Burada: Ovo Tavuk Embriyolarında İntravasküler Enjeksiyon

Özet

Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.

Özet

Embriyo biyolojisinin klasik bir model sistemi olarak, tavuk embriyosu embriyonik gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılmıştır. Eksojen materyallerin tavuk embriyolarına verilmesi, embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonunu, transgenik ıslahı ve kimera preparatını incelemek için büyük bir avantaja sahiptir. Burada, plazmid vektörleri veya modifiye primordial germ hücreleri (PGC'ler) gibi eksojen materyallerin erken gelişim evrelerinde donör tavuk embriyolarına aktarılabildiği in ovo intravasküler enjeksiyon yöntemini gösteriyoruz. Sonuçlar, dorsal aort ve kafa yoluyla intravasküler enjeksiyonun, enjekte edilen materyallerin kan dolaşım sistemi yoluyla tüm embriyoya yayılmasına izin verdiğini göstermektedir. Sunulan protokolde, eksojen plazmid ve lentiviral vektör girişinin etkinliği ve alıcı gonadda enjekte edilen eksojen PGC'lerin kolonizasyonu, embriyolarda floresan gözlenerek belirlenmiştir. Bu makalede, bu yöntemin ayrıntılı prosedürleri açıklanmakta ve böylece gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve gonad-kimerik tavuk üretimini incelemek için mükemmel bir yaklaşım sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale araştırmacıların tavuk embriyolarına eksojen materyallerin ovo intravasküler enjeksiyonunda büyük başarı ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmelerini sağlayacaktır.

Giriş

Tavuk embriyoları gelişimsel, immünolojik, patolojik ve diğer biyolojik uygulamalarda yüzyıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır ^1,2,3. Toksikoloji ve hücre biyolojisi çalışmalarında diğer hayvan modellerine göre birçok doğal avantaja sahiptirler⁴. Tavuk embriyolarına kolayca erişilebilir ve in vitro olarak manipüle edilebilir ve kullanışlı bir embriyo araştırma modeli sistemi sağlayan herhangi bir gelişim aşamasında doğrudan gözlemlenebilir.

Genel olarak, elektrotransfeksiyon ve subgerminal kavite enjeksiyonu gibi mevcut tavuk embriyosu verme yöntemleri, uzman ekipman ve tasarlanmış bir programın gerekliliği ve yumurta sarısı ve albümen 5,6,7'nin varlığından kaynaklanan verimsizlik gibi sınırlamalara sahiptir. Burada, eksojen materyalleri tavuk embriyolarına iletmek için basit ve etkili bir taşıma yöntemi gösteriyoruz. Bu, gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılan güçlü bir araç olabilir. Enjekte edilen materyaller kan dolaşımı yoluyla tüm embriyoya yayılır. Tavuk embriyolarının erken gelişimi sırasında, PGC'ler kan yoluyla göç edebilir, genital sırtı kolonize edebilir ve daha sonra eksojen materyalleri vermek için değerli bir olası yol sağlayan gametlere dönüşebilir⁸. Şimdi, bu yöntem gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve kimerik ve transgenik tavuk üretimi ^9,10,11 çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.

In ovo tavuk embriyolarında intravasküler enjeksiyon köklü ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir^12,13,14. Bu yazıda, enjeksiyon malzemeleri, bölgeler, dozaj ve temsili sonuçlar dahil olmak üzere bu protokolün kapsamlı bir tanımını göstereceğiz.

Protokol

Hayvanların bakımı ve kullanımını içeren tüm prosedürler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü yönergelerine (NIH Pub. No. 85-23, revize edilmiş 1996) ve tavuk embriyosu protokollerine uygun olarak, Çin Yangzhou Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Yönetimi ve Deneysel Hayvan Etiği Komitesi (No.201803124) tarafından onaylanmıştır.

1. Döllenmiş yumurta toplama ve hazırlama

NOT: Memelilerin aksine, tavuğun tek bir yumurtalıkta milyonlarca folikülü vardır, ancak bu foliküllerin sadece birkaçı yumurtlamak için yeterince olgundur. Her folikül bir yumurta veya germ hücresi içerir. Folikül olgunlaşır olgunlaşmaz ve sarısını serbest bırakır bırakmaz, fallop tüpünün hunisine dahil edilir. Folikül, yumurta kanalının juguler karnına girdiğinde, meni tavuğun vücudundaki yumurtaya bağlanır ve tavuğun vücudundaki kalsiyum, döllenmiş yumurtayı saran ve vücutta yumuşak kabuklu bir yumurta oluşturan bir kabuk oluşturur. Kalsiyum kabuğu, yumurta üretilene kadar yavaş yavaş kalınlaşır.

1. Döllenmiş yumurtaları, 1 hafta boyunca 16 ° C'de saklanabilen yerel bir satıcıdan veya kurumdan toplayın.
   NOT: Yüksek depolama sıcaklığı embriyonun gelişmesine yardımcı olurken, düşük sıcaklık embriyonun yaşayabilirliğini azaltacaktır. Depolama süresi çok uzunsa embriyolar gelişemez.
2. Yumurtaları inkübatöre aktarmadan önce yumurta kabuğunu% 75 etanol ile yumuşak ve yavaş bir şekilde ovalayın.
3. Yumurtaları yanlara, 37.8 ° C'de ve% 60 nemde bir inkübatördeki bir rafa düzgünce yerleştirin. 60 saatlik inkübasyondan sonra (HH evre 17), embriyolar görünür kan damarları geliştirecek ve kalp¹⁵ atmaya başlayacaktır.
   NOT: 2 günlük inkübasyondan sonra, kalbin erken evresi olan küçük ilkel noktalar ortaya çıkar. Bu işleme kiraz boncuklama denir. ~ 2.5 günde, kalp ve diğer vücut segmentleri görünür damarlarla oluşur.

2. Enjeksiyondan önce hazırlık

1. İğne olarak kullanılacak cam kılcal damarlar hazırlayın. Enjeksiyondan önce, çektirmeyi kullanarak dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,6 mm olan 90 mm cam kılcal damarları çekin. Forseps kullanarak uçları kırın (cam kılcal damarın açısı genellikle 45 ° 'dir) ve kılcal damarları UV ışığı altında 2 saat boyunca sterilize edin.
2. Plazmidler, paketlenmiş lentivirüsler ve PGC'ler gibi eksojen malzemeler hazırlayın.
   1. Plazmid pEGFP-N1'i (plazmidi eksprese eden gelişmiş bir GFP, 1μg / μL) lipozomla 1: 3 oranında (m / v) yavaşça karıştırın. 10 ng / μL'lik nihai bir DNA konsantrasyonu elde etmek için su ekleyin. DNA karışımının enjeksiyondan önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de oturmasına izin verin.
   2. Enjeksiyondan önce virüsleri buz üzerinde çözün. Enjeksiyon için kullanılan lentivirüs titresi 5 x 10⁶ Tu / mL'nin üzerinde olmalıdır.
   3. Ebeveyn veya modifiye gonad PGC'leri (E4.5, HH evre 24) 2.000-5.000 hücre/μL'ye seyreltin.
      NOT: Burada tripan mavisi kullanarak enjeksiyon prosedürünü gösterdik.

3. Pencereleme

1. Embriyoları açığa çıkarmadan önce, yumurta kabuklarının yüzeyini bir pamuk topu kullanarak% 75 alkolle nazikçe ve yumuşak bir şekilde silerek sterilize edin ve yumurtaların kör kenarını iyice sterilize edin.
2. Sterilizasyondan sonra, embriyoyu açığa çıkarmak için yumurta kabuğu yüzeyinde küçük bir pencere (0,5 cm x 0,5 cm) oluşturmak için forseps ile künt uca hafifçe dokunun. Embriyo zarını çıkarın ve ardından yumurtayı diseksiyon mikroskobu altında tutucuya yerleştirin.

4. Enjeksiyon

1. Mikroskop altında kan damarlarını arayın ve embriyoyu bulmak için diseksiyon mikroskobunun odağını ayarlayın ve ardından enjeksiyon için hazır kan damarını bulun.
2. Cam iğneyi eksojen çözelti (plazmid, lentivirüs veya PGC'ler) ile yavaşça bir pipet kullanarak doldurun ve iğnedeki hava kabarcıklarını önleyin.
3. İğneyi kan damarında eksojen çözelti ile, iğne enjekte edilen kan damarına paralel olarak hedefleyin.
4. Doldurulmuş iğneyi yavaşça kabın içine yerleştirin ve çözeltiyi mikroskop altında çıkarmak için pompayı açın (genellikle enjekte edilen hacim ~ 1-5 μL'dir). Hava pompası basıncı, damarların tahrip olmasını önleyecek kadar düşük olmalıdır, çünkü aşırı yüksek hava basıncı, yüksek hızlı akışa yol açan kan damarlarına zarar verecektir.
   1. Eksojen çözelti kaba enjekte edildikten sonra, kabın renginin çözelti rengine dönüştüğünden ve eksojen çözeltinin kaba başarıyla verildiğini gösteren 2-5 s'de kırmızıya geri döndüğünden emin olun. Bu noktada çözelti artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner.
      NOT: Vasküler enjeksiyon için iki enjeksiyon bölgesi vardır (Şekil 1B): Birincisi, eksojen çözeltinin embriyonun başındaki damardan ve kan akışı yoluyla kalbe enjekte edildiği, daha sonra kalp atışı ile tüm embriyoya dolaştığı kafadır (Şekil 1B, Ok 1). Bir diğeri embriyo kanının dorsal aortundan geçer; eksojen çözelti enjekte edilir ve tüm embriyoya yayılır (Şekil 1B. Ok 2) embriyonik kalbin atışı ile.
5. Enjeksiyondan sonra, yumurtayı stereo mikroskoptan çıkarın ve yumurta kabuğunun içine 200 μL Penisilin çözeltisi bırakın. 3 cm uzunluğunda bir tıbbi bant parçası kesin ve pencereyi kapatın. Hava kabarcıklarını sıkmak için bandı makasla yavaşça kazıyın ve ardından açıklığı kapatmak için başka bir parça kesin.
6. Enjekte edilen yumurtayı etiketleyin ve inkübatöre geri yerleştirin ve gerekli gelişim aşamasına veya kuluçkaya kadar inkübe edin.

Sonuçlar

Burada tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonunu gösteriyoruz. İntravasküler enjeksiyonun şematik bir süreci Şekil 1'de gösterilmiştir; Çalışmamızda, enjeksiyonu test etmek ve doğrulamak için çeşitli eksojen çözümler kullandık.

Enjekte edilen materyalleri daha iyi görselleştirmek için, Tripan Mavisi (% 0.4) embriyoya izleyici olarak enjekte edildi. İzleyicinin (mavi) dorsal aort veya kafa enjeksiyonu ile kan dolaş...

Tartışmalar

Tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonu yöntemi, embriyoya aktarılacak eksojen materyaller (vektör, viral veya PGC'ler) için optimize edilmiştir. Bu yönteme dayanarak, kararlı gen aşırı ekspresyonu veya girişimi (SpinZ, JUN, UBE2I, vb.) ^17,18,19. Bu köklü modeller bu yaklaşımın fizibilitesini kanıtlamaktadır. Ek olarak, izole PGC'leri sadece alıcının embriyo gonadına transfer etmek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorescence macro-microscope	OLYMPUS	MVX10
Glass Capillaries	Narishige	G1
Lipofectamine 2000	Invitrogen	12566014	liposome
pEGFP-N1 vector	Clontech	#6085-1
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit	Sigma	PKH26GL
pLVX-EGFP lentivirus vector	Addgene	128652
Pneumatic Microinjector	Narishige	IM-11-2
Puller	Narishige	PC-100
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061