après 60 h d’incubation (stade HH 17), les embryons développeront des vaisseaux sanguins visibles et le cœur commencera à battre¹⁵.
   REMARQUE: Après 2 jours d’incubation, de petits points primordiaux, au stade précoce du cœur, apparaissent. Ce processus est appelé perlage de cerise. À ~ 2,5 jours, le cœur et d’autres segments du corps sont formés avec des vaisseaux visibles.

2. Préparation avant injection

1. Préparez des capillaires en verre qui seront utilisés comme aiguilles. Avant l’injection, tirez des capillaires en verre de 90 mm d’un diamètre extérieur de 1 mm et d’un diamètre intérieur de 0,6 mm à l’aide de l’extracteur. Casser les pointes à l’aide de pinces (l’angle du capillaire en verre est généralement de 45°) et stériliser les capillaires sous la lumière UV pendant 2 h.
2. Préparez des matériaux exogènes tels que des plasmides, des lentivirus emballés et des PGC.
   1. Mélanger doucement le plasmide pEGFP-N1 (un plasmide exprimant le GFP amélioré, 1μg/μL) avec le liposome à un rapport de 1:3 (m/v). Ajouter de l’eau pour obtenir une concentration finale d’ADN de 10 ng/μL. Laisser reposer le mélange d’ADN à 37 °C pendant 20 min avant l’injection.
   2. Décongeler les virus sur la glace avant l’injection. Le titre du lentivirus utilisé pour l’injection doit être supérieur à 5 x 10⁶ Tu/mL.
   3. Diluer les PGC gonivaux parentaux ou modifiés (E4.5, HH stade 24) à 2 000-5 000 cellules/μL.
      REMARQUE: Ici, nous avons montré la procédure d’injection en utilisant le bleu de trypan.

3. Fenêtrage

1. Avant d’exposer les embryons, stérilisez-les en essuyant doucement et doucement la surface des coquilles d’œufs avec 75% d’alcool à l’aide d’une boule de coton, en veillant à stériliser soigneusement le bord émoussé des œufs.
2. Après la stérilisation, tapotez doucement l’extrémité émoussée avec une pince pour créer une petite fenêtre (0,5 cm x 0,5 cm) sur la surface de la coquille d’œuf pour exposer l’embryon. Retirez la membrane embryonnaire, puis placez l’œuf sur le support sous le microscope à dissection.

4. Injection

1. Recherchez les vaisseaux sanguins sous le microscope et ajustez la mise au point du microscope à dissection pour localiser l’embryon, puis trouvez le vaisseau sanguin prêt à être injecté.
2. Remplissez l’aiguille en verre avec la solution exogène (plasmide, lentivirus ou PGC) à l’aide d’une pipette lentement, en évitant les bulles d’air dans l’aiguille.
3. Dirigez l’aiguille avec une solution exogène vers le vaisseau sanguin, l’aiguille étant parallèle au vaisseau sanguin injecté.
4. Insérez doucement l’aiguille remplie dans le récipient et allumez la pompe pour éjecter la solution (généralement le volume injecté est d’environ 1-5 μL) sous le microscope. La pression de la pompe à air doit être suffisamment basse pour empêcher la destruction des vaisseaux, car la pression d’air excessivement élevée endommagerait les vaisseaux sanguins conduisant à un débit à grande vitesse.
   1. Une fois la solution exogène injectée dans le récipient, assurez-vous que la couleur du récipient se transforme en couleur de la solution et redonne au rouge en 2-5 s, indiquant que la solution exogène est livrée avec succès au vaisseau. À ce stade, la solution pénètre dans l’artère et, avec le battement du cœur, est renvoyée à l’embryon par l’artère, puis à la veine.
      REMARQUE: Il existe deux sites d’injection vasculaire (Figure 1B): l’un est la tête, où la solution exogène est injectée de la veine dans la tête de l’embryon et dans le cœur par le flux sanguin, puis circule vers l’embryon entier avec le cœur battant (Figure 1B, Flèche 1). Un autre est à travers l’aorte dorsale du sang embryonnaire; la solution exogène est injectée et se propage à l’embryon entier (Figure 1B. Flèche 2) avec le battement du cœur embryonnaire.
5. Après l’injection, retirez l’œuf du stéréomicroscope et déposez 200 μL de solution de pénicilline à l’intérieur de la coquille de l’œuf. Coupez un morceau de ruban adhésif médical de 3 cm de long et scellez la fenêtre. Grattez doucement le ruban adhésif avec des ciseaux pour extraire les bulles d’air, puis coupez un autre morceau pour sceller l’ouverture.
6. Étiquetez et replacez l’œuf injecté dans l’incubateur et incubez jusqu’au stade de développement ou d’éclosion requis.

Résultats

Nous montrons ici l’injection in ovo intravasculaire d’embryons de poulet. Un processus schématique de l’injection intravasculaire est illustré à la figure 1; dans notre étude, nous avons utilisé diverses solutions exogènes pour tester et vérifier l’injection.

Pour mieux visualiser les matériaux injectés, Trypan Blue (0,4%) a été injecté comme traceur dans l’embryon. On a observé que le traceur (bleu) diffusait vers l’embryon ...

Discussion

La méthode d’injection inovo-intravasculaire d’embryons de poulet est optimisée pour que des matériaux exogènes (vecteurs, viraux ou PGC) soient transférés dans l’embryon. Sur la base de cette méthode, nous avons construit des modèles d’embryons de poulet avec une surexpression ou une interférence génétique stable (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Ces modèles bien établis prouvent la faisabilité...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061